Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch die folgenden Institutionen, die National Science Foundation (Grant 0719232), das Department of Energy (Grant DEFG02-01ER15129), der WM Keck Foundation (Grant 041904) und der George Washington University Research Enhancement Fund. Die Autoren sind dankbar für die GeO2-basierte optische Fasern großzügig von Infrarot-Fiber Systems (Silver Spring, MD) sowie für die erste Diskussion über das Protokoll über Glasfaser Radierung von Mark E. Reeves und Joan A. Hoffmann von der George Washington geliefert University. Die Autoren möchten auch Jessica A. Stolee für ihre Hilfe danken während der Videoaufnahmen des Protokolls.

1. Optische Komponenten <ol><li> Laser-Ablation zur Laserablation Elektrospray-Ionisation (LAESI)-Massenspektrometrie (MS) wird durch einen 5 ns Laserpuls bei 2,94 um Wellenlänge erzeugt. Ein abstimmbaren optischen parametrischen Oszillators durch einen Nd getrieben: YAG-Laser (Opolette 100, Opotek Inc., Carlsbad, CA) ist für die Ablation in dieser Studie verwendet. Die Wiederholrate ist zwischen 5 und 100 Hz gewählt. Dies ist eine Klasse IV Laser, der bei direkter Exposition schweren bleibenden Schäden am Auge oder der Haut verursachen können. Die diffuse Reflexion des Laserstrahls kann auch gefährlich für die Haut oder den Augen. Tragen Sie einen geeigneten Laser-Schutzbrille für den Schutz. </li><li> Die optische Faser von Germanium Kohlendioxid-basierte Glas wurde von Infrarot-Fiber Systems, Inc. (Silver Spring, MD) erhalten. Wenn es Hytrel und Polyimid-Beschichtungen auf der Faser folgen Sie den Anweisungen unten, um sie von den Enden entfernen. Hitze 1-Methyl-2-pyrrolidon zu 130-150 ° C in einem Abzug. Tauchen Sie die Faserenden die Sie in dieser Flüssigkeit für ca. 1 min oder bis die Beschichtung beginnt zu erweichen und zu schälen Streifen. Dip des erweichten Beschichtung in Methanol oder Isopropanol für eine Minute, und wischen Sie alle verbleibenden Beschichtung mit einem fusselfreien Tuch. Nach dem Entfernen der Beschichtung, spalten beide Enden der Faser mit einem Saphir-Klinge (Kitco Fiber Optics, Virginia Beach, VA) durch Ritzen und sanft schnappte sie. </li><li> Um die gewünschte Schärfe zu erreichen, chemisch etch einem Ende der Faser Spitze um 1% (v / v) Salpetersäure (analysenrein) Lösung. Vertikal eintauchen ausgewählten Ende der Faser in die saure Lösung bis zu einer Tiefe von 300 bis 500 mu m nach dem ersten Kontakt. Nach ca. 15 Minuten Ätzen, wird die Spitze spontan aus der Säure Oberfläche ablösen. Dies führt zu einer geschärften Faserspitze mit ~ 15 &amp;mgr; Krümmungsradius. Spülen mit deionisiertem Wasser auf eine Säure zu entfernen. </li><li> Montieren Sie den geätzten Ende der Faser auf einem Mikromanipulator (MN-151, Narishige, Tokyo, Japan) und bringen es auf Nähe (ca. 20 mu m) auf der Zelloberfläche zur effizienten Energienutzung Ablagerung zu schließen. </li><li> Halten Sie das nicht geätzt Ende der optischen Faser von einer nackten Faser Futter (BFC300, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). Für die optische Ausrichtung ist die Faser Futter auf einer Fünf-Achs-Übersetzer (BFT-5, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR) montiert. Die Laserenergie (0,5 bis 1 mJ) wird in die Faser durch die Fokussierung des Strahls durch eine plankonvexe Calciumfluorid oder entspiegelt ZnSe Linse (Infrared Optical Products, Farmingdale, New York) auf seine nicht-geätzten Ende gekoppelt. Protected goldenen Spiegeln (PF10-03-M01, Thorlabs, Newton, NJ) werden verwendet, um den mittleren IR-Laserstrahl auf die fokussierende Linse zu steuern. </li></ol> 2. Elektrospray-Setup <ol><li> Die Elektrospray-System kann unter Verwendung der folgenden Komponenten: IG Metall mit leitfähigen Perfluorelastomer Zwinge, Armaturen, Schläuche Ärmel-, Nadel-Anschluss (zB U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, jeweils IDEX Health &amp; Sciences, Oak Harbor, WA) sowie Quarzglas Schlauch (zB CT360-100-50 bis 5, New Objective Inc., Waltham, MA). Die empfohlene Emitter ist aus Edelstahl gefertigt und verfügt über eine konische Spitze mit einem 50 um-ID (zB MT320-50-5-5, New Objective Inc., Waltham, MA). </li><li> Bereiten Sie 50% Methanol-Lösung mit 0,1% Essigsäure (v / v) für die Elektrospray. Die Lösung wird bei einer Rate von 200 bis 300 nl / min durch eine Spritzenpumpe (Harvard Apparatus, Holliston, MA) gepumpt z. B. unter Verwendung einer 500 ul-Spritze (81222, Hamilton Company, Reno, NV). </li><li> Bewerben hohe Spannung zwischen 2.800 und 3.000 V auf die IG Metall von einem geregelten Netzteil (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA) zu einem stetigen Elektrospray generieren. Sicherstellen, dass alle elektrischen Anschlüsse sind sicher und geschützt mit der Abschirmung ordnungsgemäß geerdet. Direkter Kontakt mit exponierten hohen Spannung kann zu einem Stromschlag führen. </li></ol> 3. Probenhandhabung <ol><li> Besorgen Sie sich die Live-Gewebe-oder Zellprobe aus einer geeigneten Quelle und halten sie nach wie vor der Analyse zu empfehlen. Die Allium cepa Glühlampen für diese Demonstration wurden von einem lokalen Speicher gekauft. Schneiden Sie eine Zwiebel längs durch einen chirurgischen Skalpell. Ein paar Zentimeter Segment einer Skala wurde im Schnitt zu einem Band. Eine intakte Monolayer der inneren epidermalen Gewebe abgeschält. </li><li> Die feuchte Oberfläche der Epidermis wird verwendet, um das Gewebe auf einem vorgereinigten Glasobjektträger zu montieren. Halten Sie die Folie von einem Allzweck-Halter (FP01, Thorlabs Inc., Newton, NJ) auf einem Drei-Achsen-Übersetzung Bühne für die Positionierung montiert. Erwerben Sie den Massenspektren nach der Montage sofort die Probe zu Zelle Abbau zu verhindern. </li></ol> 4. Visualization System <ol><li> Zwei lange Strecke Mikroskope verwendet werden, um die Zellen für die Analyse zu wählen und den Abstand zwischen den geschärften Faserspitze und der Zelloberfläche zu halten. Letzteres ist unter 15 ° -30 ° Winkel zur Oberfläche gemessen montiert. Dieses System besteht aus along Abstand Video-Mikroskop (7x Präzision Zoom-Optik, Edmund Optics, Barrington, NJ) mit einem 5-fach unendlich korrigierte Objektiv (M Plan Apo 5x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japan) mit einer CCD-Kamera (Marlin F131, Allied Vision Technologies ausgestattet , Stadtroda, Deutschland) für die Überwachung und Bilderfassung. </li><li> Das zweite Video-Mikroskop wird in einem rechten Winkel zur Probenoberfläche angebracht, um die Zellen von der Spitze zu visualisieren. Dieses System bietet visuelles Feedback, um die Faser Spitze über die Zelle für die Ablation und Analyse ausgewählter auszurichten. Es besteht aus einem 7x Präzision Zoom-Optik (Edmund Optics, Barrington, NJ), mit einem 10-fach unendlich ausgestattet korrigiert großem Arbeitsabstand Objektiv (M Plan Apo 10x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japan) und einer CCD-Kamera. </li></ol> 5. Acquisition of Mass Spectra <ol><li> Schalten Sie den Laser, die Elektrospray und das Massenspektrometer, zB ein Quadrupol-Time-of-flight-System (Q-TOF Premier, Waters, Milford, MA). Optimieren Sie die Geometrie der LAESI Ionenquelle durch Einstellen der Position der Ablation Ort und Elektrospray Emitter zueinander und die Öffnung des Massenspektrometers, um maximale Ionenintensitäten erreichen. </li><li> Markieren Sie die Zelle von Interesse für die Analyse mit Hilfe der Draufsicht Visualisierungssystem. Nach der Auswahl, Verschieben der Probe Bühne, um die markierte Zelle direkt unter der geschärfte Spitze der optischen Faser zu bringen. Mit der Seitenansicht Mikroskop nachjustieren die Spitze-zu-Zell-Oberfläche Abstand zu ~ 20 um. </li><li> Feuer Laserpulse an der ausgewählten Zelle durch die geätzte Faserspitze. Dieses Ergebnis in die Perforation der Zellwand und den Auswurf des Zytoplasma in Form von Partikeln. Nach postionization durch die Elektrospray, die erzeugten Ionen werden durch das Massenspektrometer und Massenspektren gesammelt werden aufgezeichnet. </li><li> Nach der Datenerfassung, setzen den Laser, die Elektrospray und das Massenspektrometer in den Standby-Modus oder schalten Sie sie ab. Halten Sie das abgetragene A. cepa Gewebeprobe für optionale Beobachtung mittels Lichtmikroskopie. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Erfolgreiche Ablation von einer einzigen Zelle führt das Platzen der Zellwand und der Sammlung eines LAESI Massenspektrum. Ein erfolgloser Versuch führt in der Regel keine Ablation und / oder kein Massenspektrum. Zu Demonstrationszwecken, präsentieren wir die Ergebnisse aus dem LAESI-MS-Analyse einer einzigen embedded Epidermiszelle eines A. cepa Glühbirne. Abbildung 2a zeigt eine repräsentative optische Mikroskopie Bild nach der Probenahme einer Zelle. Die Zellwand ist perforiert und das Ausmaß der Perforation ist durch die Grenzen mit den benachbarten Zellen begrenzt. Die benachbarten Zellen scheinen intakt zu sein. Abbildung 2b zeigt eine repräsentative LAESI Massenspektrum von der Zelle produziert werden. Eine Vielzahl von Ionen aus der A. erkannt cepa Zelle und auf der Grundlage ihrer genauen Massen, Isotopenverteilung Muster, und in einigen Fällen, Tandem-Massenspektren, sind sie vorläufig zu endogenen Metaboliten zugeordnet. Die Ionen aus einer einzigen Zelle gefunden wurden ähnlich denen, die in der Analyse des gleichen Gewebes durch konventionelle LAESI-MS von mehreren Zellen beobachtet. 13 <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der einzelnen Zelle Analyse LAESI-MS. A mid-IR-Laserpuls wird in eine optische Faser eingekoppelt und an der Probe auf Objektträger aus Glas gelegt. Der geschärfte Faserspitze fokussiert das Licht in die Zielzelle und die deponierte Energie platzt die Zelle. Die erzeugten Ablation plume (rote Punkte) ist mit einer Elektrospray plume (schwarze Punkte) die Tropfen verschmelzen (grüne Punkte), die sich in Probe bestimmte Ionen Produktion zusammengeführt. Diese Ionen werden analysiert und erkannt durch das Massenspektrometer (MS). Zwei lange Strecke Video-Mikroskope, Mikroskop 1 und Mikroskop 2, werden eingesetzt, um Abstand zwischen den Faserspitze und der Zelloberfläche zu überwachen und eine Zelle für die Analyse, bzw. zu wählen. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2a.jpg" alt="Abbildung 2a" /> Abbildung 2a. Ablation Marke auf einer einzigen Epidermiszelle eines A. cepa Glühbirne. Die benachbarten Zellen weisen keine sichtbaren Schäden und anschließend separat analysiert werden. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2b.jpg" alt="Abbildung 2b" /> Abbildung 2b. Massenspektrum entsprechend der Ablation von einem A. cepa Epidermiszelle zeigt das Vorhandensein von primären und sekundären Metaboliten.

<ol>
	<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+Mass+Spectrometry.">Ambient Mass Spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li><li>Chen, Z. Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+plume+expansion+in+atmospheric+pressure+midinfrared+laser+ablation+of+water-rich+targets.">Early plume expansion in atmospheric pressure midinfrared laser ablation of water-rich targets.</a> Physical Review E. E77, 036316-036316 (2008).</li><li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+Pressure+Molecular+Imaging+by+Infrared+MALDI.">Atmospheric Pressure Molecular Imaging by Infrared MALDI.</a> Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 79, 523-532 (2006).</li><li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+Pressure+Infrared+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+for+Plant+Metabolomics.">Atmospheric Pressure Infrared MALDI Imaging Mass Spectrometry for Plant Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 407-420 (2007).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+for+Atmospheric+Pressure+in+Vivo,+and+Imaging+Mass+Spectrometry.">Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Shrestha, B., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+pharmaceuticals+and+excreted+xenobiotic+and+endogenous+metabolites+with+atmospheric+pressure+infrared+MALDI+mass+spectrometry.">Rapid analysis of pharmaceuticals and excreted xenobiotic and endogenous metabolites with atmospheric pressure infrared MALDI mass spectrometry.</a> Metabolomics. 4, 297-311 (2008).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+Molecular+Imaging+and+Depth+Profiling+of+Live+Tissue+by+Infrared+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Ambient Molecular Imaging and Depth Profiling of Live Tissue by Infrared Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80, 4575-4582 (2008).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric+Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82, 982-988 (2010).</li><li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry.">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. , (2010).</li><li>Sripadi, P., Nazarian, J., Hathout, Y., Hoffman, E., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+metabolites+from+the+untreated+tissue+of+Torpedo+californica+electric+organ+by+mid-infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">In vitro analysis of metabolites from the untreated tissue of Torpedo californica electric organ by mid-infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 5, 263-276 (2009).</li><li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Metabolic+Profiling+of+Single+Cells+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">In Situ Metabolic Profiling of Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 8265-8271 (2009).</li><li>Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+and+Analysis+of+a+Single+Cell+by+Consecutive+Laser+Pulses.">Ablation and Analysis of a Single Cell by Consecutive Laser Pulses.</a> Applied Physics A. , (2010).</li></ol>

Der Wassergehalt des Zytoplasma der Zelle und die Zugfestigkeit der Zellwand oder Membran sind entscheidende Faktoren für die Ablation von einzelnen Zellen während LAESI-MS-Analyse. Die Laserfluenz muss angepasst werden, um die Ablationsschwellen der verschiedenen Zelltypen zu erreichen. Die gelieferte Laserfluenz hängt von der Energie des Laserpulses und der Abstand zwischen den Faserspitze und der Zelloberfläche. Die Minimierung der Störung benachbarter Zellen während der einzelnen Zelle Analyse ist kritisch. Keeping the Laserenergie an der Ablationsschwelle begrenzt die Wirkung der Analyse auf die benachbarten Zellen. Eine der möglichen Anwendungen ist mit einzelnen Zellen als natürliche volumetrischen Pixel (Voxel) für chemische Bildgebung von MS. Im Vergleich zum Sammeln von Daten auf einer künstlichen oft rechteckigen Raster, ist die chemische Bildgebung eines Gewebes einer Zelle in einer Zeit eher die räumliche Organisation der biochemischen Wechselwirkungen zwischen Zellen behalten.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>45727</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>65548</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-methyl-2-pyrrolidinon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>M79603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>39259</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

direct analysis of single cells by mass spectrometry at atmospheric pressure

Analyse von Biochemikalien in einzelnen Zellen ist wichtig für das Verständnis des Zellstoffwechsels, Zellzyklus, Anpassung, Erkrankungen, etc. Selbst die gleichen Zelltypen heterogene biochemische Zusammensetzung je nach physiologischen Bedingungen und Wechselwirkungen mit der Umwelt aufweisen. Herkömmliche Methoden der Massenspektrometrie (MS) für die Analyse von Biomolekülen in einzelne Zellen verwendet verlassen sich auf umfangreiche Probenvorbereitung. Das Entfernen der Zellen aus ihrer natürlichen Umgebung und umfangreiche Probenbearbeitung zu Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung führen. Ambient-Ionisation-Methoden ermöglichen die Analyse von Proben in ihrer natürlichen Umgebung und ohne aufwändige Probenpräparation. 1 Die Techniken, die auf den mittleren Infrarotbereich (mid-IR) Laser-Ablation von biologischem Material bei 2,94 um Wellenlänge basiert die plötzliche Erregung des Wassers zu nutzen, dass die Ergebnisse in Phase Explosion. 2 Umgebungstemperatur Ionisierungstechniken auf Mid-IR-Laserstrahlung, wie Laserablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) und Atmosphärendruck Infrarot-Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation (AP IR-MALDI) basieren, haben erfolgreich die Möglichkeit, direkt zu analysieren Wasser-Beweis reichen Geweben und Körperflüssigkeiten bei atmosphärischem Druck. 3-11 In LAESI mittleren IR-Laser-Ablation plume, die meist aus neutralen Partikel aus der Probe verschmilzt mit hoch geladenen Elektrospray Tröpfchen Ionen zu erzeugen. Kürzlich wurde mid-IR-Ablation von einzelnen Zellen durch die Bereitstellung der mid-IR-Strahlung durch eine geätzte Faser durchgeführt. Die Fahne von diesem Ablation erzeugt wurde von einem Elektrospray ermöglicht die Analyse der verschiedenen Metabolite in einzelnen Zellen durch LAESI-MS postionized. 12 Dieser Artikel beschreibt die detaillierte Protokoll für einzelne Zelle Analyse mit LAESI-MS. Das vorgestellte Video zeigt die Analyse einer einzigen Epidermiszelle aus der Haut einer Zwiebel Allium cepa. Die schematische Darstellung des Systems ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein repräsentatives Beispiel für einzelne Zelle Ablation und eine LAESI Massenspektrum aus der Zelle sind in Abbildung 2 dargestellt.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure at JoVE.com

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Einzel-Zell-Analyse wird durch Massenspektrometrie an pflanzlichen und tierischen Zellen bei Atmosphärendruck durch eine geschärfte Glasfaser, um die Zellen für die Laserablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) Massenspektrometrie Probe durchgeführt.

Direkte Analyse von Einzelzellen durch Massenspektrometrie bei Atmosphärendruck

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

direct-analysis-single-cells-mass-spectrometry-at-atmospheric

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K Aufrufe.  George Washington University. Einzel-Zell-Analyse wird durch Massenspektrometrie an pflanzlichen und tierischen Zellen bei Atmosphärendruck durch eine geschärfte Glasfaser, um die Zellen für die Laserablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) Massenspektrometrie Probe durchgeführt.

Serie: Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-Wellen-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie: Basic Experimentelle Verfahren zur Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Atmosphärische Molecular Imaging von biologischen Geweben und Biofilme durch LAESI Massenspektrometrie

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch &amp; MALDI-TOF-Massenspektrometrie Analyse der PAK2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Analyse von LINE-1-Retrotransposition im Einzel Nucleus Ebene

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Anwendungen der Einzel-Sonde: Mass Spectrometry Imaging und Einzelzellanalyse unter Umgebungsbedingungen

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

Probenvorbereitung für Masse-Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analyse der okulären Mikrogefäßen

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...