Diese Arbeit wurde zum Teil am Center for Nanoscale Systems (ZNS), ein Mitglied der National Nanotechnology Infrastructure Network (NNIN), die von der National Science Foundation unter NSF Award nicht unterstützt wird durchgeführt. ECS-0335765. CNS ist Teil der Harvard University.

Das Protokoll ausgerichtet funktionelle Myokardgewebe erzeugen kann in drei Hauptteile aufgeteilt werden. Die Herstellung der mikrostrukturierten Master mit weichen Lithographie-Techniken wird nicht als Teil der folgenden Protokoll, sondern kann auf der Basis etablierte Methode 6 vorgenommen werden. Ein. Mikrokontaktdrucken von Fibronektin auf PDMS Substrate <ol><li> Mix Sylgard 184 (Dow Corning) PDMS Elastomer einem 10:1-Basis zu Härter-Verhältnis und Degas die Montage mit einem Exsikkator, um Luftblasen zu beseitigen. </li><li> Härten PDMS mit einer zuvor hergestellten Master mit 20 um Breite und 2 um hohen Grate, durch Abstand 20 um entweder für 2 Tage bei Raumtemperatur oder 4 Std. bei 65 ° C bis mikrotexturierte PDMS-Stempel erhalten getrennt. </li></ol> * Aushärtung in einem Exsikkator wird dringend empfohlen, um mögliche Luftblasen zu beseitigen. <ol start="3"><li> Spin Mantel PDMS auf Glasdeckgläschen (zB22x22 mm) bei 5000 rpm für 2 min unter Verwendung eines Spin-Coater auf Headway dünne und gleichmäßige PDMS Substrate von 15 um Dicke herzustellen. </li><li> Reinigen Sie Briefmarken mit 70% Ethanol, um Staub und Schmutz zu entfernen. Lassen Sie sie an der Luft trocknen. </li></ol> * Briefmarken mehrmals verwendet werden kann, jedoch wird zur Verlängerung PDMS-Stempel auf einer regelmäßigen Basis zu empfehlen, da eine Oberfläche Abrieb über die Zeit. <ol start="5"><li> Ort Briefmarken in einem SPI Plasma-Prep II Plasma Reiniger und Verfahren für 1 min bei 275 mTorr zu machen PDMS Oberflächen hydrophil. </li></ol> * Oxygen Plasma-Behandlung beobachtet werden sollte. Längere Behandlungszeiten in Cracken des Elastomers führt. <ol start="6"><li> Sterilisieren Briefmarken mit 70% Ethanol für 1 min. Trocknen schnell mit Druckluft. </li></ol> * Weitere Schritte sollten in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um die Sterilität zu erhalten. <ol start="7"><li> Titelbild Stempel Oberflächen mit Fibronectin-Lösung (50 g / ml in ddH 2 O). Let it adsorbieren mindestens 10 min. </li><li> Abzuschütteln Fibronectin-Lösung von Briefmarken und trocknen schnell mit Druckluft. </li><li> Stellen konformen Kontakt zwischen Stempel und PDMS Substrate für 2 min und fest andrücken. </li><li> Spülen mikrostrukturierten Substraten mit ddH 2 O. Lagern Sie sie in ddH 2 O für maximal 2 Wochen bei 4 ° C, es sei denn zunächst verwendet. Shop PDMS-Stempel in ddH 2 O. </li></ol> 2. Wartung von doppelt transgenen embryonalen Stammzelllinien Zuerst bereiten Sie die folgenden Medien zur Kultivierung von Maus-ES-Zellen: Maus embryonale Fibroblasten (MEF)-Medium: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 10% Fetal Bovine Serum (FBS) ES-Zell-Differenzierung oder-grade, 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) Embryonale Stammzellen (ESC)-Medium: DMEM, 15% FBS ES-Zell-grade,1% Non-Essential Amino Acids (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% Leukämiehemmfaktor (LIF), 0,0007% 2-Mercaptoethanol (2-ME) <ol><li> Coat 6-well Platten mit steriler 0,1% Gelatine in ddH 2 O und lassen Sie es adsorbieren 15 min bei 37 ° C. </li><li> Hinzufügen von einem MEFs aufgetaut Aliquot auf 50 ml PBS in einem konischen Rohr und zentrifugieren bei 1.000 UpM für 5 min. Resuspendieren MEFs in MEF-Medium. </li><li> Nach der Adsorption absaugen überschüssige Gelatine und Add MEFs in die Vertiefungen. Lassen MEFs 1 Tag zu befestigen. </li></ol> * Ein Aliquot von 10 Millionen MEFs genügt für 3 6-Well-Platten. <ol start="4"><li> Wenn MEFs angelagert haben, addieren ES-Zellen aus einem aufgetauten Aliquot auf 50 ml PBS in einem konischen Rohr und zentrifugieren bei 1.000 UpM für 5 min. Resuspendieren ES-Zellen in ESC-Medium und fügen Sie sie in die Vertiefungen mit MEFs. Kultur ES-Zellen in ESC-Medium bis zur Konfluenz erreicht ist. </li></ol> * Sobald ES Zellen Konfluenz erreicht, wird die Passage requIRED zur Überwucherung zu vermeiden und ES-Zell-Kolonien zu erhalten. <ol start="5"><li> Planen ES-Zellen zur Passagierung. Aspirate ESC-Medium und waschen Sie einmal mit sterilem PBS. </li><li> Absaugen PBS und 500 ul Trypsin. Prozess 3,5 min bei 37 ° C. </li><li> Pipettieren Sie die Trypsin-Lösung nach oben und unten mehrere Male zu brechen ES-Zell-Kolonien und neutralisieren mit 500 ul ESC-Medium. </li><li> Passage ES-Zellen nach Ihren gewünschten Verhältnis, zB Übertragung 33 ul zu einem anderen auch mit zuvor MEFs, um den Durchgang 1/30 vorbereitet. Pflegen ES-Zellen in ESC-Medium. </li></ol> * Eine Passage Verhältnis von 1/30 erlaubt ES-Zellen bis zur Konfluenz in 3 Tagen erreichen. Passage ES-Zellen nach Ihren in vitro Differenzierung Zeitplan. 3. In vitro Differenzierung von doppelt transgenen embryonalen Stammzelllinien und Isolation und Seeding of Cardiac Vorläufer Zuerst bereiten die following Medien für die in vitro Differenzierung von ES-Zellen erforderlich: Adaptionsverstärkende Medium: Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), 15% FBS ES-Zell-Grade, 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% 2-ME Differenzierungs-Medium: IMDM, 15% FBS Differenzierungs-Klasse. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% von 0,1 M Ascorbinsäure, 0,0007% 2-ME <ol><li> Starten Sie in-vitro-Differenzierung, wenn ES Zellen Konfluenz erreicht haben. Coat 10 cm Kulturschalen mit steriler 0,1% Gelatine in ddH 2 O und lassen Sie es adsorbieren 15 min bei 37 ° C. </li></ol> * Seien Sie sich bewusst von der Dauer der in vitro Differenzierung. Es dauert 8 Tage bis kardiale Vorläuferzellen isoliert werden können. Planen Sie Ihre Experimente entsprechend. <ol start="2"><li> Ernte ES-Zellen wie zuvor. Nach der Adsorption absaugen überschüssige Gelatine und fügen etwa 1/3-1/2 der ES Zellsuspension angesetzte KulturSchalen mit Adaptation-Medium. Kulturzellen für 2 Tage. </li></ol> * Wählen Sie den Betrag von ES-Zellen für die Anpassung nach Ihren Experimenten. <ol start="3"><li> Ernte angepaßt ES-Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen mit PBS unter Verwendung von 1. 5 ml Trypsin. Zentrifuge dissoziierten ES-Zellen bei 1.000 UpM für 5 min und resuspendiert in ihnen Differenzierungs-Medium. </li><li> Machen Embryoidkörpern (EVG) von ca. 1.000 Zellen pro 10 ul Tropfen in 15 cm Kulturschalen mit einem Multi-Kanal-Pipette. Umkehren der Platten und Kultur EBs als hängende Tropfen für 2,5 Tage bei 37 ° C. </li><li> Nach 2,5 Tage, Pool EBs von 6-8 15 cm Kulturschalen in einem mit Differenzierungs-Medium und Kultur sie für weitere 3,5 Tage bei 37 ° C. </li><li> Nach 3,5 Tagen sammeln EBs in einem konischen 50 ml Tube und ließ sie auf den Boden für ca. 5 min zu versenken. Saugen Sie den Überstand und waschen EBs mit sterilem PBS. Lassen EBs wieder zu Boden sinken für ca.oximately 5 min. </li><li> Distanzieren EBs durch die Bearbeitung mit 2. 5 ml Trypsin für 2 min in einem Wasserbad bei 37 ° C schüttelt die Röhre sanft. Dann fügen Sie 2. 5 ml sterilem PBS auf die Trypsin-Lösung und und Abpipettieren mit einer 10 ml serologische Pipette ca. 8-10 mal zu brechen Zellhaufen. Neutralisieren Trypsin mit 10 ml FACS-Puffer, enthaltend 7,5% FBS ES-Zell-Differenzierung oder-grade und 0,01% DAPI in PBS. </li><li> Zentrifuge dissoziierten EBs bei 1.000 UpM für 5 min und resuspendiert sie in etwa 1 ml FACS-Puffer. Und Abpipettieren mit einer 1 ml Pipette ca. 8-10 mal zu brechen Zellhaufen. </li></ol> * In FACS-Puffer nach dem geschätzten Betrag von dissoziierten EBs. Zu hoch konzentriert Zellen können während der FACS verstopfen und zu niedrig konzentrierten Zellen FACS unnötig Zeit zu verlängern. <ol start="9"><li> Übertragen Zellen in ein steriles Rundboden-Röhrchen mit einer 35 um Zellsieb zu erhalteneine einzelne Zellsuspension. </li><li> Sortieren differenzierten ES-Zellen mit einem FACSAria Durchflusszytometer und erhalten gereinigte Populationen von CVP. </li></ol> * Wir entwickelten einen mehrstufigen Strategie zur Gating hochgereinigten gefärbten Zellen zu isolieren. Kurz, wir erste Tor auf Forward Scatter Amplitude (FSC-A) und Side Scatter Amplitude (SSC-A) (Abbildung 1A). Dies ermöglicht es uns, ganze Zellen von Zelltrümmern zu trennen. Wir haben dann Tor auf FSC-A und Forward Scatter-Breite (FSC-W) (Abbildung 1B). Dies ermöglicht uns, Zelle Singuletts von Dubletten und andere zelluläre Aggregate zu isolieren. Wir haben dann Tor auf SSC-A und Side Scatter-Breite (SSC-W) (1C). Dies erhöht die Reinheit der Zelle Singuletts. Wir haben dann am Gate DAPI Anfärben zu lebensfähigen Zellen (DAPI-negativ) von nicht lebensfähigen Zellen (1D) zu isolieren. Wir haben dann am Gate Phycoeryhthrin Amplitude (PE-A) und PE-Cyanin Farbstoff 7 Amplitude (PE-Cy7-A) auf true rot-positiven (+ R zu erhalten </sup&gt;) und echten roten negativ (R -)-Zellen und autofluoreszierenden rot-negativen Zellen (1E) auszuschließen. R + und R - Zellen werden dann gated separat auf Fluoresceinisothiocyanat Amplitude (FITC-A) und PE-A true green-positive (G +) und true green-negative (G -) sortieren Zellen innerhalb dieser Populationen (1F + 1G). Dies führt zu vier Populationen von Zellen wie folgt: R + G +, R + G -, R - G + und R - G - (Abbildung 1 H). <ol start="11"><li> Passivieren mikrostrukturierten Substrate mit 1% Pluronic F-127 in ddH 2 O für 10 min. Dann waschen Sie sie 3x mit sterilem PBS. </li></ol> * Pluronic F-127 ist ein Tensid, dass Blöcke Zelladhäsion. Es unterstützt Einschluss der Zelladhäsion an mikrostrukturierten Bereich. <ol start="12"><li> Bringen PDMS Dichtungen rund um die gemusterten Bereichund fest andrücken. Dann, Saatgut CVP auf Fibronectin mikrostrukturierten Substraten. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In diesem Protokoll stellten wir ein Verfahren, um gereinigte Populationen von kardiogenen Vorläuferzellen zu isolieren und sie auf Saatgut mikrostrukturierten Substrate Fibronectin was ermöglicht sie auszurichten und einen Kardiomyozyten-ähnliche Stabform. Normale zelluläre Organisation ist kritisch für normales Gewebe Funktion 8,10, insbesondere zum Myokardgewebe. Herzmuskelzellen Es wurde gezeigt, verbesserte mechanische 11,12 und 11,13 elektrophysiologischen Eigenschaften zu ent...

Trotz der jüngsten Fortschritte in der medizinischen Therapie, bleibt fortgeschrittener Herzinsuffizienz eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der entwickelten Welt. Das klinische Syndrom ergibt sich aus einem Verlust von funktionalen Herzmuskelgewebe und anschließend die Unfähigkeit des versagenden Herzens, um die metabolischen Anforderungen der Betroffenen gerecht zu werden. Da das Herz hat eine begrenzte Regenerationsfähigkeit ist autologen Herztransplantation die einzige aktuelle klinisch anerkannte Therapie direkt am Auffüllen verloren funktionale Herzgewebe ab. Signifikante Nachteile der Herztransplantation, einschließlich einer begrenzten Anzahl von Spenderherzen und die Notwendigkeit für eine langfristige Immunsuppressionstherapie, schließt die weit verbreitete Verwendung dieser Therapie. Als Ergebnis hat die medizinische Therapie die Hauptstütze der Behandlung von Patienten mit Herzerkrankungen. Eine große Herausforderung in der Arzneimittelentwicklung ist die Identifizierung von zellulären Assays, die genau rekapitulieren normalen und erkrankten Myokards Physiologie in vitro. <html> Die jüngste Annäherung der Stammzellbiologie und Tissue Engineering Technologie wirft neue, viel versprechende Wege zur kardialen Regeneration. Erzeugung funktioneller Myokardgewebe aus erneuerbaren Patienten-spezifische Quelle wäre ein großer Fortschritt auf dem Gebiet sein. Dies würde bei der Entwicklung der Krankheit spezifische zelluläre Assays zur Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln ermöglichen und die Grundlage für kardiale Regenerationsmedizin lag. Menschliche embryonale Stammzellen (ES-Zellen) und mehr deutlich, menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) stellen eine potenziell erneuerbaren Patienten-spezifischen Quelle der ventrikulären Vorläuferzellen und reife ventrikulären Myozyten. Die Kombination von Stammzellbiologie und Tissue Engineering Strategien löst dieses Problem durch Erzeugen funktionelle Herzgewebe in vitro, die in der Entwicklung von zellulären Assays für die Wirkstoffentwicklung oder in kardialen regenerativen Ansätzen zur Behandlung fortgeschrittener Herzinsuffizienz verwendet werden können. _CONTENT &quot;&gt; Eine zentrale Herausforderung kardiale Regeneration ist seit der Identifizierung einer optimalen Zelltyp. Eine Vielzahl von Zellen wurden 1 untersucht jedoch bisher, obwohl verschiedene multipotenten Vorläufern kardiogenen aus verschiedenen Quellen haben entdeckt worden, die eine Identifizierung einer Zelle Quelle, die kritischen Anforderungen wie Einsatz für die myogenen Zellschicksals erfüllt hat Erhaltung der Kapazität, um in vivo oder in vitro und Zusammensetzung an eine funktionelle Myokardgewebe erweitern sich als zentrales Problem 2 sein. Wir haben zuvor eine doppelt transgenen Maus beschriebene System das ermöglicht die Isolierung von hoch gereinigten Populationen von Vorläuferzellen engagierten ventrikulären (CVP) aus ES-Zellen differenzierenden in vitro. Wir erzeugten eine neuartige doppelt transgenen Maus, die den roten fluoreszierenden Proteins DsRed exprimiert unter der Kontrolle eines ISL1-abhängigen Enhancer des Gens und MEF2C das verstärkt grün fluoreszierende Protein unter der Kontrolledie herz-spezifische Nkx2.5 Enhancer. Basierend auf dieser zweifarbige Fluoreszenz-Reporter-Systems, einen ersten und zweiten in das Herz Feld Vorläuferzellen aus Entwicklungs-ES-Zellen kann mittels Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) nach ihrer Expression MEF2C und Nkx2.5 Gene isoliert werden. CVP ähneln Herzmuskelzellen auf den Expressionsmuster der myokardialen Marker und strukturellen und funktionellen Eigenschaften 3, was sehr vielversprechend für Herzgewebe regenerative Zwecke bietet basiert. Zwar gab es viele Fortschritte auf dem Gebiet des Tissue Engineering, imitiert nativen zellulären Architektur bleibt eine zentrale Herausforderung. Herkömmliche Methoden zur Bewältigung dieser Herausforderung sind Aussaat biologischen oder synthetischen Gerüsten mit Zellen in vitro. Aufgrund einer Reihe von Nachteilen von Gerüsten, einschließlich schnellen Abbau, begrenzte physikalische und mechanische Stabilität und geringe Zelldichte 1,4,5, haben wir versucht, Gerüst-weniger Gewebe zu konstruieren. Although Herzzellen ihre lokalen Mikroumgebung durch die Sekretion von extrazellulären Matrix-Proteinen verändern, haben sie eine weitere begrenzte Kapazität haben, um stabförmigen kardialen Myozyten in Abwesenheit von extrazelluläre Signale anzuordnen. Somit wird eine Vorlage, die Zellen und biologische entsprechenden räumlichen Hinweise auf funktionelle Myokardgewebe komponieren bietet erforderlich. Mikrokontaktdrucken dieser Herausforderung durch die Bereitstellung eines einfachen und kostengünstigen Technik zur präzisen Steuerung Zellform, Organisation und Funktion 6-8, die alle entscheidend für die Erzeugung von funktionellen Myokardgewebe ausgerichtet sind. Es umfasst die Verwendung von mikrotexturierte Polydimethylsiloxan (PDMS) Stempel mit Strukturgrößen im Bereich bis zu 2 um 9, die die Ablagerung von Proteinen der extrazellulären Matrix auf PDMS Substrate präzise Muster ermöglichen und damit zu Zelladhäsion räumlich beeinflussen. Hier schlagen wir vor, Gewebe Bioengineering-Technologie mit Stiel cel kombinierenl Biologie zu generieren anisotropen funktionale Herzmuskelgewebe. Dementsprechend wir hier zeigen unsere kürzlich veröffentlichten Ansatz für die folgenden: (1) die Erzeugung von mikrostrukturierten Oberflächen-Protein auf PDMS Substraten durch Mikrokontaktdrucken zur Erzeugung einer Schablone für ausgerichteten Herzmuskelgewebe, (2) die Isolierung hochreiner kardialen Vorläuferzellen aus ES-Zellen in vitro Differenzierung und (3) die Kombination der beiden Techniken zur Erzeugung von funktionellen Myokardgewebe ausgerichtet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Bezeichnung des Gutes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> L-Ascorbinsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> Bereiten 0,1 M Lösung in ddH2O </td></tr><tr><td> Exsikkator, Vacuum 10 Zoll </td><td> Nova-Tech International, Inc. </td><td> 55206 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochloride (DAPI) </td><td> Life Technologies </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos Modified Eagle Medium </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30022.01 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria II Durchflusszytometer </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fötales RinderserumES-Zell-grade </td><td> Gemini Bio-Produkte </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum Differentiation-grade </td><td> Gemini Bio-Produkte </td><td> 100-500 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronektin aus Rinderplasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F4759 </td><td> Solubilisieren bis 1 mg / ml in ddH 2 O </td></tr><tr><td> Fisherfinest Premium Cover Glas 22x22mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Gelatine aus Schweinehaut </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> Bereiten 0,1% ige Lösung in ddH2O </td></tr><tr><td> Headway Spin Coater </td><td> Headway Research, Inc. </td><td> PWM32-PS-CB15 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30228.01 </td><td></td></tr><tr><td> Leukämiehemmfaktor </td><td> SelbstVon LIF-sezernierenden Zelllinien vorbereitet </td><td></td><td> Bereiten 500x Stammlösung </td></tr><tr><td> MEM Non-Essential Amino Acids </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Embryonale Maus-Fibroblasten </td><td> Geerntet von Tag 12-15 Maus-Embryonen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2443 </td><td> Bereiten 1% ige Lösung in ddH2O </td></tr><tr><td> Hin-und Bottom Tube mit 35 &amp;mgr; Zellsieb </td><td> BD Biosciences </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> SPI Plasma-Prep II Plasma Reiniger </td><td> SPI Supplies </td><td> 11005-AB </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard184 Silikon-Elastomer Kit </td><td> Dow Corning </td><td> 184 SIL ELAST KIT 0.5KG </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuummeter </td><td> SPI Supplies </td><td> 11.019-AB </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing

Fortgeschrittener Herzinsuffizienz stellt eine große Herausforderung unerfüllten klinischen, die aus dem Verlust von lebensfähigen und / oder voll funktionsfähige Herzmuskelzellen. Trotz optimaler medikamentöser Therapie stellt Herzinsuffizienz eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der entwickelten Welt. Eine große Herausforderung in der Arzneimittelentwicklung ist die Identifizierung von zellulären Assays, die genau rekapitulieren normalen und erkrankten menschlichen Physiologie myokardialen in vitro. Ebenso sind die großen Herausforderungen in der regenerativen Biologie kardialer um die Identifizierung und Isolierung von Patienten-spezifischen kardialen Vorläuferzellen in klinisch relevanten Mengen zu drehen. Diese Zellen haben, um dann in funktionelle Gewebe, das die native Herzgewebe Architektur. Mikrokontaktdruck ermöglicht die Erstellung von präzisen mikrostrukturierten Protein Formen, die strukturelle Organisation des Herzens ähneln ähnelt montiert werden, wodurch geometrische Hinweise auf Zelladhäsion räumlich steuern. Hierinbeschreiben wir unserem Ansatz zur Isolierung von hochreinem Herzmuskelzellen aus pluripotenten Stammzellen in vitro Differenzierung, die Erzeugung von Zellwachstum Oberflächen mit Proteinen der extrazellulären Matrix mit Mikrostruktur und die Montage der Stammzellen abgeleiteten Herzmuskelzellen in anisotropen Myokardgewebe.

FACS-Reinigung von in vitro differenzierten ES-Zellen zeigten vier verschiedene Populationen von Vorläuferzellen (Abbildung 1). Die Anwesenheit von mikrostrukturierten Fibronectin wurde durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie, die eine vollständige Übertragung der kontinuierlichen Linien Fibronectin (Abbildung 2) bestätigt angezeigt. Plating der FACS-isolierten Vorläuferzellen auf Fibronektin Mikrostrukturen führte Ausrichtung der R + G + und ein Teil der...

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Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Die Erzeugung von ausgerichteten Myokardgewebe ist eine wesentliche Voraussetzung für die Anpassung der jüngsten Fortschritte in der Stammzellbiologie, um klinisch nützliche Zwecke. Hier beschreiben wir einen Mikrokontaktdruck Ansatz für die präzise Steuerung der Zelle Form und Funktion. Mit hoch gereinigte Populationen von embryonalen Stammzellen abgeleitete kardiale Vorläuferzellen, wir erzeugen dann anisotropen funktionale Herzmuskelgewebe.

Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

generation-aligned-functional-myocardial-tissue-through-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. Die Erzeugung von ausgerichteten Myokardgewebe ist eine wesentliche Voraussetzung für die Anpassung der jüngsten Fortschritte in der Stammzellbiologie, um klinisch nützliche Zwecke. Hier beschreiben wir einen Mikrokontaktdruck Ansatz für die präzise Steuerung der Zelle Form und Funktion. Mit hoch gereinigte Populationen von embryonalen Stammzellen abgeleitete kardiale Vorläuferzellen, wir erzeugen dann anisotropen funktionale Herzmuskelgewebe.

Serie: Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Herstellung von biologisch abgeleiteten Injizierbare Materialien für Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Forschung

Biotechnik

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Herstellung von komplexen Kultursubstrate verwenden Robotic Mikrokontaktdrucken (R-mCP) und Sequential Nucleophile Substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Core/Shell DruckGerüste für Tissue Engineering von Röhrenstrukturen

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the context of liver diseases, 3-dimensional (3D) models based on cholangiocytes have emerged such as cysts, spheroids, or tube-like structures to mimic tissue topology for organogenesis, disease modeling, and drug screening studies. These structures have been mainly obtained by embedding cholangiocytes in a hydrogel. The main purpose was to study self-organization by addressing epithelial polarity, functional, and morphological properties. However, very few studies focus on cyst formation efficiency. When this is the case, the efficiency is often quantified from images of a single plane. Functional assays and structural analysis are performed without representing the potential heterogeneity of cyst distribution arising from hydrogel polymerization heterogeneities and side effects. Therefore, the quantitative analysis, when done, cannot be used for comparison from one article to another. Moreover, this methodology does not allow comparisons of 3D growth potential of different matrices and cell types. Additionally, there is no mention of the experimental troubleshooting for immunostaining cysts. In this article, we provide a reliable and universal method to show that the initial cell distribution is related to the heterogeneous vertical distribution of cyst formation. Cholangiocyte cells embedded in hydrogel are followed with Z-stacks analysis along the hydrogel depth over the time course of 10 days. With this method, a robust kinetics of cyst formation efficiency and growth is obtained. We also present methods to evaluate cyst polarity and secretory function. Finally, additional tips for optimizing immunostaining protocols are provided in order to limit cyst collapse for imaging. This approach can be applied to other 3D cell culture studies, thus opening the possibilities to compare one system to another.

Three-dimensional (3D) cellular systems are relevant models for investigating organogenesis. A hydrogel-based method for biliary cysts production and their characterization is proposed. This protocol unravels the barriers of 3D characterization, with a straightforward and reliable method to assess cyst formation efficiency, sizes, and to test their functionality.

Generierung und quantitative Charakterisierung funktioneller und polarisierter Gallenepithelzysten

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...