, Ein New Researcher Award vom Thrasher Research Fund, und Beiträge an die Reizleitung Fund an der Kinderklinik Boston; Diese Arbeit wird durch Forschungsmittel von den National Institutes of Health (HL088206 HL068915) unterstützt.

Teil 1: Montieren Sie bauen Gussformen <ol><li> Verwenden Sie eine Rasierklinge Silikonschlauch (VWR) zu halbieren und schneiden Sie es in 3 cm lange Stücke schneiden. </li><li> Geben Sie einen Tropfen von Implantat-grade RTV Silikonkleber (Rhodia) auf der Innenseite von jedem Ende des Schlauchs. </li><li> Schnell Ort ein kleines Stück (1 cm x 1 cm) von Polyester-Mesh (McMaster-Carr) auf dem Silikonkleber drop und richten Sie sie mit dem Ende des Schlauchs. Dies wird eine leicht erhöhte und ebene Fläche für Bau Anhang. Wiederholen Sie für das andere Ende. </li><li> Lassen Sie die Form bei Raumtemperatur für 3 Tage trocknen lassen. Es ist hilfreich, 20 bis 30 Formen in einer Zeit zu machen, da diese im Wesentlichen zu entsorgen sind. </li><li> Sobald der Kleber vollständig trocken ist, speichern diese Formen in ein Becherglas mit 70% Ethanol gefüllt, bis sie gebraucht werden. Dieser Schritt wird dazu beitragen, sterilisieren die Formen und das fertige Produkt wird in Abbildung 1 dargestellt. </li></ol> Teil 2: Vorbereitung für die Myoblasten Zellisolation <ol><li> Verdünnen Sie 1 mg Laminin (Sigma) in 250 ml 0,22 um Filter-sterilisierte Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit 1% Penicillin / Streptomycin (Invitrogen) und 1% Fungizone (Invitrogen). </li><li> Coat 150 mm Zellkulturplatten (BD Falcon) mit 4 ml der verdünnten Laminin-Lösung aus Schritt 1,1 und bei 37 º C für mindestens 4 Stunden vor dem Ausplattieren der primären Skelettmyoblasten. </li><li> Machen Sie den Myoblasten Medium durch Mischen Hams F-10 Nutrient Mixture (Sigma) mit 20% FBS (Atlanta Biologicals), 5 ng / L basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Promega), 1% Penicillin / Streptomycin (Invitrogen) und 1% Fungizone ( Invitrogen). </li><li> Bereiten Sie die Skelettmuskulatur Verdauung durch Auflösen von 1 g ~ 295 U / mg Collagenase 2 (Worthington) in 100 ml 2,4 U / ml Dispase-2 (Roche). Add 0,037 g CaCl 2 und gut mischen. Filter sterilisieren die Verdauung Puffer durch einen 0,2 um Filter Festplatte auf eine 10 ml Spritze und speichern Aliquots bei -20 ° C eingebaut Setzen Sie den Betrag für die Gewebe-Verdau bei 37 ° C zusammen mit den Myoblasten Medien benötigt. </li></ol> Teil 3: Myoblasten isoliert von der Skelettmuskulatur <ol><li> Mit einer Pinzette und eine kleine Schere, zu entfernen paraspinalen Muskeln von toten Neugeborenen Lewis Ratten durch Aufschneiden den Rücken hinunter entlang des Rückenmarks, Abziehen der Haut und Faszie Schichten und dann Ausschneiden der Muskeln. </li><li> In einer Gewebekultur Kapuze, platzieren Sie den ausgeschnittenen Muskeln in einem 50 ml konischen Röhrchen (BD Falcon) mit 40 ml 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Invitrogen) auf Eis gefüllt. Lassen Sie den Muskel-Streifen auf den Boden des Röhrchens absetzen und entfernen Sie vorsichtig die meisten der Flüssigkeit und Blut Überreste von Vakuumsauger mit einer sterilen Pasteurpipette in eine Kultur Haube (Baker). </li><li> Gießen Sie die geernteten Muskel Stücke auf einer 150 mm Kulturschale und entfernen Sie so viel von der restlichen Flüssigkeit wie möglich abgesaugt. Mit 2 einseitig geschliffene Klingen zerkleinern das Gewebe zu einer dicken Paste. Gießen vorgewärmten Verdauung Lösung auf der Paste und die Masse in eine frische 50 ml Tube mit einem 10-ml-Pipette. Während der enzymatischen Verdauung, wird das Gewebe gelegentlich verrieben (ohne Blasenbildung) mit einer 10 mL Pipette auf ein schnurloses Pipette-Aid (Drummond) ausgestattet. Auch hier ermöglichen das Gewebe ansiedeln und entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit. </li><li> Das Röhrchen auf einem Schaukelstuhl Plattform und verdauen bei 37 º C für ca. 30 min. </li><li> Sobald der Muskel wird verflüssigt, übergeben Sie die Lösung durch einen 70 um Zellsieb (BD Falcon) und Zentrifuge bei Raumtemperatur für 10 min bei 600 xg (Beckman GP). Mit einer Pasteurpipette und Absaugung, entfernen Sie so viel von der Flüssigkeit wie möglich und das Pellet mit 10 ml warmem Myoblasten Medium. </li><li> Pre-Platte die Zellen auf einer unbeschichteten 150 mm Gewebekulturplatte für 15 Minuten zur Beseitigung von Fibroblasten. </li><li> Übertragen Sie die Zellen, die noch nicht auf die Laminin-beschichtete cultureware befestigt und verdünnen, so dass es eine Platte für jede von 1 bis 2 Rattenbabys. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator eingestellt bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> Teil 4: Casting gezüchteten Gewebe-Konstrukten (5 mL) <ol><li> Nach 1 bis 2 Tagen, entfernen 10 der 150 mm Myoblasten Zellkulturplatten aus dem Inkubator, spülen Sie sie zweimal mit 37 ° C 1X PBS, und fügen Sie 4 ml warmes 0,05% Trypsin-EDTA auf jeder Platte. Bringen Sie die Platten in den Inkubator für 5 min. </li><li> Ernte der abgelösten Myoblasten aus den Platten in der Kultur Kapuze und sammeln die Flüssigkeit in einer 50 ml Tube (BD Falcon). Verwenden Sie 10 ml Myoblasten mittel-bis alle Platten Spül-und kombinieren diese mit den Zellen in die Zentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen bei Raumtemperatur für 10 min bei 600 xg (Beckman GP) und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit wie in Schritt 3.5 beschrieben. </li><li> Resuspendieren Myoblasten Zellen in 1,6 ml Myoblasten Medium und auf Eis stellen. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig Entfernen 4 konstruieren Formen aus Schritt 1.5 und spülen Sie sie zweimal mit 1X PBS. Vakuum-Sauggreifer aus alle Spuren von PBS mit einer Pasteurpipette, bevor jeder Form in einer 6-well Gewebe culture Platte (BD Falcon). </li><li> Sammeln Sie die anderen Reagenzien für Bau Vorbereitung nötig (10X Hams F10, Antibiotika, Typ-1-Kollagen [3,9 mg / mL] [6] und Matrigel ™) auf Eis und halten Myoblasten bei 37 º C. Kombinieren Sie 500 ul 10x Ham F10, 100 ul Penicillin / Streptomycin, 100 ul Fungizone, 1,6 mL Kollagen, und 750 ul Matrigel ™ in ein konisches 15 ml Tube. Mischen Sie die Lösung für 10 sec mit einem Mini-Vortexer (VWR) auf 10 und auf Eis stellen. </li><li> Anschließend fügen Sie 80 ul von NaHCO 3 und die Myoblasten Suspension aus Schritt 3,3 bis die Mischung aus Schritt 3.5. Vortex die gesamte Mischung für 10 sec und kehren der Röhre in den Eiskübel für ein paar Minuten, um die Lösung von Bläschen klar. </li><li> Vorsichtig warf das Gemisch in die Formen, bevor sie sich verfestigen mit einer 10 ml Pipette beginnt. Jede Form hält ca. 1 mL der viskosen Flüssigkeit. Versuchen Sie zu vermeiden Einführung von Luftblasen während dieses Vorgangs. </li><li> Sorgfältig Übertragung der Teller mit der cast Konstrukte in den Inkubator. Nach ca. 30 min, entfernen Sie die erstarrten Konstrukte aus dem Inkubator und vorsichtig Myoblasten Medium in jede Vertiefung zur Deckung des Gewebes zu konstruieren. Bringen Sie die Platte in den Inkubator (Abbildung 2). </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse Wenn dieses Protokoll korrekt ausgeführt wird, wird die Myoblasten-haltigen Gewebe konstruieren bereit für in vivo-Implantation (dh, wenn aus der Form entfernt) oder für weitere in vitro-Analysen nach 2 Tagen. <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure1.jpg" alt="" /> Abbildung 1. Beispiele für abgeschlossen zu konstruieren Formen (siehe Schritt 1.5). <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure2.jpg" alt="" width="400" height="321" /> Abbildung 2. A verfestigt Myoblasten-haltigen Gewebe konstruieren [1]. <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure3.jpg" alt="" /> Abbildung 3. H &amp; E gefärbten Schnitten eines Myoblasten-haltigen Gewebe zu konstruieren. &quot;A&quot; zeigt einen Längsschnitt und &quot;B&quot; zeigt einen Querschnitt.

<ol>
	<li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Blau, H. M., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+muscle+cells.">Isolation and characterization of human muscle cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).</li><li>Powell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+human+bioartificial+muscles+expressing+a+foreign+recombinant+protein+for+gene+therapy.">Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).</li><li>Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy.">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li><li>Gallop, P. M., Seifter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Properties+of+Soluble+Collagens.">Preparation and Properties of Soluble Collagens.</a> Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses im Kinderkrankenhaus Boston gesetzt durchgeführt.

Die Formen, in denen das Gewebe konstruieren gegossen werden kann in jeder Form und Größe hergestellt werden, allerdings muss es mindestens zwei Befestigungspunkte werden. Ansonsten bilden die Matrix und Zellen eine kugelförmige Struktur und die Zellen sterben. In der vorliegenden Protokoll, beschreiben wir die Verwendung eines Polyester-Mesh für diesen Zweck, aber wir haben auch erfolgreich Edelstahlgewebe verwendet. Offensichtlich werden größere Formen erfordern mehr Zellen und ein größeres Volumen der sonstig...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Silicone tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>60985-724</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone adhesive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rhodia Silicones</td>
<td>MED ADH 4300 RTV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyester Mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>93185T17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L2020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nutrient Mixture F-10 HAM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N6908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Atlanta Biologicals</td>
<td>S11550</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fungizone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15290-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10295825001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington</td>
<td>46H8863</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>G5071</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>150 mm tissue culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.05% (1X) Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1X Hanks Balanced Salt Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14170-112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>7.5% NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25080-094</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mL Conical Vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL Conical Vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352099</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.2 &mu;m filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene</td>
<td>194-2520</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of myogenic engineered tissue constructs

Trotz der Tatsache, dass die elektronische Herzschrittmacher sind lebensrettende medizinische Geräte, deren langfristige Performance bei pädiatrischen Patienten kann problematisch wegen der Einschränkungen durch ein Kind seiner geringen Größe und ihrer unvermeidlichen Wachstum auferlegt werden. Folglich gibt es einen echten Bedarf an innovativen Therapien speziell für pädiatrische Patienten mit Herzrhythmusstörungen entwickelt. Wir schlagen vor, dass eine leitende biologische Alternative, bestehend aus einer Kollagen-basierten Matrix mit autologen-abgeleiteten Zellen könnte besser zum Wachstum anzupassen, reduzieren die Notwendigkeit für wiederkehrende Operationen, und verbessern Sie die Qualität des Lebens für diese Patienten. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Verfahren zur Einbindung primären Skelett Myoblasten Zellkulturen in einem Hydrogel-Matrix der Mode eine chirurgisch-implantierbaren Gewebe zu konstruieren, das als elektrische Leitung zwischen dem oberen und unteren Kammern des Herzens dienen. Letztlich erwarten wir mit dieser Art von gezüchteten Gewebe zu atrioventrikulären elektrische Leitfähigkeit bei Kindern mit komplettem Herzblock wiederherzustellen. In Anbetracht dieser, isolieren wir Myoblasten aus der Skelettmuskulatur von neonatalen Lewis Ratten und Platte sie auf Laminin-beschichtete Gewebe Kulturschalen mit einer modifizierten Version des etablierten Protokollen<sup&gt; [2, 3]</sup&gt;. Nach 1-2 Tagen werden kultivierten Zellen gesammelt und mit Antibiotika versetzt, Typ-1-Kollagen, Matrigel ™ und NaHCO<sub&gt; 3</sub&gt;. Das Ergebnis ist eine zähflüssige, einheitliche Lösung, die in eine Form von nahezu beliebiger Größe und Form gegossen werden kann<sup&gt; [1, 4, 5]</sup&gt;. Für unsere Gewebe Konstrukte beschäftigen wir Typ-1-Kollagen aus fetalen Lamm Haut unter Verwendung von Standardverfahren isoliert<sup&gt; [6]</sup&gt;. Sobald das Gewebe bei 37 ° C verfestigt, Kulturmedien ist sorgfältig auf die Platte gegeben, bis das Konstrukt ist untergetaucht. Die gezüchteten Gewebe wird dann weiter zu verdichten durch Dehydratisierung für 2 weitere Tage erlaubt, an welcher Stelle es reif ist<em&gt; In-vitro-</em&gt; Beurteilung oder chirurgische Implantation.

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Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Hier zeigen wir die Herstellung von Kollagen-basierten, baut Gewebe mit Skelettmyoblasten. Diese 3-D konstruiert Konstrukte verwendet zu ersetzen oder zu reparieren Gewebe werden<em&gt; In vivo</em&gt;. Für unsere Zwecke haben wir diese als AV-elektrische Leitung für die Reparatur von kompletten AV-Block entwickelt<sup&gt; [1]</sup&gt;.

Herstellung von Myogenic Engineered Tissue Konstrukte

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

fabrication-of-myogenic-engineered-tissue-constructs

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Aufrufe.  Children's Hospital Boston and Harvard Medical School. Hier zeigen wir die Herstellung von Kollagen-basierten, baut Gewebe mit Skelettmyoblasten. Diese 3-D konstruiert Konstrukte verwendet zu ersetzen oder zu reparieren Gewebe werden In vivo. Für unsere Zwecke haben wir diese als AV-elektrische Leitung für die Reparatur von kompletten AV-Block entwickelt [1].

Serie: Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS Bauelementherstellung und Oberflächenmodifizierung

Forschung

Biologie

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using polymer/nanoparticle composite microscale lysis and solid phase extraction columns. The recovered samples are concentrated, small volume samples that are PCRable, without any additional cleanup. Here, we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then, we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns. We demonstrate grafting and polymerization of a carbon nanotube/polymer composite column for bacterial cell lysis. We then show the lysis process followed by solid phase extraction of nucleic acids from the sample on chip using a silica/polymer composite column. The attached protocols contain detailed instructions on how to make both lysis and solid phase extraction columns.

Here we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns.

Die Herstellung der thermoplastischen Mikrofluidikkanälen

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Fabrication of Amperometric Electrodes

Carbon fiber electrodes are crucial for the detection of catecholamine release from vesicles in single cells for amperometry measurements.  Here, we describe the techniques needed to generate low noise (&lt;0.5 pA) electrodes.  The techniques have been modified from published descriptions by previous researchers (1,2).  Electrodes are made by preparing carbon fibers and threading them individually into each capillary tube by using a vacuum with a filter to aspirate the fiber.  Next, the capillary tube with fiber is pulled by an electrode puller, creating two halves, each with a fine-pointed tip.  The electrodes are dipped in hot, liquid epoxy mixed with hardener to create an epoxy-glass seal.  Lastly, the electrodes are placed in an oven to cure the epoxy.  Careful handling of the electrodes is critical to ensure that they are made consistently and without damage.  This protocol shows how to fabricate and cut amperometric electrodes for recording from single cells.

This protocol describes how to generate carbon fiber electrodes. The electrodes are subsequently used to detect catecholamine release from vesicles with carbon fiber amperometry.

Herstellung von amperometrische Elektroden

Carbon fiber electrodes are crucial for the detection of catecholamine release from vesicles in single cells for amperometry measurements.  Here, we ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Die Implantation von Engineered Tissue in der Ratte Herz

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombineering homologen Rekombination Konstrukte in<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Herstellung von primären Myogenic Vorläuferzelle / Myoblastenkulturen von Basal Wirbelstammbaum

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Phage-vermittelte Lieferung von Targeted sRNA Konstruiert Down-Gene nach Knock Expression in<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissektion der Auditory Bulla in postnatale Mäuse: Die Isolierung der Gehörknöchelchen und histologische Analyse

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...