Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit durch die US National Science Foundation unter Grant No 0719232, durch das US Department of Energy (DEFG02-01ER15129) und durch Protea Biosciences, Inc. (Morgantown, WV). Die Autoren möchten auch Jessica A. Stolee für ihre Hilfe danken während der Videoaufnahmen des Protokolls.

Das folgende Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte der Laserablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) Experiment und liefert repräsentative Beispiele für Seiten-und dreidimensionale (3D) Bildgebung für Tier-und Pflanzenarten Gewebeproben. Weitere experimentelle und technische Details können auch anderweitig beschaffen. 1-6 1. Tissue Vorbereitung und Montage <ol><li> Wenn Schneiden erforderlich ist, verwenden Sie einen cryomicrotome Abschnitt des Gewebes in 10-100 um dicke Scheiben bei -10 bis -20 ° C, sofern nicht anders für einen bestimmten Gewebetyp empfohlen. </li><li> Berg Schnitte auf einer ebenen Fläche (zB chemisch vorgereinigt Glasträger) direkt und ohne chemische Modifikatoren. Für geschnittene Gewebe, Tauwetter-mount Sektionen und sichern Sie den Probenhalter ein Peltier-Kühlung der Bühne sofort nach Tauwetter-Montage, um das Gewebe zu jeder Zeit während der Analyse eingefroren halten. Dieser Schritt ist notwendig zur Minimierung / Vermeidung molekularen Migration im Abschnitt. </li><li> Wenn nötig, verwenden Sie einen Kühlkörper mit einem Low-Power-Ventilator, um die Wärmeabfuhr aus dem Peltier-Bühne zu erleichtern, halten das Gewebe eingefroren ausgestattet. </li><li> In einer feuchten Umgebung über einen längeren Zeitraum (1-2 Stunden), für die Kondensation von Wasser oder Eis auf der Gewebeoberfläche zu inspizieren. Kondensation von Wasser auf das Gewebe nachteilig wirkt sich auf die Abbildungsleistung in LAESI Experimente. 1 </li><li> Wenn nötig, verwenden Sie ein Zimmer Entfeuchter oder setzen Sie die abgekühlte Probe in einer Klimakammer mit einem inerten Gas (zB trockenem Stickstoff) gefüllt, um Kondenswasserbildung zu vermeiden. 1 </li></ol> 2. Optimierung der LAESI Ion Source Die LAESI Ionenquelle besteht aus einer mittleren Infrarot-Laser, eine Reihe von optischen Elementen für die leichtgängige Lenkung und Fokussierung sowie zusätzliche Probenhalter, Kühlkomponenten, Übersetzung Stufen und ein Lösungsmittel Delivery-System. Abbildung 1 zeigt die typische Anordnung dieser Elemente in Bezug auf den Eingang des atmosphärischen Ionenquelle eines Massenspektrometers. <ol><li> Wie in Abbildung 1, Position der Probe 15-20 mm unterhalb der Öffnung des Massenspektrometers Probenahme Kegel (d OR-FP) dargestellt. </li><li> Betrieb eines mid-IR-Laser bei 2,94 um Wellenlänge und 10 Hz Wiederholrate. Dämpfen die Laserleistung bis ~ 100 uJ / Pulsenergie. </li><li> Verwenden Sie eine Kombination von Gold Spiegel und eine fokussierende Linse transparent bei der Laserwellenlänge (zB eine plankonvexe CaF 2 oder ZnSe-Linse) zu koppeln des Laserpulses Energie in der Probe bei senkrechtem Einfall (siehe rechts Einfallswinkel in Bezug auf Probenoberfläche in Abbildung 1). </li><li> Positionieren Sie den mittleren Infrarotbereich Strahlachse 5-8 mm vor der Öffnung des Massenspektrometers Probenahme Kegel. </li><li> Passen Sie die Fokussierlinse Position und die Pulsenergie des Laserstrahls auf Gewebeentnahme im Brennfleck zu erreichen. Die Abmessungen des abgetragenen Volumen bestimmt die Pixelgröße (oder Voxel in dreidimensionale Bildgebung) Größe für die Imaging-Anwendung. </li><li> Position einer Nanospray Emitter im Einklang mit dem Einlass Achse des Massenspektrometers und eine Öffnung-Emitter-Spitze Abstand von ca. 10 mm (siehe Abbildung 1). </li><li> Für die Elektrospray, bereiten 50% Methanol-Lösung mit 0,1% Essigsäure oder 0,1% Ammoniumacetat Additiv für positive oder negative Ionen-Modus bzw.. Abhängig von der Probe, andere organische Lösungsmittel, wie Acetonitril, Isopropanol, etc., kann Methanol in Konzentrationen geeignet für die analytische Aufgabe zu ersetzen. Die Stabilität der Elektrospray ist Voraussetzung für erfolgreiche Bildgebung. Je nach Lösungsmittel Auswahl, benötigen Sie den Durchfluss und die Spritzen Spannung angepasst werden, um stabile Spray zu erreichen. </li><li> Für reaktive LAESI 6 in Imaging-Anwendungen kann der Elektrospray-Lösung enthalten Reaktanten. </li><li> Verwenden Sie eine Spritzenpumpe, die Elektrospray-Lösung durch die Elektrospray Emitter liefern bei einer Flussrate von ~ 300 Nl / min. </li><li> Wenn das Massenspektrometer Öffnung bei einer niedrigen Spannung (&lt;500 V gegen Erde gemessen) gehalten wird, erzeugen Elektrospray durch Anlegen einer Hochspannung direkt an die Elektrospray-Strahler (zB 3000 V) oder durch eine metallene Verbindung. Andernfalls Boden direkt die Elektrospray Emitter oder durch Metall-Gewerkschaft, die Elektrospray etablieren. </li><li> Betreiben Sie die Elektrospray-Quelle in Kegel-jet Spritzen-Modus für die effizienteste Ionenerzeugung durch LAESI. Für die Wirkung der Betriebsgrößen auf den Spritzen-Modi und ihre Wirkung auf die Massenspektren, siehe Diskussionen anderswo. 5,7,8 </li><li> Vorsichtig die relativen Abstände der LAESI Setup für LAESI Ionen-Ausbeute zu optimieren und dabei den Laserstrahl, der Emitter und die Öffnung Achsen in der gleichen Ebene. Hier finden Sie detaillierte Anweisungen an anderer Stelle. 5 </li><li> Mit einem optischen Mikroskop, bestimmen die lateralen Abmessungen der Ablation Krater auf der Probe. </li><li> Für die dreidimensionale Bildgebung LAESI Experimente durchführen Ablation mit einzelnen Impulsen und bestimmen die Tiefe eines Voxels mit, zum Beispiel die Z-Stapel-Modus in der optischen Mikroskopie. 3 </li></ol> 3. Molecular Imaging and Data Analysis In der Imaging-Experiment wird die Gewebeprobe in der Brennebene des Lasers in X-und Y-Richtung mit Schritt Größen größer als oder gleich die Abmessungen der Ablation Stelle bewegt. Die räumliche Auflösung ist durch die Fokussierung des einfallenden Laserstrahls begrenzt. <ol><li> Wählen Sie den Bereich von Interesse auf der Probenoberfläche und erhalten die (X, Y) Koordinaten des entsprechenden Grenzen. </li><li> Wählen Sie einen gridding Algorithmus (zB adaptive Gitter, ausgewählte Region Bildgebung, rechteckigen Raster, spiralförmig, Z Scannen, etc.), mit der die Probenoberfläche mit ausgewählten Zeitpunkt an jedem Pixelverweilzeiten über den Bereich abgebildet werden, um Raster. </li><li> Verwenden Sie ein Drei-Achsen-Übersetzung Bühne und Software, die in der Lage Rasterung der Probe entsprechend dem vorgegebenen Raster. </li><li> Berechnen Sie die gesamte Zeit für die Bildgebung erforderlich. </li><li> Deaktivieren Sie die Datenerfassung Frist des Massenspektrometers. Wenn dies nicht möglich ist, setzen Sie die Datenerfassung Frist auf den berechneten Belichtungszeit Wert. </li><li> Starten Sie den mittleren Infrarot-Laserquelle mit einer Wiederholrate richtige, um eine ausreichende Signal-Rausch-Verhältnis im Massenspektrum erzeugen innerhalb der Verweilzeit an jedem Pixel eine LAESI seitlichen Imaging Experiment durchzuführen. Für 3D-molekulare Bildgebung, verwenden Sie ein Spektrum Akquisition höher als die Laserquelle Repetitionsrate erfolgreich Masse-Analyse der Ionen innerhalb eines einzelnen Laserpulses erzeugt. Warten Sie auf die START-Signal an die Ablation Sequenz einzuleiten. </li><li> Schalten Sie den Elektrospray-Quelle. Stellen Sie sicher, dass es genug für die volle Zeit für die Bildgebung erforderlich. </li><li> Gleichzeitig START den Erwerb von Massenspektren, die mid-IR Laserablation, und die Abtastung der Oberfläche. </li><li> Wenn die Bildgebung laufen beendet hat, stoppen Sie die Abtastung der Oberfläche, die mid-IR Lasern, und die Datenerfassung. </li><li> Deaktivieren Sie die Laserquelle. </li><li> Schalten Sie die Hochspannung. </li><li> Schalten Sie die Spritzenpumpe. </li><li> Set dem Massenspektrometer zu STANDBY-Modus. </li><li> Schalten Sie das Peltier-Kühlung Elektronik. </li><li> Close Inertgasstrom, wenn verwendet. </li><li> Verwenden Sie eine Software, um die absoluten Koordinaten der Pixel in lateraler Bildgebung oder die Voxel in 3D-Analyse mit den entsprechenden Spektren korrelieren. </li><li> Zeichnen Sie die Ionenintensität Signal für einen ausgewählten m / z-Wert gegen den absoluten Koordinaten der Analyse auf Seiten-und 3D-molekularen Bilder zu erhalten. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse für einige wichtige Gewebetypen und bildgebenden Verfahren. Panel A zeigt ein Fall für ein tierisches Gewebe Abschnitt, der während des Experiments, um eine Dehydratation zu verhindern eingefroren wurde. 1 Darüber hinaus wird die Probe in einem trockenen Stickstoff-Umgebung befand auf Umgebungstemperatur Wasserdampf kondensiert auf der Probenoberfläche zu vermeiden. Eine 100-Mikrometer dicke Frontalschnitt vom Gehirn einer Ratte (Rattus norvegicus) wurde seitlich mit LAESI abgebildet. Die anatomischen Regionen des Gehirns (siehe optische Bild in Panel A) zeigen eine gute Korrelation mit der molekularen Bild für den PC Plasmalogene erhalten (O-33: 3) und / oder PE (O-36: 3) mit m / z 728,559. Panel B zeigt die 3D-Bildgebung LAESI einer Zebra-Anlage (Aphelandra squarrosa) Blattgewebe. Da hinterlässt einen natürlichen Abwehrmechanismus gegen Austrocknung besitzen, könnte die Probe in die Umgebung abgefragt werden. 3 Die erhaltenen molekularen 3D-Bilder zeigten eine Vielzahl von Verteilungsmuster für primäre und sekundäre Pflanzenstoffe. Unter anderem wurde acacetin mit m / z 285,076 bei höheren Ionen zählt in den gelben Bereich des zweiten und dritten Schicht von oben mit einer homogenen Verteilung in den anderen erkannt. Diese Verteilung stimmte mit dem Muster der Buntheit in das optische Bild zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des LAESI System (ES, Elektrospray Emitterspitze, oder Öffnung des Massenspektrometers Probenahme Kegel; FL, fokussierende Linse; FP, Brennpunkt, P, Peltier-Kühlung Bühne, HS, Kühlkörper). Ein Teil der Partikel während der mid-IR-Ablation (rote Punkte) verschmilzt mit der Elektrospray zu geladenen Tröpfchen mit Molekülen und Ionen der Probe (grüne Punkte) ausgesät Ertrag ausgewiesen. Die Ionen von diesen Tröpfchen freigesetzt werden analysiert und aufgenommen von dem Massenspektrometer. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für Quer-und 3D-IMAGI. ng mit LAESI Massenspektrometrie (A) Das obere Feld zeigt das optische Bild vom Gehirn einer Ratte (Rattus norvegicus) Frontalschnitt und die molekulare Bild für den PC Plasmalogene erhalten (O-33: 3) und / oder PE (O-36 : 3) mit m / z 728,559. Der weiße Maßstab entspricht 1 mm. Adaptiert mit Erlaubnis von (Referenz 1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) Die untere Abbildung zeigt die 3D-Bildgebung eines Blattes aus einem bunten Zebra-Anlage (Aphelandra squarrosa). Acacetin mit m / z 285,076 wurde bei höheren Ionen zählt in den gelben Bereich des zweiten und dritten Schicht von oben mit einer homogenen Verteilung in den anderen erkannt. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von (Referenz 3). Copyright 2009 American Chemical Society.

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	<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure,+in+vivo,+and+imaging+mass+spectrometry.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li><li>Nemes, P., Vertes, A., Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure+molecular+imaging+mass+spectrometry.+Mass+Spectrometry+Imaging.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry.">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li><li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays.">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li><li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization.">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li><li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry.">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li><li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li><li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+mass+spectrometry.">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li></ol>

Unterschiedliche Gewebetypen weisen unterschiedliche Wassergehalt und Zugfestigkeit, die wiederum die Ablation Eigenschaften der Proben beeinflussen können. 9 Um diese Effekte abzumildern, ist es erwünscht, dass die Laserfluenz, Probenhandling und Analyse-Protokolle überarbeitet beim Wechsel zwischen sein wichtigen Gewebetypen. Für einzelne Zelle oder eine höhere Auflösung Untersuchungen, die Mitte der Infrarot-Licht lässt sich in einem geschärften Glasfaser statt einer fokussierenden Linse gekoppelt werden. 10 Mit der Positionierung der Faserspitze in der Nähe der ausgewählten Zellen in einem Gewebe, kann LAESI Analyse durchgeführt werden Ein-Zell-Ebene. Als Label-free-Ionenquelle für Ambient-Massenspektrometrie, hat 11 LAESI großes Potenzial für die Untersuchung der biochemischen Prozesse im Gewebe gezeigt. Mit dem zusätzlichen Nutzen einer direkten Analyse, Quer-und 3D-Bildgebung ist LAESI ein aufstrebendes bioanalytische Werkzeug für die Profilierung als auch Imaging-Anwendungen.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mass spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters Co. (Milford, MA)</td>
<td>Q-TOF Premier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mid-IR laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td>
<td>Vibrant IR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

atmospheric-pressure molecular imaging of biological tissues and biofilms by laesi mass spectrometry

Ambient-Ionisation-Methoden in der Massenspektrometrie können analytische Untersuchungen direkt auf ein Gewebe oder Biofilm unter nativ-ähnlichen experimentellen Bedingungen durchgeführt werden. Laser-Ablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) ist eine solche Entwicklung und ist besonders für die Untersuchung von Wasser enthaltenden Proben gut geeignet. LAESI nutzt eine Mitte-Infrarot-Laserstrahl (2,94 um Wellenlänge), um die Wassermoleküle der Probe anzuregen. Wenn die Ablation Einfluss Schwellenwert überschritten wird, wird das Probenmaterial in Form von Feinstaub ausgestoßen und diese Geschosse reisen, um zehn Millimeter über der Probenoberfläche. In LAESI, ist dies Ablation plume von hoch geladenen Tröpfchen abgefangen zu einem Bruchteil der ausgestoßenen Probenmaterial zu erfassen und konvertieren seine chemischen Bestandteile in Ionen in der Gasphase. Ein Massenspektrometer mit einer Atmosphärendruck-Ionenquelle Schnittstelle ausgestattet wird eingesetzt, um zu analysieren und erfassen die Zusammensetzung der freigesetzten Ionen, die aus dem Bereich untersucht (Pixel) der Probe. Eine systematische Befragung über ein Array von Pixeln, öffnet sich ein Weg für die molekulare Bildgebung in der Mikrosondenanalyse Modus. Ein einzigartiger Aspekt LAESI bildgebenden Massenspektrometrie ist Tiefenprofilierung, die in Kombination mit seitlichen Bildgebung ermöglicht dreidimensionale (3D) die molekulare Bildgebung. Mit aktuellen Quer-und Tiefenauflösung von ca. 100 mu m und ~ 40 um, bzw. hilft LAESI bildgebenden Massenspektrometrie, die molekulare Struktur von biologischen Geweben zu erkunden. In diesem Aufsatz haben wir die wichtigsten Elemente einer LAESI und Leitlinien für eine erfolgreiche Imaging Experiment.

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Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Laser-Ablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) ist eines Atmosphärendruck-Ionenquelle für die Massenspektrometrie. Im Imaging-Modus, ein mittleres Infrarot-Laser-Sonden die Verteilung der Moleküle über einen Gewebeschnitt oder einen Biofilm. Diese Technik stellt einen neuen Ansatz für die unterschiedlichsten bioanalytische Untersuchungen unter nativen experimentellen Bedingungen durchgeführt.

Atmosphärische Molecular Imaging von biologischen Geweben und Biofilme durch LAESI Massenspektrometrie

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

atmospheric-pressure-molecular-imaging-biological-tissues-biofilms

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Aufrufe.  George Washington University. Laser-Ablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) ist eines Atmosphärendruck-Ionenquelle für die Massenspektrometrie. Im Imaging-Modus, ein mittleres Infrarot-Laser-Sonden die Verteilung der Moleküle über einen Gewebeschnitt oder einen Biofilm. Diese Technik stellt einen neuen Ansatz für die unterschiedlichsten bioanalytische Untersuchungen unter nativen experimentellen Bedingungen durchgeführt.

Serie: Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-Wellen-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie: Basic Experimentelle Verfahren zur Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Direkte Analyse von Einzelzellen durch Massenspektrometrie bei Atmosphärendruck

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profiling Thiolredox Proteome Mit Isotopen-Massenspektrometrie Tagging

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Anwendungen der Einzel-Sonde: Mass Spectrometry Imaging und Einzelzellanalyse unter Umgebungsbedingungen

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi and trans-Golgi network. Cellular functions of the Golgi are determined by the characteristic distribution of its resident proteins. The spatial resolution of conventional light microscopy is too low to resolve sub-Golgi structure or cisternae. Thus, the immuno-gold electron microscopy is a method of choice to localize a protein at the sub-Golgi level. However, the technique and instrument are beyond the capability of most cell biology labs. We describe here our recently developed super-resolution method called Golgi protein localization by imaging centers of mass (GLIM) to systematically and quantitatively localize a Golgi protein. GLIM is based on standard fluorescence labeling protocols and conventional wide-field or confocal microscopes. It involves the calibration of chromatic-shift aberration of the microscopic system, the image acquisition and the post-acquisition analysis. The sub-Golgi localization of a test protein is quantitatively expressed as the localization quotient. There are four main advantages of GLIM; it is rapid, based on conventional methods and tools, the localization result is quantitative, and it affords ~ 30 nm practical resolution along the Golgi axis. Here we describe the detailed protocol of GLIM to localize a test Golgi protein.

The precise localization of Golgi residents is essential for understanding the cellular functions of the Golgi. However, conventional optical microscopy is unable to resolve the sub-Golgi structure. Here we describe the protocol for a conventional microscopy based super-resolution method to quantitatively determine the sub-Golgi localization of a protein.

Quantitative Lokalisierung eines Golgi-Proteins von Imaging Center der Fluoreszenz Masse

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...