Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair

Dieses Protokoll beschreibt eine edle und einfache Methode zur Herstellung von netzförmigen, aus menschlichen induzierten Körperteilen und von Stammzellen abgeleiteten Herzzellen hergestellten Herzgeweben. Die Flexibilität der Gewebegeometrie und die Skalierbarkeit der konservierten Gewebefunktion sind die Hauptvorteile dieser Technik. Die implantierten Netzform-ECTs können eine Herzstruktur und Funktion in einem Myokardinfarktmodell der Ratte wiederherstellen.

Bestätigung seiner Machbarkeit für den Einsatz in der kardialen regenerativen Therapie. Diese Techniken erfordern reproduzierbare menschliche STAMMzellverarbeitung und die Gewebekultur-Fähigkeiten für konsistente Ergebnisse. Beginnen Sie mit dem Schneiden eines ausgehärteten PDMS-Blechs auf die entsprechende Größe, damit das Blech mit Silikonkleber verklebt werden kann, um eine 21 mal 20,5 Millimeter rechteckige Schale mit sieben Millimeter nlänge mundgerechtem und 2,5 Millimeter hohen rechteckigen Pfosten in gestaffelten Positionen herzustellen.

Der horizontale Abstand zwischen zwei Pfostenlinien sollte 2,5 Millimeter betragen. Autoclavieren Sie das Fach bei 120 Grad Celsius für 20 Minuten, bevor Sie die Form mit 1%Poloxamer 407 in PBS für eine Stunde beschichten. Dann die Form gründlich mit PBS abspülen und die Form in einen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte legen.

Für die Linienanalyse kombinieren Sie die Zellen aus den Kardiomyozyten plus endotheliale und vaskuläre Wandzellenprotokolle. Damit die endliche Konzentration von Wandzellen 10 bis 20% bei einer Gesamtzellzahl von sechs mal 10 zu den sechs Zellen pro Konstrukt beträgt. Mischen Sie 133 Mikroliter Säure löslich Ratte Schwanz Kollagen Typ eine Lösung und 17 Mikroliter Alkali Puffer zu 17 Mikroliter von 10X Minimum Essential Medium auf Eis.

Dann 67 Mikroliter Basement Membrane Matrix in die Kollagenlösung geben. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen und setzen Sie das Pellet in 167 Mikroliter n.V. des minimalen Essential Mediums von High Glucose Dulbecco wieder aus, das mit fetalem Rinderserum und Antibiotika ergänzt wird. Mischen Sie die Zellen auf der Matrixlösung auf Eis.

Dann gießen Sie vorsichtig 400 Mikroliter der Zellmatrixsuspension auf die Poloxamer 407 beschichtete PDMS-Gewebeform. Inkubieren Sie das Zellmatrixgemisch in einem Standard-Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 60 Minuten. Wenn sich das Gewebe gebildet hat, tränken Sie die Form vorsichtig mit vier Milliliterect-Kulturmedium und geben Sie die Platte für 14 Tage an den Zellkultur-Inkubator zurück.

Vor der ECT-Implantation sterilisierten Sie Feinzangen, um den ECT vorsichtig von den Ladepfosten zu entfernen. Gewebeformen können mit verschiedenen Mustern, Pfostenlängen und Pfostenabständen hergestellt werden, um verschiedene endgültige ECT-Geometrien zu erzeugen. Für diese Analyse wurde eine Form mit sieben Millimeter langen Pfosten mit 2,5 Millimeter breiten Intervallen verwendet.

Poloxamer 407 verhindert die Haftung der Zellen an der Form und ermöglicht die Bildung einer charakteristischen Netzstruktur nach schneller Gelverdichtung in 14 Tagen. Die Struktur wird auch nach dem Freiwerden des ECT aus der Form erhalten. Das gefertigte Gewebekonstrukt ist etwa 1,5 Zentimeter breit und 0,5 Millimeter dick.

Und die Breite jedes Bündels im Netz beträgt im Durchschnitt etwa 0,5 Millimeter. Es ist möglich, ein 3 Zentimeter großes Netz ECT mit 24 Millionen Zellen aus einer viermal größeren Form mit dem gleichen gestaffelten Post-Design zu erzeugen. Diese größere Netz-ECT kann auch leicht aus der Form entfernt werden und erzeugt einen lokalen Kraftakt, der dem kleineren Netz-ECT entspricht.

Es ist wichtig, die Zellmatrixmischung gleichmäßig in die Gewebeform zu gießen, ohne Blasen zu erzeugen, um Gefühlsfehler im endlichen Gel zu verhindern. Funktionale Charakterisierung des Auftragnehmers. und vierte Frequenzbeziehungen können mit eingebauten Systemen durchgeführt werden.

Unser oberstes Ziel ist die Umsetzung von ECT-Paradigmen in klinische Therapien, die große präklinische Studien von Tieren nutzen.