Diese Arbeit wurde von Seed-Fonds von der University of Pittsburgh und NIH AG028977 zu ALF unterstützt

Überblick Traditionell transgenen Würmer wurden durch Mikroinjektion transgene DNA in die C erzeugt elegans Keimbahn 1,2,3,4. Während erfolgreich, benötigt dieser Ansatz spezialisierte Ausrüstung und der Entwicklung von Erfahrungen mit Wurm Anatomie und Mikroinjektionstechnik. In jüngerer Zeit biolistischen Bombardement als ein alternativer Ansatz, die DNA-beschichtete Goldpartikel verwendet, um Fremd-DNA in die Keimbahn 5,6 einführen entwickelt worden. Dieser Ansatz erfordert weniger Zeit Investitionen in Bezug auf die Praxis erfolgreich zu werden. Die biolistischen Bombardierung von C. elegans, um transgene Würmer erzeugen eine geringe Effizienz auf der Ebene der einzelnen Wurm so Erfolg erfordert eine große Menge von Tieren. Diese können auf verschiedene Arten angebaut werden, aber wir verwenden Ei Platten, die Arbeit und die Anzahl der Platten zu reduzieren. Unser Protokoll beginnt mit der Herstellung von Eiprodukten Platten und Würmer und konzentriert sich dann auf die Bombardierung Protokoll unter Verwendung des Bio-Rad PDS-1000/He Hepta System. Wir angepasst unserem Protokoll zum Teil von der Arbeit der Berezikov et al 7. Mit Bombardements ist die unc-119-Gen in der Regel als ein Marker für transgene Tiere eingesetzt. Worm Stämme, die diese Mutation sind stark unkoordiniert und kaum bewegen können, sind in Aussehen pummelig, und sind unfähig, dauer Larven 8 zu bilden. Die Dauer ist eine alternative Larvenstadium, die zur Entwicklung einer reproduktiven erwachsenen Verzögerung unter widrigen Umständen ist, und der Einstieg in dauer wird durch mehrere Gene 9 geregelt. Mehrere Stämme, die das unc-119-Gens aus dem C. verfügbar elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). Die ursprüngliche DP38 Stamm (unc-119 (ed3)) führt auch eine unabhängige dauer-Bildung konstitutiv (daf-c)-Mutation, die stromabwärts Experimente beeinträchtigen könnten. Mehrere Labors haben diese Mutation outcrossed und HT1593-Stamm ist von der CGC. Wir finden, dass transgene Tiere sind etwas leichter zu identifizieren mit dem DP38-Stamm und neigen dazu, diesen Stamm für die Schaffung transgener Tiere zu verwenden. Wenn nötig, verwenden wir HT1593 zu den transgenen Würmern outcross die daf-c-Mutation zu entfernen. Getting die DP38 Würmern zu wachsen ist eine der langsamsten Schritte in das Protokoll, so dass wir einen Bestand von wachsenden Platten zu halten, während der Vorbereitung der Transgene. Expression des unc-119-Marker zusammen mit dem Gen von Interesse ermöglicht eine einfache Kennzeichnung der Tiere zum Ausdruck des Transgens auf Rettung der normalen Beweglichkeit und Körpergröße 5 basierend. Die unc-119-Gen kann aus mehreren Quellen, und Vektoren mit dem unc-119 genomische DNA, unc-119-Promotors und cDNA und die genomische DNA für die kleineren C erhalten werden briggsiae Gen 8,10 verwendet. Wir berichteten kürzlich über ein einfaches Protokoll, um einen UNC-119 Kassette keine Plasmid eine Ampicillin-Resistenz-Gen durch homologe Rekombination 11 und eine Methode zur Wurm Fosmide ändern, um die unc-119-Gens durch Cre-lox Rekombination führen zu generieren transgenen Tieren 12 merken. Die Plasmide werden aus Addgene Inc. (Cambridge, MA) zur Verfügung. Während der Aufwand bei der Durchführung einer einzigen Bombardierung beteiligt ist erheblich, aber tragbar, ist die zusätzliche Arbeit bei der Durchführung mehrerer Bombenangriffe an einem einzigen Tag beteiligt minimal. Folglich haben wir routinemäßig Cluster der Produktion von transgenen Würmer, die Arbeit bei der Erzeugung jeder einzelnen beteiligten verringern. 1. Egg Platte Vorbereitung Die unc-119 mutierten Würmer sind schwer zu Standard NGM-Platten, weil mit ihrer gehbehinderten sie neigen dazu, auf Teile einer Platte verhungern, während andere Teile der Platte enthalten noch Nahrung anzubauen. Egg-Platten dieses Problem zu lösen, wie die dicke Schicht auf Lebensmittel Ei Platten ermöglicht unc-119 Würmer leichter kriechen und über die ganze Platte 7 zu nehmen. Das Ei Platten haben auch den Vorteil der Unterstützung des Wachstums von einer großen Anzahl von Würmern so weniger Platten 13 erforderlich sind. In der Regel 5 Eier Platten sind ausreichend, um Würmer für eine Bombardierung zu wachsen. Das folgende Rezept macht etwa 50 Platten können aber halbiert, um weniger, wenn gewünscht. Das Ei Platten können sich leicht verschmutzt, so dass wir beide Antibiotika und Antimykotika Verwendung in den Platten und verwenden Sie nur Eier von Hypochlorit-Behandlung für die Aussaat der Platten erzeugt. Tag 1: <ol><li> Bereiten LB (400 ml) in einer 500ml Flasche. Autoklaven für 20min. </li><li> Gießen ~ 50 10 cm NGA-Platten mit 1 Liter NGA mit 2% Agar. Wir fügen Nystatin 10 mL pro Liter und Streptomycin zu 200 pg / mL 13. </li><li> Wachsen ein 40 ml Übernachtkultur von OP50-1 in LB mit 200 pg / ml Streptomycin. Diese Sorte ist resistent gegen Streptomycin und erhältlich bei CGC. </li><li> Autoclave einer 500ml Flasche füram nächsten Tag. </li></ol> Tag 2: <ol><li> Separate Eigelb von 10 Hühnereiern in die sterile Flasche. Wir verwenden ein Eigelb-Separator (erhältlich bei Haushalts-Stores, darunter Target). Shake. </li><li> Bringt Volumen 400mL mit LB. Schütteln </li><li> Inkubation bei 60 ° C für 1 Stunde. </li><li> Auf Raumtemperatur abkühlen. </li><li> Fügen Sie 40ml OP50-1. Schütteln </li><li> Verteilen Sie 5-8 ml der Mischung pro Platte. </li><li> Lassen Platten über Nacht bei Raumtemperatur zu regeln. </li></ol> Tag 3: <ol><li> Vorsichtig abgießen restliche Flüssigkeit aus Platten. Lassen Sie sich mit Deckeln auf dem Trockenen über Nacht bei Raumtemperatur. </li></ol> Tag 4: <ol><li> Put-Platten in einem Karton oder Plastikbeutel und lagern bei 4 ° C bis zum Gebrauch. Diese Platten zu sein scheinen OK für 1-2 Monate verwenden. </li></ol> 2. Seeding Egg-Platten <ol><li> Erweitern Sie die DP38 Würmer auf 6 cm NGA Platten durch Zugabe von konzentrierter OP50 bis vor kurzem verhungert Platten. Für einen einzigen Bombardierung, verwenden wir ~ 6 kleine Teller, Saatgut 5 Eier Platten. Bei mehreren Bombardements, verwenden wir die kleinen Platten, anstatt Samen 2 angereichert Pepton Platten vor der Aussaat das Ei Platten. </li><li> Isolieren Sie Eier aus dem DP38 Würmer über die Verwendung von Hypochlorit 13,14. Resuspendieren die Eier in sterile S-basale oder M9-Puffer 13,14. </li><li> Fügen Sie die Eier (&gt; 10.000 pro Platte), um die entsprechende Anzahl von Ei-Platten. Wachsen die Würmer auf Ei-Platten bei 20 ° C für 7-10 Tage bis zur Bombardierung verwenden. Die Platten werden sofort einsatzbereit, sobald die Würmer damit begonnen haben, die Nahrung von den Platten zu löschen. Diese Platten sind wirklich schwer zu hungern und immer für längere Laufzeiten wird Wurm Ausbeute zu verbessern. </li></ol> Beschuss Wir bereiten die Goldaktien vor der Zeit und halten Sie sie bei 4 ° C für den Einsatz gespeichert. Auch benötigt werden unbefleckt und gefleckt 10 cm NGA-Platten. Die unbefleckt Platten müssen im Voraus gegossen werden und gut trocknen, um die Absorption der Flüssigkeit mit den Würmern aufgenommen zu erleichtern. Am Tag des Bombardements, waschen wir aus den Würmern zuerst, dann beginnen die Vorbereitung der DNA-beschichtete Goldpartikel. Wir fügen Sie dann die Würmer, die unbefleckt NGA Platten und Finish Waschen der Goldpartikel und ihre Übertragung auf die macrocarriers. Gold-Partikel der Zubereitung: <ol><li> Wiegen 60mg von Goldpartikeln in einem 1,7 ml Röhrchen und genießen in 70% Ethanol für 15min. Spin kurz zur Fällung der Goldpartikel. </li><li> 3 x waschen in sterilem Wasser und Spin jedes Mal kurz, um das Gold zu sammeln. </li><li> Resuspendieren Gold in 1 ml 50% sterilem Glyzerin. Dies ist das Lager Goldpartikel Lösung und kann über Monate bei 4 ° C gelagert werden </li></ol> Worms: <ol><li> Float der DP38 Würmer aus dem Ei-Platten mit S-Basal-oder M9-Puffer und Übertragung auf einen 50 mL konischen Rohr. </li><li> Halten Sie die Rohre auf der Bank, bis die Würmer im Boden sind. Dann saugen Sie den Puffer und fügen neue S-Basal-oder M9. Wash 2 oder 3 mal, bis Puffer relativ frei von Schmutz. Halten Sie die Würmer auf diesen Schritt, bis die DNA-Beschichtung ist abgeschlossen. </li><li> Saugen Sie und lassen Sie ca. 2-3 ml von Würmern in Puffer pro Bombardement. Transfer in ein 10 cm unbefleckt NGA Platte auf Eis. Es ist wichtig, Minimierung des übertragenen Volumens als NGA Platte muss vollständig trocknen, bevor Beschuss. Achten Sie darauf, die gesamte Oberfläche der Platte mit den Würmern zu decken. </li><li> Lassen Platte auf Eis trocken. Das Eis wird die Würmer aus Verklumpung beim Trocknen zu verhindern. </li></ol> Dieser Schritt ist wichtig: die Platte sollte trocken sein und die Würmer gleichmäßig verteilt auf der NGA Platte. Keeping the Würmer auf Eis verhindert, dass sie Bewegung auf der Platte und Aggregation in Stapel. DNA-Präparation (für ein Bombardement): <ol><li> Mix in einem 1,7 ml Tube: <ul><li> 50 ul Goldpartikel. Resuspendieren gründlich, bevor Sie. </li><li> 50 ul DNA (10-15ug). Wir sehen kaum einen Unterschied zwischen kreisförmigen oder linearen DNA. Normalerweise verwenden wir Qiagen Midiprep Patronen für DNA-Aufreinigung (Qiagen Inc., Valencia, CA). </li><li> 50 ul 2,5 M CaCl 2. Diese Lösung wird für mehrere Wochen bei Raumtemperatur stabil. </li><li> 20 &amp;mgr; l 0,1 M Spermidin. Die Spermidin ist instabil in wässriger Lösung. Wir machen 70μl Aliquots Spermidin und bei -20 ° C. Wir fügen Sie dann 1ml Wasser direkt vor verwenden, um eine 0,1 M Lösung zu erhalten. Diese Lösung muss bereit sein für jedes Bombardement frisch. Wir in der Regel Wirbel die Goldpartikel in einem 1,7 ml Röhrchen mit einer niedrigen Geschwindigkeit und fügen Sie dann die CaCl 2, DNA und Spermidin / Protamin tropfenweise unter Vortexen. Für die Menschen, die mit Kalziumphosphat transfiziert haben diese Technik vertraut ist. Wir haben auch Protamin verwendet anstelle von Spermidin mit sehr guten Ergebnissen 15. Wir bereiten eine neue Lösung (1mg/ml) in Wasser und unse 50 ul statt der 20 &amp;mgr; l von Spermidin. Wenn wir Protamin verwenden wir in der Regel inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 10 Minuten statt der Platzierung auf dem Eis. Protamin muss nicht eingefroren werden und ist ein Pulver, statt einer Flüssigkeit. </li></ul></li><li> Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 30 Minuten, und in regelmäßigen Abständen mischen, um die Gold-Partikel in der Schwebe zu halten. Dann kurz Spin und saugen Sie den Überstand. </li><li> Waschen mit 300μl 70% Ethanol. Spin kurz. </li><li> Waschen mit 1 ml 100% Ethanol. Spin kurz. </li><li> Resuspendieren in 170μl 100% Ethanol. </li></ol> Vorbereitung der macrocarriers: <ol><li> Spülen 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) in 2-Propanol. Setzen Sie sie auf Seidenpapier und lassen Sie sie bei Raumtemperatur trocknen. </li><li> Add 20 &amp;mgr; l des DNA / Gold-Mischung in der Mitte eines jeden Macrocarriers. Achten Sie darauf, Wirbel rechts vor dem Pipettieren, um das Gold in der Schwebe zu halten. </li><li> Lassen Sie das Ethanol verdampfen. </li></ol> 3. Beschuss Achten Sie darauf, einen leeren Bombardements durchzuführen, bevor das Experiment zu Helium durch das System zu spülen. <ol><li> Schalten Sie Vakuumpumpe und schließen Vakuumpumpe Falle. Wir verwenden eine ölfreie Vakuumpumpe. </li><li> Schalten Sie Heliumtank. Überprüfen Sie, dass der Druck ≥ 2200psi. </li><li> Wet Berstscheibe (1350 psi) in 2-Propanol, indem in Haltekappe für Hepta-Adapter. </li><li> Schraubadapter in PDS-1000-System, und ziehen Sie mit dem mitgelieferten Drehmomentschlüssel. </li><li> Legen Sie die 7 macrocarriers in die Halterung und Sitz sie mit dem mitgelieferten Tool. Dann eine hepta Stop-Bildschirm und unten auf den Inhaber. Klappen Sie den Halter über Ort und auf dem zweiten Regal von oben. Das Gold entdeckt Seite des macrocarriers muss unten an dieser Stelle. </li><li> Richten Sie die Löcher in der Spitze der Macrocarriers Halter mit den Ausgängen des Hepta-Adapter. </li><li> Setzen Sie den NGA-Platte mit Würmern (Deckel) auf der untersten Regal im Bombardement Kammer beschichtet. </li><li> Völlig offen das Vakuum Durchfluss-Knopf auf der PDS-1000. Presse vac-Taste, bis Kammer erreicht 26 In Hg. Dann Schalter auf Position, um das Vakuum zu halten halten. </li><li> Drücken und halten Sie den Feuerknopf, bis die Scheibe reißt. Dies wird geschehen, wenn der Druck erreicht 1350psi. Manchmal dauert 5-20 Sekunden auftreten. Lassen Sie die Taste. </li><li> Release-Vakuum Kammer (vent-Position), und entfernen Platte. </li><li> Schalten Vakuum und Helium aus. </li><li> Feuer mehrere Male, bis die Zeile nicht enthält Helium (Helium-Meßgerät sollte 0 psi-Zeichen). </li><li> Schalten Sie den PDS-1000-System. </li></ol> Worm Erholung nach der Bombardierung: <ol><li> Verlassen Sie die bombardiert Platte bei 20 ° C für 20 Minuten. </li><li> Float die Würmer von der Platte mit 10 ml S-Basal-oder M9-Puffer. </li><li> Legen Sie 0,5 ml Würmer auf 20 bis 10 cm gesichtet NGA-Platten. </li><li> Lassen Sie bei 20 ° C oder bei Raumtemperatur (22-24 ° C) für ca. 2 Wochen vor dem Einchecken für gerettete Würmer. </li><li> Bildschirm für Würmer mit dem unc-119 (+)-Phänotyp mit einem Binokular. Der optimale Zeitpunkt für das Screening ist nach dem Platten verhungert, da die Rettung Würmer Überlebensvorteil gegenüber nicht gerettet Würmer haben. </li><li> Generieren Sie eine einzelne Zeile aus jeweils 10 cm Platte, die gerettet Würmer enthalten. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Der Erfolg des Protokolls im Hinblick auf den Erhalt transgenen Tieren hängt von der jeweiligen Transgens. Für Promoter: GFP-Reporter Transgene haben wir bis zu 20 Zeilen erhalten. Ein typisches Ergebnis ist 3-10 Zeilen. Bis zu 30% der transgenen Linien integriert sind Linien, aber dies ist zufällig, und wir werden mehrere Bombardements an einem einzigen Tag durchführen, wenn eine integrierte Linie besonders erwünscht ist.

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Biolistic Bombardement ist eine einfache Methode, um Fremd-DNA in vielen Organismen einzuführen, einschließlich C. elegans 1,5,6,7,16. Es stützt sich auf Goldpartikel Bildung eines Komplexes mit DNA in Gegenwart von CaCl 2. Kationische Polyamine wie Spermidin, schützen DNA aus Nucleaseabbau in vivo. Da Spermidin ist ein instabiles Molekül, ist es wichtig, sie in kleinen Portionen bei -20 ° C, und nehmen Sie die Lösung direkt vor der Durchführung des Bombardements. Wie wir in der Bo...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Gold particles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Inbio gold</td>
<td>BD021</td>
<td>1micron</td>
</tr>
<tr>
<td>Midiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S4139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td> P4505</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macrocarriers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2335</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDS-1000/He Hepta System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2257</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rupture disk</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2330</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nystatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N1638</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP</td>
<td>100556</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of transgenic c. elegans by biolistic transformation

Die Anzahl der Laboratorien, die die frei lebenden Nematoden C. elegans wächst rasant. Die Popularität dieser biologischen Modell ist eine schnelle Erzeugung und kurze Lebensdauer, einfache und kostengünstige Wartung, vollständig sequenzierten Genoms und Array von RNAi Ressourcen und mutierten Tieren zugeschrieben. Zusätzlich Analyse der C. elegans Genoms ergab eine große Ähnlichkeit zwischen Würmern und höheren Wirbeltieren, die die Forschung in Würmer könnten eine wichtige Ergänzung zu Studien in ganze Mäuse oder kultivierten Zellen durchgeführt werden, schlägt. Ein leistungsfähiger und wichtiger Bestandteil der Wurm Forschung ist die Fähigkeit, transgene Tiere zu verwenden, um Gen-Lokalisation und Funktion zu untersuchen. Transgene Tiere können entweder über Mikroinjektion der Wurm Keimbahn oder durch den Einsatz von biolistischen Bombardement erstellt werden. Bombardment ist eine neuere Technik und weniger vertraut ist, eine Reihe von Laboren. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, um transgene Würmer biolistischen Beschuss mit Goldpartikeln mit dem Bio-Rad PDS-1000-System zu generieren. Im Vergleich mit DNA-Mikroinjektion in Hermaphrodit Keimbahn, hat dieses Protokoll den Vorteil, dass keine besonderen Fähigkeiten des Betreibers im Hinblick auf die Identifizierung Wurm Anatomie oder die Durchführung Mikroinjektion. Weitere mehreren transgenen Linien sind in der Regel aus einer einzigen Bombardierung erhalten. Ebenfalls im Gegensatz zu Mikroinjektion, produziert biolistischen Bombardement transgene Tiere mit sowohl extrachromosomale Arrays und integrierte Transgene. Die Fähigkeit, integrierte transgenen Linien zu erhalten kann die Verwendung von mutagenen Protokolle Fremd-DNA zu integrieren. Zusammenfassend kann biolistischen Bombardement eine attraktive Methode für die Erzeugung von transgenen Tieren, vor allem für die Ermittler nicht in der Anlage der Zeit und den Aufwand, sich geschickt in Mikroinjektion interessiert.

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Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgene Würmer werden häufig in Verwendung<em&gt; C. elegans</em&gt; Forschung. Beschrieben wird eine einfache, aber effektive, Protokoll Transgene in Würmer mit biolistischen Bombardierung mit DNA-beschichteten Goldpartikeln einzuführen. Der Aufwand und die Ergebnisse der Bombardierung den Vergleich mit Mikroinjektion für die Erzeugung von transgenen Tieren.

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

generation-of-transgenic-c-elegans-by-biolistic-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

21.8K Aufrufe.  University of Pittsburgh. Transgene Würmer werden häufig in Verwendung C. elegans Forschung. Beschrieben wird eine einfache, aber effektive, Protokoll Transgene in Würmer mit biolistischen Bombardierung mit DNA-beschichteten Goldpartikeln einzuführen. Der Aufwand und die Ergebnisse der Bombardierung den Vergleich mit Mikroinjektion für die Erzeugung von transgenen Tieren.

Serie: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Forschung

Biologie

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

Paradigmen für pharmakologische Charakterisierung von C. elegans Synaptic Transmission Mutanten

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generierung von RNA / DNA-Hybride in genomischer DNA durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antikörperfärbung in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Mit der &quot;Freeze--Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

Die Züchtung<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; In Axenic Flüssige Medien und Erstellung von transgenen Worms durch Mikropartikelbeschuss

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Paradigmen für pharmakologische Charakterisierung von C. elegans Synaptic Transmission Mutanten

Generierung von RNA / DNA-Hybride in genomischer DNA durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden

Grundlegende

C. elegans Chemotaxis-Assay

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen

Antikörperfärbung in

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in

Die Züchtung

Erzeugung transgener