Die Arbeit in unserem Labor wird von CAREER-Preis MCB0551798 von der National Science Foundation und AREA gewähren R15GM86839 aus dem NIGMS-NIH unterstützt.

1. Wachstum und UV-Bestrahlung. <ol><li> 200 ul einer frischen Übernacht-Kultur, die das Plasmid pBR322 in Davis Medium 1 gewachsen mit 0,4% Glucose, 0,2% Casaminosäuren und 10 pg / ml Thymin (DGCthy mittel) und 100 ug / ml Ampicillin wird pelletiert. Das Zellpellet wird dann in 200 ul DGCthy Medium ohne Ampicillin resuspendiert und verwendet werden, um 20 ml DGCthy Beimpfen. </li><li> Kulturen sind ohne Ampicillin-Selektion in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C auf eine OD 600 von 0,5 (~ 5 x 10 8 Zellen / ml) gewachsen. Wachstum ohne Ampicillin verhindert Selektion gegen anormales oder unproduktive Replikation Zwischenprodukte, die in einigen Mutanten entstehen können. Darüber hinaus, wenn mit UV-Licht, um Schäden zu induzieren, ist die Entfernung des Ampicillin aus den Medien notwendig, weil es stark absorbiert bei diesen Wellenlängen und schirmt den Zellen, wodurch die effektive Dosis von UV. </li><li> Arbeiten unter gelb leuchtet, ist die Kultur in einem 15cm Durchmesser Petrischale auf einer rotierenden Plattform für Agitation gestellt. Unsere Kulturen sind in einem Abstand von einer 15-Watt-Entkeimungslampe, dass eine Exposition von ~ 1 J/m2/sec, die mit Hilfe eines UVC Photometer produziert platziert. Die Kulturen werden mit 50 J/m2 bestrahlt und dann sofort wieder in platziert das Schütteln 37 ° C Inkubator für die Dauer des Experiments. Diese Dosis produziert, durchschnittlich 1 Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer alle 4,5 kb von ssDNA. Die gelbe Beleuchtung verhindert Photoreaktivierung-Auflösung von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere durch Photolyase. </li></ol> 2. DNA Isolation. <ol><li> In Zeiten, in denen die Replikation Zwischenprodukte untersucht werden sollen, ist eine 0,75 ml Aliquot der Kultur in 0,75 ml eiskalter Net30 Puffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM EDTA) gegeben und auf Eis gestellt, bis zum Ende des den zeitlichen Verlauf. Wir starten üblicherweise eine 90-minütige zeitlichen Verlauf, wobei die Proben bei 0 untersucht, 15, 30, 45, 60 und 90 Minuten. Die EDTA und Kälte dienen, effektiv zu stoppen, Replikation und Nukleotidexzisionsreparatur reparieren. </li><li> Jede Probe wird dann pelletiert, resuspendiert in 150 ul von 1,5 mg / ml Lysozym und 0,2 mg / ml RNaseA in TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA), und lysiert bei 37 ° C für 20 min. Zu diesem Zeitpunkt werden 10 &amp;mgr; l Proteinase K (10mg/ml) und 10 &amp;mgr; l von 20% Sarkosyl zugegeben und die Inkubation läßt man 1 h weiter. Proteinase K und Sarkosyl Hilfe von DNA-Fragmenten, die mit der Membran oder Proteine ​​in Verbindung gebracht werden, bevor Phenolextraktion auftritt, kann loslassen. Seit aktiv replizierenden DNA wird oft Protein oder Membran-Komplexen gebunden ist, hilft diese Erhöhung der Ausbeute der Replikation Fragmente, die wiederhergestellt werden. </li><li> Die Proben werden dann durch Zugabe von 2 Volumen Phenol zu jeder Probe und die Rohre sind 5 Minuten lang vorsichtig invertiert extrahiert. Dann 2 Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (24 / 1) zugegeben und die Röhrchen werden vorsichtig wieder für 5 Minuten umgedreht. </li><li> Die Proben werden bei 14.000 rpm in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten und die obere wässrige Phase von jeder Probe zentrifugiert wird entfernt, und in ein frisches Röhrchen. Dann 4 Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (24 / 1) zugegeben, die Rohre sind 5 Minuten lang vorsichtig invertiert und erneut zentrifugiert bei 14.000 rpm für 5 Minuten. </li><li> Die obere, wässrige Phase in jeder Probe wird dann für 1 Stunde mit dem Spotting 100 &amp;mgr; jeder Probe auf einem 47mm Whatman 0,025 um Pore Scheibe, die auf 250 ml 0,1 × TE schwimmt in einem Becherglas dialysiert. Da die Replikation Strukturen mit Einzelstrang Regionen oder Verzweigungspunkte anfälliger für Scheren sind wir in der Regel schneiden unsere Pipettenspitzen off mit einer Rasierklinge, um den Mund weiter und minimieren Scherkräfte. Im Allgemeinen sollte Pipettieren auf ein Minimum reduziert werden, bis nach dem DNA wurde mit Restriktionsenzymen verdaut worden. </li><li> Jede Probe wird dann mit PvuII (New England Biolabs), die das Plasmid linearisiert nur hinter den Replikationsursprung verdaut. </li><li> Vor dem Laden in das Agarosegel, 100 &amp;mgr; Chloroform und 20 &amp;mgr; l von 6X loading Farbstoff Bromphenolblau und Xylencyanol enthält, sind zu jeder Probe zugegeben und gemischt. Dann wird 40 ul der wässrigen Phase, welche die Be-Farbstoff in das Gel geladen. Zur Minimierung der strukturellen Verzerrungen, strukturelle Artefakte und DNA Scheren, macht diese Isolation Verfahren beinhalten keine Schritte, um für Einzelstrang Regionen, Niederschlag, oder konzentrieren sich die DNA-Proben nach Zell-Lyse zu bereichern. </li></ol> 3. 2D-Gel und Southern-Analyse. <ol><li> Die 2-dimensionalen Agarose-Gel-Analyse von 3 geändert. Für die 1. Dimension sind die eingeschränkten DNA-Proben durch ein 0,4% Agarosegel in 1x TBE bei 1V/cm laufen. Ein Liter 10x TBE-Stammlösung enthält: <ul><li> 108 g Tris Base </li><li> 55 g Borsäure </li><li> 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) </li></ul></li><li> Ein Lambda-Hind III Größenmarker in die erste Gasse geladen ist, dann Proben werden in jedem anderen Spur geladen. Wir starten üblicherweise die ersten dIMENSION ~ 12-15 Uhr. Skipping Gassen macht es einfacher, die Gassen Scheibe aus, um in die zweite Dimension gegossen. Die niedrige Spannung und geringe Prozent Agarosegel dient dazu, die DNA-Fragmente in erster Linie nach Größe aufgetrennt werden. </li><li> Für die zweite Dimension, sind Gelspuren aus der ersten Dimension Gel mit einem großen Fleischermesser in Scheiben geschnitten. Die erste Spur mit dem Lambda-Hind III Marker kann mit Ethidiumbromid angefärbt werden. Mit dem Lambda-Hind III Marker als Leitfaden, zuschneiden und entsorgen Sie die Region des Gels, die unten ist, wo das linearisierte Plasmid erwartet zu laufen. Unter diesen Bedingungen finden wir, dass linearisierte pBR322 läuft leicht über dem Xylencyanol Fleck. </li><li> Um warf die zweite Dimension ist jede Spur horizontal am oberen Rand eines leeren Gel Caster platziert. Eine Lösung von 1,0% Agarose in 1X TBE wird hergestellt und auf 55 ° C abgekühlt Zu diesem Zeitpunkt ist die Gel-Lösung in gegossen, um die zweite Dimension gegossen, so dass Sie vollständig abdecken Gelscheiben. Nachdem das Gel ausgehärtet ist, wird es bei 6.5V/cm in einer Elektrophorese-Einheit, dass der Puffer zu zirkulieren lässt laufen. Wir starten üblicherweise die zweite Dimension ~ 5,5-7 Stunden. Die hohe Spannung und hohe Prozent Agarosegel effektiv trennt die DNA-Fragmente nach ihrer Form basiert, wie auch die Größe. Nichtlineare Formen laufen langsamer durch die zweite Dimension. </li><li> Nach der Elektrophorese wird das Gel wird dann in H 2 O gespült, zweimal in 400 ml 0,25 M Salzsäure für 15 Minuten, mit H 2 O gespült, und dann zweimal in 400 ml 0,4 M NaOH für 30 Minuten gewaschen. Die Säure wäscht dienen teilweise nick die DNA-Moleküle in kleinere Fragmente, die effizienter zu übertragen. Dieser Schritt ist notwendig aufgrund der Größe und ungewöhnlichen Formen der DNA-Replikation Zwischenprodukte. </li><li> Die DNA in den Gelen wird dann auf eine Hybond N + Nylon übertragen Membran 4. Wir verwenden eine rückläufige Alkali-Transfer-System mit 0,4 M NaOH. Kurz gesagt, sind zwei Blätter Löschpapier in 0,4 M NaOH getränkt auf einem großen Stapel Papierhandtücher gelegt. Die Nylonmembran wird auch in 0,4 M NaOH getränkt und platziert auf der Oberseite des Löschpapier. Das Gel wird dann vorsichtig oben auf dieser geschichtet, gefolgt von einem weiteren Stück Löschpapier, in der NaOH-Lösung benetzt. Schließlich ist ein langes Stück angefeuchtet Löschpapier über den oberen Schichten und seinen beiden Enden in ein Geschirr mit 1 L 0,4 M NaOH-Lösung als Docht dienen platziert. Wir in der Regel lassen die DNA-Transfer für 6-12 Stunden. </li><li> Die Nylonmembran wird entfernt, gewaschen 20-30 sec in 5X SSC-Puffer, und platziert in einer Hybridisierung Rolle Flasche mit 10.5ml Prähybridisierungslösung. Dann wird die Membran bei 42 ° C mit einer Rotation von mehr als 6 Stunden inkubiert. Prähybridisierungslösung: <ul><li> 5,0 ml Formamid </li><li> 0,5 ml 20% SDS </li><li> 2,5 ml 20X SSC * </li><li> 2,0 ml 50X Denhardt * </li><li> 0,5 ml Salmon Sperm DNA (10mg/ml) * Rezepte für SSC und Denhardt kann in 5 gefunden werden </li></ul></li><li> Während der Prähybridisierung Zeit ist 1 pg Plasmid pBR322 mit 32P durch Nick-Translation nach dem Protokoll von Roche mit alpha bezeichnet [32-P]-dCTP geliefert gekennzeichnet. Die radioaktiv markierten Sonde (100 &amp;mgr; l) wird durch Inkubation bei 98 ° C denaturiert für 10 Minuten in einem Schraubdeckel Mikrozentrifugenröhrchen, und dann sofort auf Eis gestellt. </li><li> Die denaturierte Sonde wird auf 5,9 ml Hybridisierungslösung, die enthält, hinzugefügt: <ul><li> 3,0 ml Formamid </li><li> 1,5 ml SSC </li><li> 1,0 ml H 2 O </li><li> 0,15 ml 50X Denhardt </li><li> 0,10 ml 20% SDS </li><li> 0,15 ml 10mg/ml Salmon Sperm DNA </li></ul></li><li> Die Prähybridisierungslösung ist aus der Rolle Flasche gegossen und die Hybridisierungslösung gegossen in. Die Walze Flasche wird dann an die 42 ° C Inkubator und gedreht von mehr als 12 Stunden zurück. </li><li> Die Hybridisierungslösung wird der Walze Flasche gegossen. Dann wird der Blot 4-mal für 20 Minuten gewaschen in die Rolle Flasche mit ~ 150 ml einer Waschlösung mit 0.5X SSC, 0,1% SDS bei 42 ° C mit Rotation. </li><li> Nach dem letzten Waschschritt wird die Membran auf ein Papiertuch gelegt, bis die Flüssigkeit sichtbar verschwunden ist. Die Membran wird dann in Polyvinylchlorid Plastikfolie gewickelt und ausgesetzt zu einem Phosporimager Bildschirm. Wir visualisieren und zu quantifizieren, die Radioaktivität mit einem Sturm 840 und die damit verbundenen ImageQuant Software. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Plasmid-Replikation Zwischenprodukte bei der An-und Abwesenheit von UV-induzierten DNA-Schäden beobachtet. Die Migration Muster von PvuII verdaut pBR322 Plasmid durch 2D-Agarose-Gel-Analyse beobachtet wird grafisch dargestellt. Non-Replikation linearen Plasmide als lineare 4,4-kb-Fragment laufen. Replizierenden Plasmiden Form Y-förmige Strukturen, die langsamer als die nicht-replizierenden Fragmente aufgrund ihrer größeren Größe und keine Migrationnlinear Form. Diese Migration Muster bildet einen Bogen, der aus erstreckt sich von der linearen Bereich in Richtung des Brunnens. Nach UV-Bestrahlung, Doppel-Y-oder X-förmige Moleküle sind in der Kegel Region, die langsamer wandert als der Bogen der Y-förmige Moleküle beobachtet. Ein Beispiel für die Southern-Analyse der 2D-Gel sondiert mit 32P-markierten pBR322 ist für die Zellen unmittelbar nach UV-Bestrahlung und 15 Minuten nach UV-Bestrahlung (mit freundlicher Genehmigung des Verlags) gezeigt.

<ol>
	<li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin.">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li><li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli.">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li><li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis.">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li><li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences.">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning - A laboratory manual. , (2001).</li><li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli.">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li><li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli.">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li><li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli.">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li><li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork:+a+comparison+to+UV-induced+arrest.">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li><li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecBCD+and+RecJ/RecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli.">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li><li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions.">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li></ol>

Typische Ergebnisse aus Wildtyp-Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit von UV-induzierten Schäden sind in Abbildung 1 dargestellt. In Abwesenheit von Schäden, kann ~ 1% der gesamten Plasmid-DNA in der Y-Bogen gefunden werden, wenn die Zellen rasch wachsende in der exponentiellen Phase. Nach der Bestrahlung ist ein vorübergehender Anstieg der Y-förmige Moleküle beobachtet, wie blockiert Replikationsgabeln an geschädigten Stellen ansammeln. Die X-förmige Replikation Zwischenprodukte auch vorübergehend ansammeln und...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>An example of the Southern analysis of the 2D gel probed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE</td>
<td>G15T8</td>
<td>Yellow Lighting</td>
</tr>
<tr>
<td>15 &mu;watt germicidal lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sylvania</td>
<td>F20T12/GO</td>
<td>UV Lamp</td>
</tr>
<tr>
<td>Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Daigger</td>
<td>EF28195T</td>
<td>UVC photometer</td>
</tr>
<tr>
<td>0.025 &mu;m pore disks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>VSWP04700</td>
<td>Floating dialysis disks</td>
</tr>
<tr>
<td>PvuII</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>ER0632</td>
<td>Restriction Endonuclease</td>
</tr>
<tr>
<td>Nick-translation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>976776</td>
<td>To make 32P-labeled probe</td>
</tr>
<tr>
<td>Blotting Paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>3030-704</td>
<td>For Southern transfer</td>
</tr>
<tr>
<td>Nylon membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>RPN203S</td>
<td>For Southern transfer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of uv-induced replication intermediates in e. coli using two-dimensional agarose-gel analysis

Ungenaue Replikation in Anwesenheit von DNA-Schäden verantwortlich ist für die Mehrheit der zellulären Umlagerungen und Mutagenese in alle Zelltypen zu beobachten und wird allgemein angenommen, um direkt mit der Entstehung von Krebs beim Menschen in Verbindung gebracht werden. DNA-Schäden, wie sie durch UV-Bestrahlung induziert wird, stark beeinträchtigt die Fähigkeit der Replikation der genomischen Vorlage exakt zu duplizieren. Eine Reihe von Genprodukten identifiziert worden, die erforderlich sind, wenn die Replikation Begegnungen DNA-Läsionen in der Vorlage. Allerdings hat eine verbleibende Herausforderung, wie diese Proteine ​​Prozess Läsionen während der Replikation bestimmen<em&gt; In vivo</em&gt;. Mit Escherichia coli als Modellsystem, beschreiben wir ein Verfahren, bei dem zwei-dimensionalen Agarose-Gel-Analyse verwendet werden, um die strukturellen Zwischenprodukte, die auf replizierende Plasmide entstehen identifiziert werden können<em&gt; In vivo</em&gt; Folgende UV-induzierten DNA-Schäden. Dieses Verfahren wurde verwendet, um nachzuweisen, dass Replikationsgabeln durch UV-induzierte Schäden blockiert eine vorübergehende Umkehr, die von RecA und mehrere Genprodukte mit dem RecF Weg verbundenen stabilisiert zu unterziehen. Die Technik zeigt, dass diese Replikation Zwischenprodukte bis zu einer Zeit, die mit der Entfernung der Läsionen, die durch Nukleotidexzisionsreparatur Reparatur und Replikation fortgesetzt korreliert werden beibehalten.

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Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Wir präsentieren ein Verfahren, mit dem zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse verwendet werden, um die Struktur der Replikation Zwischenprodukte, die nach UV-Bestrahlung auftreten, identifiziert werden können.

Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

visualization-uv-induced-replication-intermediates-e-coli-using-two

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

10.6K Aufrufe.  Portland State University. Wir präsentieren ein Verfahren, mit dem zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse verwendet werden, um die Struktur der Replikation Zwischenprodukte, die nach UV-Bestrahlung auftreten, identifiziert werden können.

Serie: Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mit dem Hitzeschock-Methode

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Forschung

Biologie

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

Screening für Amyloid-Aggregation durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

Visualisierung der DNA-Replikation in den Wirbeltier-Modellsystem DT40 mit der DNA Fiber-Technik

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Phage-vermittelte Lieferung von Targeted sRNA Konstruiert Down-Gene nach Knock Expression in<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

Herstellung von humanen Noroviren hervorstehendem Domains in<em&gt; E. coli</em&gt; Für Röntgenkristallographie

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucin Agarose-Gel-Elektrophorese: Western Blotting für Hochmolekulare Glykoproteine


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...