Diese Arbeit wurde von der Georgia Cancer Coalition grant-R9028 unterstützt.

Gründe Ausnutzung der Verwendung von Thermo Scientific Dharmacon Oligos, 50 bis 80-mers, hier präsentieren wir ein Verfahren, basierend auf einem Gen-Korrektur-Assay, durch die Oligos genetischen Information, um genomische DNA von Hefezellen übertragen kann, folgende Glühen, das Ziel chromosomalen DNA. Erfolgreiche Ausrichtung von Oligos ist durch das Auftreten von Hefe-Kolonien in dem die voraussichtliche Phänotyp erzielt. Wenn die gewünschte genetische Veränderung innerhalb eines oder mehrerer Ribonukleotiden in der Oligo-Sequenz eingebaut durchgeführt wird, fließt die genetische Information direkt aus der RNA-Darm-Trakt der chromosomalen Ziel-DNA, also ein RNA / DNA-Hybrid bildet bei der chromosomalen Ebene während der Targeting-Prozess. Die Ribonukleotid / s aus einem Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo kann als Vorlage für Gen-Targeting über DNA-Reparatur-Synthese dienen oder in die DNA integriert werden und dienen als Vorlage bei der DNA-Replikation. In diesen Experimenten verwenden wir die Hefe / Saccharomyces cerevisiae / eukaryotischen Modellsystem, aber einen ähnlichen Ansatz auch in anderen Organismen oder Zellen angewendet werden. In diesem Video, verwenden wir ein Thermo Scientific Dharmacon Oligo mit Homologie konzipiert, um ein Ziel Hefe genomischen Lokus und die einen Ribonukleotid in der Mitte, um eine Mutation im Zielgen zu korrigieren. Nach der Transformation mit dem RNA-haltigen Oligo beobachten wir die Korrektur der Ziel-Website bei einer bestimmten Frequenz, was bedeutet, dass die RNA-Darm-Trakt der Oligo in die chromosomale DNA konnten integriert werden und dienen als Vorlage für die DNA-Synthese während der DNA-Replikation gibt. Die genetische Information in der RNA-Darm-Trakt getragen wird stabil an die folgenden Generationen Zelle übertragen. Hier beschreiben wir die Schritte der Hefezelle Umbildung durch den Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo-und die Annäherung an die RNA Informationen übertragen in die chromosomale DNA zu erkennen. A. Aufbau der RNA-haltigen Oligo in diesem Experiment verwendet Wir haben ein RNA-haltigen Oligo um einen genetischen Defekt in der Hefe zu korrigieren konzipiert S. cerevisiae chromosomale DNA an der trp5 Locus. Der Hefestamm in das verwendete Protokoll enthält eine Mutante trp5 Gens mit einer Zwei-Basendeletion und eine Nonsense-Mutation (Abbildung 1A). Solche Hefestamm ist ein Tryptophan auxotrophen Mutante und bildet keine Kolonien auf Medien ohne Tryptophan. Die DNA-Sequenz des Gens TRP5 finden Sie auf der Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Die Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo im Sinne dieses Protokolls ist ein 65-mer mit einem 2-base DNA-Insertion, entwickelt, um die Deletionsmutation und ein Ribonukleotid entwickelt, um die Nonsense-Mutation des trp5 Allel (Abbildung 1A) richtig zu korrigieren. Die Sequenz des Oligo ist wie folgt aufgebaut: 5&#39;-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Diese Oligo wird von Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) bei 200 nm-Maßstab und wird entsalzt, entschützt und ohne PAGE Reinigung. B. Herstellung der RNA-haltigen Oligo für Hefe-Transformation (modifiziert nach Storici et al., 2007 1) <ol><li> Wischen Sie Materialien, die für das Experiment mit Oligo Röhren, Pipetten, Wirbel, Racks, experimentellen Bereich und Handschuhe von den Prüfern mit RNase Dekontaminationslösung mögliche RNase Kontamination vor alles beginnt zu entfernen getragen verwendet werden. Verwenden RNase-freies Wasser, chemische Reagenzien, Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen in allen Schritten. Jeder Schritt in diesem Experiment sollte RNase-frei sein. </li><li> Resuspendieren Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo erhielt von der Firma zu 250 pMol / ul Stammlösung mit RNase-freiem Wasser und kräftig vortexen, um das Pellet zu lösen. Lagerung bei -80 ° C. </li><li> Unmittelbar vor der Transformation, tauen die RNA-haltigen Oligo auf Eis und verdünnter zu 50 pMol / ul mit RNase-freiem Wasser in RNase-freie Rohre. Jeder Wandel erfordert 1 nmol der RNA-haltigen Oligos. </li><li> Denaturieren eine gewählte Höhe der RNA-haltigen Oligos auf dem 100 ° C Hitze-Block für 2 min zur sekundären Strukturen des Oligos zu beseitigen. </li><li> Unmittelbar nach Denaturierung statt der Röhre auf dem Eis. Keep on ice bis Transformation. </li><li> Als Kontrolle in dem Experiment eine entsprechende DNA-Oligo nur verwendet wird. Diese Oligo ist von -20 ° C aufgetaut und zubereitet für die Transformation als RNA-haltigen Oligo, wie oben beschrieben. </li></ol> C. Transformation von Hefezellen mit Hilfe der RNA-haltigen Oligo <ol><li> Impfen 5 ml reichen YPD-Flüssigmedium mit der trp5 mutierten Hefezellen wachsen und bei 30 ° C über Nacht (siehe Materialien). </li><li> Übertragen 1,5 ml der Übernacht-Kultur in 50 ml YPD flüssigen Medium. </li><li> Inkubieren von Zellen in einer 30 ° C Schüttler (225 rpm) für 4h. </li><li> Bereiten Sie Lösung 1und Lösung 2 unmittelbar vor der Transformation in RNase-freie Röhrchen (siehe Materialien). </li><li> Übertragen Sie die Zellkultur zu einer 50 ml RNase-freies Röhrchen und drehen sich mit 3000 rpm, das entspricht bis 1562 g, für 2 min. Das Pellet aus der Zelle Niederschlag liegt bei ca.. 0,3 cm 3. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 50 ml RNase-freies Wasser und drehen sich mit 3000 rpm für 2 min. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6 für 5 mal loswerden das Kulturmedium und RNasen, die vorhanden sein in dem Medium so weit wie möglich könnte. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und die Zellen in 5 ml der Lösung 1 und Spin bei 3000 rpm für 2 min. </li><li> Überstand entfernen und die Zellen in 250 ul Lösung 1. Diese Menge an Zellen reicht für 7-8 Transformationen. </li><li> Aliquot 50 pl der Zellsuspension in RNase-freien Reaktionsgefäßen, fügen Sie 20 ul RNA-haltigen Oligo funktionierende Lösung (1 nmol) oder 20 ul DNA-Oligo nur funktionierende Lösung (1 nmol) oder 20 ul sterilem Wasser ohne Oligo für die negative Kontrolle. Dann fügen Sie 300 ul Lösung 2 für jede Transformation Reaktion. Es gibt keine Notwendigkeit, Lachs-Sperma-DNA in den Prozess der Transformation hinzu, wie die Oligos fungieren als Träger selber. </li><li> Vortex kräftig zu mischen Komponenten homogen. </li><li> Inkubieren Transformation Reaktionen bei 30 ° C für 30 min in einem Shaker. </li><li> Hitzeschock bei 42 ° C für 15 min. </li><li> Spin down Zellen bei 5000 rpm, das entspricht 2236 g, für 4 min. </li><li> Überstand entfernen und die Zellen in 100 ul sterilem Wasser. </li><li> Nehmen Sie ein Aliquot dieser Zellsuspension und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser von 100.000-fache und Platte-Zellen auf einer YPD Platte mit ca.. 15 sterile Glasperlen und Inkubieren bei 30 ° C für 2 Tage. </li><li> Platte aller resuspendierten Zellen aus jeder Transformation Reaktion auf eine Petrischale aus Kunststoff komplette festen Medium ohne Tryptophan (SC-Trp) mit ca.. 15 sterile Glasperlen und Inkubieren bei 30 ° C für 4-5 Tage (Abbildung 2). </li></ol> D. Analyse von Gen-Korrektur durch die RNA-haltigen Oligo <ol><li> Zählt die Anzahl der Kolonien auf der selektiven Medium (Abbildung 2) sowie auf YPD-Medium, das Gen-Korrektur-Frequenz für den RNA-haltigen Oligo berechnen, die DNA-only Oligo-und für die no-Oligo-Steuerung. Vergleichen Sie die Nummer erhalten. Spontane Rückkehr von der trp5 Allele mit dem Zwei-Basendeletionen und die Nonsense-Mutation ist weniger als 10-9 in den verwendeten Hefestamm, so erwarten wir keine Kolonien Bildung auf der selektiven Medium, wenn keine Oligos zu den Zellen hinzu. </li><li> Streak aus mehreren zufällig ausgewählten Transformante Kolonien auf YPD-Medium, um einzelne Kolonie isoliert zu erhalten. Warten Sie zwei Tage für Koloniewachstum, dann nehmen Sie mehrere (mindestens 5) einzelne Kolonien und machen Flecken auf YPD und auf selektivem Medium. </li><li> Entwerfen Sie ein Paar von Primern für die Region (250-1.000 bp) durch die RNA-haltigen Oligo durch Kolonie-PCR (Abbildung 1B) gezielt zu verstärken. Das Verfahren für die Kolonie-PCR ist wie folgt (modifiziert nach Storici und Resnick, 2006 2). <ol><li> Die Zellen (ca. 1 mm3) aus den einzelnen Patches in 50 ul Wasser aufgenommen und fügen Sie 1 Einheit des Lyticase. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min, durch Inkubation in einem Heizblock folgte bei 100 ° C für 5 min zu den Zellen und Freisetzung genomische DNA in Lösung zu brechen. </li><li> PCR-Bedingungen: Die PCR-Reaktion umfasst 10 ul der Zelle Resuspension, 50 pmol jedes von Vorwärts-und Rückwärts-Primer, 1 ul 10 mM dNTPs, 1 Einheit Taq-Polymerase, 5 ul 10x Puffer und mit sterilem Wasser bis zu einer eingestellten Endvolumen von 50 ul durchgeführt. Das PCR-Programm wird 3 min bei 95 ° C, 30 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C und 1 min bei 72 ° C, eine letzte Verlängerung der Zeit von 7 Minuten bei 72 ° C, dann Proben werden bei 4 ° C gehalten Eine Verlängerung der Zeit von 1 min / kb ist für diese Reaktion angenommen. </li><li> Nach PCR werden die Proben auf einem 1% oder 2% (in Abhängigkeit von der erwarteten Größe des PCR-Produkts) Agarosegel für die Beobachtung des PCR-Produkts (Abbildung 3) ausgeführt werden. </li></ol></li><li> Wenn die genetische Information von der RNA-haltigen Oligo übertragen erzeugt eine neue Restriktionsschnittstelle in der Hefe genomischen Zielregion (Abbildung 1B), ist es möglich, die korrekte Übermittlung von Informationen durch Verdau des PCR-Produkts mit dem entsprechenden Restriktionsenzym zu überprüfen. Wenn keine Restriktionsschnittstelle durch die RNA-haltigen Oligo erzeugt wird, gehen Sie zu Schritt 6 weiter. Digest PCR-Produkte mit einem bestimmten Restriktionsenzym. Die Abbaureaktion umfasst 6 ul PCR-Produkt, Puffer, BSA (nicht benötigt für einige Enzyme, siehe Anleitung für das Enzym verwendet werden), 0,5 ul Restriktionsenzym und sterilem Wasser auf 15 ul. Die Proben werden für 1 h bei der Temperatur spezifisch für das verwendete Enzym inkubiert. </li><li> Führen Sie eine unverdaute Probe zusammen mit dem verdauten Proben auf der gleichen Zeile einer 2% igen Agarosegel zubeobachten die genetische Veränderung durch die RNA-Darm-Trakt des RNA-haltigen Oligo (Abbildung 3) übertragen. </li><li> Purify PCR-Produkte durch Verwendung eines PCR-Purification Kit und bereiten sie für die DNA-Sequenzierung. Submit Proben für die Sequenzierung mit dem gleichen Primer verwendet, um ein Produkt zu verstärken. </li><li> Analysieren Sie die DNA-Sequenzierung Ergebnisse mit Software, die Ausrichtung von mehreren Sequenzen mit einer ausgewählten Referenz-Sequenz (Abbildung 4) ermöglicht. </li></ol> E. Alkalibehandlung der RNA-haltigen Oligo (Abbildung 5) <ol><li> Für jede Reaktion add 1 nmol (4 ul von 250 pMol / ul Stammlösung) der RNA-haltigen Oligo-oder DNA-Oligo in ein 1,5 ml-Tube. </li><li> Add 4 ul 1 M NaOH für die Hydrolyse, oder alternativ add 4 ul H 2 O als negative Kontrolle, und inkubieren Sie bei 65 ° C im Wasserbad für 1 h Dann aus dem Wasserbad, um Eis zu bewegen. </li><li> Neutralisieren mit 2 ul von 1,2 M HCl, 4 ul 1 M Tris-HCl und 4 ul H 2 O, oder alternativ 6 ul H 2 O und 4 ul 1 M Tris-HCl für negative Kontrolle. Keep on ice bis Transformation. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des defekten trp5 Gens und des TRP5 Allel durch die RNA-haltigen Oligo korrigiert. A) Die trp5 mutierte Gen enthält einen 2-base-Deletion (schwarze Dreiecke) und 1-Basis Nonsense-Mutation (Stern). Die einsträngige RNA-haltigen Oligo mit 2-base Insertion (blaue Schleife) und 1-RNA Basenaustausch (rotes Rechteck) Erzeugen eines Van91 ich Restriktionsenzymstelle (dargestellt durch die Klammer) wird in Hefezellen transformiert, um die genetische Defekte zu korrigieren der trp5 Gen. B) Nach dem TRP5 Gen durch die RNA-haltigen Oligo (korrigiert Basen sind als blaue Rechtecke gekennzeichnet) repariert wird, ist die Van91 I-Stelle in die TRP5 Gen erzeugt. A 278 bp-Fragment mit nur einem Van91 I Restriktionsschnittstelle in TRP5 Gen PCR durch ein Paar von Primern (P1 und P2) verstärkt. Die 177 bp und 101 bp Fragmente nach Aufschluss der P1-und P2-PCR-Produkt von Van91 generiert I sind ebenfalls dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Transformation Ergebnis mit der RNA-haltigen Oligo. A) Hefezellen ohne Oligo verwandelt bilden keine Kolonie auf dem SC-Trp Medium, siehe Platten ab. B) Die Platten cg zeigen Hefekolonien wachsen auf SC-Trp nach Zellen mit 1 nmol der RNA-haltigen Oligo umgewandelt. C) Platten hl zeigen Hefekolonien wachsen auf SC-Trp nach Zellen mit 1 nmol der entsprechenden DNA-only Kontrolle Oligo umgewandelt. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Detektion von genetischen Information Transfer vom RNA-haltigen Oligo Hefe chromosomale DNA durch Restriktionsverdau des PCR-Produktes verstärkt die gezielte genomischen Region. 2% Agarosegelelektrophorese von PCR-Proben, die durch P1 und P2 verstärkt und verdaut mit Van91 I Restriktionsenzym. Spuren 1, 8 und 15, DNA-Leiter mit Größen von 100, 200, 300, 400 und 500 bp angegeben auf der linken Seite; Spur 2, PCR-Produkt von trp5 locus von der genomischen DNA des trp5 Mutante verstärkt; Spur 3, PCR Produkt aus genomischer DNA aus einer Trp + Kolonie durch die DNA-Oligo nur gezielt abgeleitet verstärkt, Spur 9 bis 14, Van91 I Restriktionsverdau, Spur 4-7, PCR-Produkte von genomischer DNA aus Trp +-Kolonien durch die RNA-haltigen Oligo gezielt abgeleitet verstärkt der PCR-Produkte von Bahnen 2 bis 7. Die Präsenz der uncut-PCR-Produkt-Bands in den Bahnen 10 bis 14 können durch partielle Verdauung durch Van91 ich am TRP5 Locus (CCACATTCTGG) erläutert. In Anbetracht, dass die Schneiden Website für Van91 I (CCANNNN NTGG) können mehrere Sequenzen haben, kann die Seite in TRP5 erzeugt nicht die optimale Ziel für das Enzym. In der Tat, nach DNA-Sequenzierung aller oben genannten PCR Produkte, die wir erkennen keine weiteren Änderungen über die von der Oligos durchgeführt (siehe Abbildung 4). Die 278 bp PCR-Bande von P1 und P2-Primer und die Verdauung Produkt-Banden durch Van91 verstärkt I von 177 bp und 101 bp sind durch die Pfeile auf der rechten Seite angezeigt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 4Thumb" /></a> Abbildung 4. DNA-Sequenzierung Ergebnisse zeigen Gen-Korrektur durch die RNA-haltigen Oligo. A) DNA Elektropherogramm der genomischen Region des RNA-haltigen Oligo ausgerichtet. Das G in der DNA-Sequenz (blau boxed) leitet sich von der RG auf der RNA-haltigen Oligo. Auch boxed ist das Einsetzen der CG Basen. Sequencing Ergebnisse aus allen anderen PCR-Produkte werden auch als clear wie dieses, mit fluoreszierenden Signale weit über dem Hintergrund. B) Sequenzen der TRP5 Region des Trp + Transformanten durch die DNA-only Oligo (T1) und der RNA-haltigen Oligo (T2-T5) entsprechen in der Konsensus-Sequenz auf dem Gipfel zielgerichtet und sind mit denen der trp5 mutierten Zellen im Vergleich vor Targeting durch die Oligos (Genomic DNA, rot schattiert). Die Reparatur-RNA-haltigen Oligo auf der Unterseite hat zwei-base DNA-Insertion und einer-base (G) RNA-Substitution in rot markiert. Die Regionen boxed in blau mit gelben Farbton zeigen, dass die RNA-haltigen Oligo sowie die DNA-Oligo nur präzise korrigiert die Deletionsmutation und Nonsense-Mutation in allen getesteten Proben. Die gestrichelten Linien markieren die Position des RNA-haltigen Oligo-Sequenz. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Alkalibehandlung verhindert Gen Korrektur durch den RNA-haltigen Oligo. Die Transformation Frequenz durch die RNA-haltigen Oligo (R) in den roten Balken, und dass durch die DNA-only Oligo (D) ist in den blauen Balken angezeigt wird angezeigt. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwertes für 3 unabhängige Transformationen für jedes Oligo. Die DNA-only Oligo zeigt ähnliche Transformation Frequenz ohne und mit NaOH-Behandlung. Anders fällt Transformation Frequenz durch die RNA-haltigen Oligo auf 0 nach der Behandlung mit NaOH. Daher ist die Vorbereitung mit der RNA-haltigen Oligo nicht mit DNA-Oligo nur verunreinigt, so ist die beobachtete Umwandlung Frequenz spezifisch für den RNA-haltigen Oligo.

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	<li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+DNA+repair.">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li><li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast.">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li><li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair.">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li><li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+H:+the+enzymes+in+eukaryotes.">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li></ol>

Die Videoproduktion für diesen Artikel wurde von Thermo Fisher Scientific, die Reagenzien und Instrumenten in dieser Publikation verwendeten produziert gesponsert.

Die Tatsache, dass RNA kann genetische Information direkt zu übertragen, um genomische DNA in Zellen entdeckt wurde Ausnutzung der Verwendung von synthetischen RNA-haltigen Oligos (Dharmacon synthetisiert Oligos) 1. Es war der proof of principle, dass die Zellen RNA-Moleküle oder RNA-Sequenzen nur als Vorlagen für die DNA-Synthese verwendet werden kann. Die Verwendung von RNA-haltigen Oligos nicht nur um die Demonstration führte, dass genetische Informationen direkt aus RNA übertragen werden, um genomische DNA, ohne die Notwendigkeit eines Reverse Transkription DNA-Kopie Zwischen-, sondern auch der Beweis, dass RNA als homologe Vorlage kann in eingesetzt werden die Reparatur eines DNA-Schäden 1,3. Die Oligos kann der RNA-only gemacht werden oder enthalten nur eine einzige Ribonukleotid in eine DNA-Sequenz eingebettet, wie in dem Beispiel haben wir hier vorgestellt. Die RNA-haltigen Oligo hat einen eingebetteten Ribonukleotid entwickelt, um die Nonsense-Mutation in der genomischen defekte trp5 Allel zu korrigieren. Die Übertragung der genetischen Information von der Ribonucleotid der genomischen DNA wird durch eine Änderung im Phänotyp (Zelle wächst auf dem Medium ohne Tryptophan) der Zielzellen enthüllt. Die Frequenz von Gen-Korrektur mit der RNA-haltigen Oligo wird gemessen und verglichen mit einer Kontroll-DNA-only-Oligo. Mit der Durchführung dieses Gen-Korrektur-Assay in verschiedenen Zell-Hintergründe, wo wir zu mutieren verschiedenen Hefe-Gene, können wir erkennen, welcher Faktor / s speziell beeinflussen gezielt durch die RNA-haltige Oligos. So können wir zeigen, Mechanismen, wie Zellen die Stabilität der RNA / DNA-Hybride zu regulieren. Durch einfaches Design verschiedene Varianten der RNA-haltigen Oligos können wir die Wahrscheinlichkeit für eine bestimmte RNA-Darm-Trakt als Vorlage in DNA-Modifikation dienen festzustellen, und wir können die Stabilität der RNA-Sequenzen in DNA eingebettet zu bestimmen. Darüber hinaus können wir erkennen, was sind die bevorzugten in vivo Substrate für Faktoren der Interaktion mit RNA / DNA-Hybride. Während einige in-vitro-Studien, vor allem unter Verwendung von kurzen RNA-haltigen Oligos, wurden durchgeführt, um die Funktion von Faktoren, die RNA in eine hybride erkennen kann, mit DNA, wie die RNase H Enzyme 4, die in vivo Funktionen von RNasen H sowie Charakterisierung wie die Identität von anderen Proteinen, die Auswirkungen auf RNA / DNA-Hybrid Stabilität bleiben meist unbekannt könnten. Die Möglichkeit zu nutzen RNA-haltigen Oligos, die eine beträchtliche Länge (50 bis 80-mere) und optimale Qualität (z. B. Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligos) hat die Art und Weise zu untersuchen, ein breites Spektrum an molekularen Prozesse direkt in vivo in der offenen Zellen von Interesse. Wie in diesem Video, Transformation gezeigt mit RNA-haltigen Oligos erfordert im wesentlichen nur ein paar zusätzliche Schritte im Vergleich zu Transformation mit DNA-Molekülen, den Abbau durch RNasen zu verhindern. So kann die Transformation unter Verwendung von RNA-haltigen Oligos ist nicht auf die Hefe-System beschränkt, sondern auf jeden Organismus oder Zelltyp, wo Transformation von DNA Oligos beherrscht angewendet werden. Abschließend gezielt Zellen durch RNA-haltigen Oligos bietet die Möglichkeit, RNA / DNA-Hybride und Ribonukleotiden in DNA in vivo in Zellen eingebettet zu generieren. Die Stabilität, Funktion und Folgen dieser in vivo generierten RNA / DNA-Hybride können analysiert und charakterisiert werden, die möglicherweise die Aufdeckung unbekannter Mechanismen der DNA-Reparatur und aufschlussreiche neue Strategien für die Gen-Targeting.

A. Transformation Reagenzien und Medien (modifiziert nach Storici und Resnick, 2006 <ol><li> YPD (Yeast Peptone Dextrose): Für 1 L, 10 g Hefeextrakt, 20 g Soja-Pepton, 20 g Dextrose. Fügen Sie 15 g Agar auf YPD festen Medien zu machen. Autoclave vor dem Gebrauch. Lagerung bei Raumtemperatur. </li><li> Lösung 1: 0,1 M Lithium-Acetat. Bereiten Sie unmittelbar vor dem Wandel. Lösung 1 ist eine funktionierende Lösung, so ist es direkt aus dem Pulver hergestellt. Keine Stammlösung hergestellt wird. Halten Sie bei Raumtemperatur. LiAc erhöht die Hefezellwand Permeabilität für DNA. </li><li> Lösung 2: 0,1 M Lithium-Acetat und 50% Polyethylenglykol 4000. Auch die Lösung 2 ist eine funktionierende Lösung, und es ist direkt aus dem Pulver hergestellt. Keine Stammlösung angesetzt. Halten Sie bei Raumtemperatur. PEG Ablagerungen Oligos auf Hefezellen. </li><li> RNA-haltige Oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50 bis 80-mers, entsalzt, entschützt und nicht gereinigt. Resuspendieren und 250 pMol / ul. Lagerung bei -80 ° C. </li><li> DNA-Oligos nur, 5-80-mers, entsalzt und nicht gereinigt. Resuspendieren und 50 pMol / ul. Lagerung bei -20 ° C. </li><li> SC-Trp (Synthetic komplette Medien fehlt Tryptophan) festen Medien. </li><li> 0,5 cm Durchmesser Glasperlen, durch Autoklavieren sterilisiert. </li><li> RNase-off: RNase-Dekontamination Lösung. </li><li> DNase / RNase-frei, sterile Zentrifugenröhrchen. </li><li> DNase / RNase-frei, sterile konische Rohre. </li><li> DNase / RNase-frei, steril Aerosol Pipettenspitzen mit ZAP: 1-200 ml, 100-1000 ml. </li></ol> B. Colony PCR Materialien. <ol><li> DNA-Primer, entsalzt und nicht gereinigt. Man löst in sterilem Wasser auf 50 pMol / ul. Lagerung bei -20 ° C. </li><li> Taq DNA Polymerase, Puffer, dNTPs. </li><li> PCR-Röhrchen. </li></ol> C. PCR-Aufreinigung. <ol><li> PCR Purification Kit. </li></ol> D. Gel-Elektrophorese. <ol><li> Agarose. </li><li> 1 x TBE-Laufpuffer (45 mM Tris-Borat und 1 mM Ethylendiamintetraacetat) ab 10x TBE verdünnt. </li><li> Prestained Molekulargewichtsmarker. </li><li> DNA Loading Dye. </li></ol> E. Restriktionsverdau. <ol><li> Restriktionsenzyme, 10x Puffer, BSA. </li></ol> F. Alkalibehandlung für die RNA-haltigen Oligo. <ol><li> 1 M NaOH-Lösung. </li><li> 1,2 M HCl-Lösung. </li><li> 1 M Tris-HCl, pH 7,4 Lösung. </li></ol>

generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides

Synthetische kurzen Nukleinsäure-Polymere, Oligonukleotide (Oligos), sind die funktionellen und weit verbreitete Methoden der Molekularbiologie. Oligos erzeugt eine beliebige DNA-oder RNA-Sequenz enthalten sein und kann bereit sein, eine Vielzahl von Basis-und Zucker-Modifikationen zählen werden. Darüber hinaus können Oligos entwickelt, um spezifische Nukleinsäure Veränderungen imitieren und damit als wichtige Werkzeuge dienen dazu, Auswirkungen von DNA-Schäden und Mechanismen der Reparatur zu untersuchen. Wir fanden, dass Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligos mit einer Länge zwischen 50 und 80 Nukleotiden kann besonders geeignet um zu studieren, in vivo, Funktionen und Folgen der chromosomalen DNA / RNA-Hybriden und der Ribonukleotiden zu DNA eingebettet. RNA / DNA-Hybride können leicht während der DNA-Replikation,-Reparatur und Transkription zu bilden, aber sehr wenig über die Stabilität der RNA / DNA-Hybride in den Zellen und in welchem ​​Umfang diese Hybriden kann die genetische Integrität der Zellen beeinflussen bekannt. RNA-haltige Oligos, daher stellen eine perfekte Vektor Ribonukleotiden in die chromosomale DNA einzuführen und erzeugen RNA / DNA-Hybride der gewählten Länge und Basenzusammensetzung. Hier präsentieren wir Ihnen das Protokoll für die Aufnahme von Ribonukleotiden in das Genom der eukaryotischen Modellsystem Hefe / Saccharomyces cerevisiae /. Dennoch hat unser Labor genutzt Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligos an RNA / DNA-Hybride bei der chromosomalen Ebene in verschiedenen Zellsystemen zu generieren, von Bakterien bis zu menschlichen Zellen.

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Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Diese Arbeit zeigt, wie ein RNA / DNA-Hybrid bei der chromosomalen Ebene bilden und zeigen Übertragung der genetischen Information von RNA, um genomische DNA in Hefezellen.

Generierung von RNA / DNA-Hybride in genomischer DNA durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

generation-rnadna-hybrids-genomic-dna-transformation-using-rna

Research

JoVE Journal

Biology

26.7K Aufrufe.  Georgia Institute of Technology. Diese Arbeit zeigt, wie ein RNA / DNA-Hybrid bei der chromosomalen Ebene bilden und zeigen Übertragung der genetischen Information von RNA, um genomische DNA in Hefezellen.

Serie: Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Forschung

Biologie

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mit dem Hitzeschock-Methode

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomic MRI - eine öffentliche Ressource für ein Studium Sequence Patterns in genomischer DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

Genomic Transformation des Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...