Diese Arbeit wurde vom NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) und NIH Zuschüsse AR052785 und AR046786 (AEO und W.-MW) unterstützt.

Ein. Bereiten 0 bis 2 Tage alten Neugeborenen Mäuse für Haut Dissection <ol><li> Euthanize Maus Jungtieren mit einem CO 2-Kammer für mindestens 20 min. Lassen Welpen auf Eis bis zu einer Stunde, bis Dissektion. P0-P2-Mäuse sind hoch als Zellen von älteren Mäusen hergestellt empfohlenen Vorläuferzellen Kapazität reduziert, dass die Ergebnisse im unteren Pfropfausbeuten. Bereiten Sie ein Gericht aus 70% Ethanol (für Schritt 1,3) und drei Gerichte der Waschlösung (für Schritt 3), wenn Sie bereit für die Haut Dissektion durchzuführen. Auftauen Dispase-Lösung und lassen Sie es bei 4 ° C. Cervical verrücken Welpen nach CO 2 Überbelichtung Euthanasie zu gewährleisten. </li><li> Zeigen eingeschläfert Welpen in einer Kulturschale auf Eis und Transfer zu einem sterilen Werkbank. </li><li> Waschen Welpen durch kurzes Eintauchen in 70% Ethanol und Ort auf sterile Kulturschale. </li></ol> 2. Dissect Mäusehaut <ol><li> Schneiden Sie jedes Glied und Schwanz an der Basis des Rumpfes mit einer sterilen Schere. </li><li> Fassen Sie den Körper fest zwischen einem Paar von curved Zange und einen Einschnitt entlang der dorsalen Haut von Kopf bis Schwanz mit einem Skalpell ohne Durchdringung der zugrunde liegenden Faszie. </li><li> Sie vorsichtig die Haut von der Mittellinie entfernt der Maus. </li><li> Fassen Sie den exponierten Maus fest mit der langen Seite der gekrümmten Pinzette und fügen Sie ein weiteres Paar von gekrümmten Pinzette unter die Haut am hinteren Ende der Maus und ziehen Haut über Hüfte in Richtung der ventralen Hälfte der Maus. </li><li> Sie vorsichtig die Haut völlig aus der Maus in einer geschmeidigen Bewegung und entsorgen Sie die Karkasse. </li></ol> 3. Waschen der Haut und inkubieren mit Dispase-Lösung <ol><li> Zeigen die Haut in der ersten Teller der Waschlösung mit Dermis-Seite nach unten. Verteilt Haut aus und bewegen Sie mit einer Pinzette. Lassen Sie die Haut in der ersten Schüssel Waschlösung während sezieren die nächste Haut. </li><li> Nach dem Platzieren des nächsten seziert Haut in der ersten Schüssel Waschlösung, übertragen Sie die vorherige Haut an die zweite Schüssel Waschlösung. Halten Skins in the zweiten Waschlösung bis alle Skins gesammelt werden. Übertragen Sie alle der Häute der letzten Wäsche, kurz schütteln. </li><li> 10 ml eiskaltem Dispase in eine sterile 10 cm Kulturschale. Übertragen Haut an die Dispase-Lösung und glätten die Haut Dermis nach unten. </li><li> Float Haut für 8-16 h bei 4 ° C (Alternative: 1 Stunde bei 37 ° C). </li></ol> 4. Separate Dermis und Epidermis <ol><li> Übertragen Haut zu einem neuen sterilen Kulturschale und glätten die Haut Dermis nach unten. Vorsichtig halten die Dermis von einer Ecke mit einem Skalpell. </li><li> Fassen Sie die Epidermis mit einer Pinzette langsam und lösen sich von der Dermis. Epidermis sollte Schale weg als ein Stück. Die Epidermis wird weiß und dünn und die Dermis sollte bräunlich, dicker und gallertartig. </li><li> Trennen Sie die beiden Gewebe in separate sterile Kulturschalen. <ol class="lalpha"><li> Um einen dermal spezifischen Gen knockdown / Überexpression Graft machen, nehmen Dermis und Hackfleisch in sehr kleine Stücke mit two Skalpelle. Entsorgen Epidermis. Am Tag der Infektion (Schritt 7), sezieren weiteren Satz von Maus Häute, um frische, unbehandelte Epidermiszellen vorzubereiten, mit lentiviralen-infizierten dermalen Zellen zu kombinieren. </li><li> Um eine epidermale spezifischen Gen knockdown / Überexpression Graft machen, schneiden jedes Epidermis in 6 bis 8 kleinere Stücke. Entsorgen Dermis. Am Tag der Infektion (Schritt 7), sezieren weiteren Satz von Maus Häute, um frische, unbehandelte dermalen Zellen zu erstellen, um lentiviralen-infizierten Epidermiszellen zu kombinieren. </li></ol></li></ol> 5. Distanzieren Primäre Maus Dermal Cells (mDCs) aus zerkleinertem Gewebe <ol><li> Distanzieren mDCs durch Inkubation dermal Stücke mit frisch zubereiteten Collagenase-Lösung bei 37 ° C für 1 Stunde. Verwenden Sie 10 ml Collagenase-Lösung per Mausklick Welpen. </li><li> Vorsichtig mischen Lösung Dermis alle 10 min. Überprüfen des Ausmaßes der Dissoziation unter einem Mikroskop; die verdaute Zellsuspension sollte meist einzelne Zellen sein. Die Lösung sollte klar bis trüb wie der Wandeldermalen Zellen dissoziiert von der Dermis. </li><li> Hinzufügen FBS auf Collagenase-Lösung enthaltenden Dermis zu einer 10% Endvolumen um die Aktivität der Kollagenase reduzieren. </li><li> Passieren die Zellsuspension durch ein 70 um Zellsieb in ein neues 50 ml Röhrchen zu großen Klumpen und unverdauten ganze Follikel zu entfernen. 10 ml DMEM/10% FBS pro 30 ml des Durchstromkanals weiter verdünnen Kollagenase. </li><li> Enthaltenden Zentrifugationsröhrchen verdaut Dermis bei 30 × g über einer Tischzentrifuge für 5 min zur weiteren Entfernung ganze Follikel. </li><li> Vorsichtig den Überstand in ein neues 50 ml Tube. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg auf einer Tischzentrifuge für 5 min. </li><li> Resuspendieren Zellen mit DMEM/10% FBS (1 ml pro Jungtier) und zählen Zellen. Platte Zellen mit Amniomax C-100 Medien für Infektionen (Schritt 7), oder mit Lentivirus-infizierten KC zum Pfropfen (Schritt 9) zu kombinieren. Typische Ausbeute beträgt 20 x 10 6 Zellen pro Welpe. </li></ol> 6. Distanzieren Primäre Keratinozytens (KC) aus zerkleinertem Gewebe <ol><li> Dissoziieren KC durch Inkubieren epidermalen Stücke mit frisch aufgetauten 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 15 min. Verwenden 7 ml Trypsin-EDTA pro Maus Welpen. </li><li> Vorsichtig schwenken Lösung Epidermis alle 5 min. </li><li> Hinzufügen gleichen Volumen Neutralisierungslösung auf Trypsin-EDTA enthaltende Epidermis die Aktivität von Trypsin zu reduzieren. </li><li> Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg auf einer Tischzentrifuge für 5 min. Verbleibende unverdauten Gewebe sollte auf schweben. </li><li> Vorsichtig abgießen meisten der Überstand mit unverdauten Gewebe. Entfernen Sie verbleibende Überstand mit einer 10 ml Pipette ohne störende Zellpellet. Zellpellet mit PBS. Bei KCs nicht pelletiert vollständig, giesst die meisten der Überstand und wiederholen Zentrifugieren bis die meisten der Zellen pelletiert werden. </li><li> Stamm Zellsuspension durch 70 um Zellsieb in ein neues Röhrchen zum restlichen Gewebe oder Klumpen zu entfernen. </li><li> Pellet Zellen durch Zentrifugierenbei 200 xg auf einer Tischzentrifuge für 5 min. </li><li> Die Zellen in CnT-07 Medien oder PBS (1 ml pro Jungtier) und Anzahl Zellen. Verwenden CnT-07 für die Beschichtung Zellen für eine Infektion (Schritt 7), verwenden PBS mit Lentivirus-infizierten mDCs zum Pfropfen (Schritt 9) zu kombinieren. Typische Ausbeute 3-10 x 10 6 Zellen pro Welpe. </li></ol> 7. Infect Primärzellen mit Lentivirus enthaltend shRNA oder cDNA Am Tag der Infektion sezieren weiteren Satz von Maus Häute, um frische, unbehandelte primäre KCs oder mDCs mit virusinfizierten Zellen am Tag der Operation (Schritt 9) verbinden vorzubereiten. <ol><li><ol class="lalpha"><li> Für mDCs, Platte 4 x 10 6 mDCs pro 10-cm-Platte mit Amniomax-C100 Medien und bei 37 ° C + 5% CO 2 für den nächsten Tag Infektion bei 50% Zelldichte. Regel 3-4 Platten mDCs werden verwendet, um ein Transplantat zu erzeugen, und eine Gesamtmenge von 10 bis 12 Platten erforderlich sind, um drei Transplantaten in einem Experiment zu erzeugen. Alternativ lassen mDCs anlagern und ausbreiten foder ein Minimum von 2 Stunden bei 37 ° C + 5% CO 2 und führen Infektion am gleichen Tag von Zellen Plattieren. mDCs haben Fibroblasten-ähnliche Morphologie. </li><li> Für KC, Platte 12 x 10 6 KC pro 10-cm-Platte mit CNT-07 Medien und bei 37 ° C + 5% CO 2 für den nächsten Tag Infektion. Alternativ lassen KC befestigen und für ein Minimum von 2 Stunden verteilt auf 37 ° C + 5% CO 2 und führen Infektion am gleichen Tag. Regel 3-4 Platten KC werden verwendet, um ein Transplantat zu generieren. Eine Gesamtzahl von 10-12 Platten erforderlich sind, um drei Transplantaten für einen Versuch zu erzeugen. KCs haben Kopfsteinpflaster Morphologie. </li></ol></li><li> Vorinkubiert Zellen für 5-10 min mit 8 ug / ml Polybren Lösung bei 37 ° C + 5% CO 2. </li><li> Exchange-Medien und fügen Lentivirus + 8 pg / ml Polybren Solution. Lentivirale Titer variieren je nach der verwendeten Konstruktion und sollte vor der Infektion bestimmt. </li><li> Zentrifuge die Platten bei 200 × g bei einer Tischzentrifuge für 1 Stunde bei 32 °, C, Zellen mit Lentivirus infizieren. </li><li> Entfernen Lentivirus-haltigen Medien und frisches Medien. Für KC, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS vor der Zugabe wieder frisches Medium. Normalerweise infizierten Zellen erholen Nacht bei 37 ° C + 5% CO 2. Alternativ lassen Sie mindestens zwei Stunden der Erholung bei 37 ° C + 5% CO 2 vor TRYPSINIERUNGSFLASCHEN die Zellen für Transplantationen. Weiter zur Kultur ein kleiner Teil der infizierten Zellen für eine Infektion Effizienz zu überprüfen, wie im Repräsentative Ergebnisse beschrieben. </li></ol> 8. Bereiten infizierten Zellen für die Transplantation <ol><li> Isolieren frische primäre mDCs oder KCs von der Haut über die Schritte 4-6. Die Zellen in eiskaltem sterilen PBS. Zählen von Zellen. </li><li><ol class="lalpha"><li> Für dermale spezifischen Gens Knockdown / Überexpression Transplantat, dissoziieren infizierten mDCs von Platten unter Verwendung von 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 8 min. </li><li> Für epidermalen spezifischen Gen knockdown / Überexpression Transplantat, distanzieren infizierten KC aus Platten using 0,125% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 15 min. </li></ol></li><li> Neutralisieren Trypsinaktivität Verwendung von DMEM + 10% FBS (mDCs) oder Neutralisationslösung (KC). Übertragung der Zellen auf eine trypsinisierte 50 ml Röhre. </li><li> Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg auf einer Tischzentrifuge für 5 min. </li><li> Die Zellen in eiskaltem sterilen PBS. Zählen von Zellen. </li><li> Vereinen die Virus-infizierten Zellen mit dem frisch hergestellten unbehandelten Gegenstück Zelltyp. Zum einen Pfropf, kombinieren 7-10 x 10 6 mDCs mit 7-10 x 10 6 KCs in eiskaltem sterilen PBS und Pellet die Zelle Aufschlämmung in einer Tischzentrifuge bei 4 ° C. Die Zellen in 50 -100 ul eiskaltem sterilen PBS. Halten Zellen auf Eis, bis nu / nu Maus Kammern bereit sind. </li></ol> 9. Erstellen Wound Bed and Fix Kammer auf den Rücken der nu / nu Maus Ein Tag vor der Transplantation, sterilisieren chirurgische Instrumente mit Autoklav und steril Silizium-Kammern, die durch Eintauchen in 70% Ethanol. Ersetzen Sie die 70% ethanol mit sterilem PBS, bevor Sie die Kammern. <ol><li> Anesthetize nu / nu Maus (7-12 Wochen alte Weibchen) mit Ketamin (8 mg / ml) / Xylazin (1,6 mg / ml) durch intraperitoneale Injektion (100 μl/10 g Körpergewicht) oder andere bevorzugte Methode. Bewerben Auge Schmiermittel. Ort Heizkissen unter Maus. </li><li> Desinfizieren Nacktmaus Rückenhaut mit Jod und sauber mit Alkoholtupfer. </li><li> Fügen Sie 1-3 Tropfen 0,25% Bupivacain zur Inzisionsstelle topisch. Drücken Sie den Nacktmaus Rückenhaut an der Basis des Halses mit einer Pinzette. </li><li> Schneiden Sie ein kleines rundes Loch (ca. 1 cm Durchmesser) in Hautfalte mit einer sterilen Schere. </li><li> Zeigen sterile Kammer auf Wundbett und decken Kammer Kanten mit der umgebenden Haut. </li><li> Sichere Kammer einrastet mit Nähten entlang Kammer Kanten (6 Maschen pro Kammer), wie in 2A gezeigt. </li><li> Wenn Kammern bereit sind, schwenken Zellaufschlämmung und erarbeiten in 23-Gauge-Nadel an 1 ml Spritze. Wenn Zellaufschlämmung hat an der Unterseite kondensiert, sanftresuspendieren mit 1 ml Pipettenspitze vor dem Zeichnen in die Nadel. </li><li> Puncture Kammer mit Nadel und langsam tropft Zellen auf Wunde. </li><li> Ort Mäuse in sauberen, autoklaviert Käfigen. House 2 Mäuse pro Käfig und fügen Antibiotika und Tylenol (3 mg / ml) zu Trinkwasser. Nach unseren Erfahrungen wurden zwei weibliche Mäuse pro Käfig keine schädlichen Trauma an der Kammer, Pfropf oder Tiere resultierten. </li><li> Zeigen Erwärmung pad weniger als die Hälfte des Käfigs und beobachten Mäuse, bis Narkose nachlässt. </li></ol> 10. Entfernen Kammer nach 7-9 Tagen <ol><li> Anesthetize chambered nu / nu-Maus, wie in Schritt 9.1. Bewerben Auge Schmiermittel. </li><li> Desinfizieren Sie die Haut rund Kammer mit Jod und sauber mit Alkoholtupfer. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig Stiche und entfernen Sie aus der Kammer. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Kammer von Maus. Wenn neue skin graft-Sticks in die Kammer, heben Teil der Kammer und sanft separaten Transplantat von der Kammer mit einer Pinzette. Halten Transplantat nach unten während des Entfernens der Kammer. Graft sollte look matt und undurchsichtig wie in Abbildung 2B. </li><li> Anwenden einer nicht-haftenden Unterlage mit einem dünnen Film von Antibiotika auf die offene Wunde und Nahtmaterial einrastet (2 Stiche). </li><li> Wickeln Verband um Maus, um das Pad zu sichern und schützen die Wunde. Naht Verband einrastet. </li><li> Die Silizium-Kammern werden durch Auswaschen mit milder Seife gereinigt und mit entionisiertem Wasser gründlich gespült. Weichen Sie die Kammern in 70% Ethanol über Nacht an der Luft trocknen und lagern. </li></ol> 11. Untersuchen Mouse for Hair Growth <ol><li> Entfernen Bandagen und Pad nach 3 Tagen der Kammer entfernen. Graft sollte trocken sein und undurchsichtig braun gefärbt. </li><li> Überprüfen Mäusen regelmäßig für das Haarwachstum. Die Haare sollten anfangen, nach 16 Tagen nach der Transplantation zu zeigen. </li></ol> Vorgehensweise Gliederung Day 1 (2-3 Std.): Opfere neugeborenen Welpen, Haut entfernen, und lassen auf Dispase bei 4 ° C über Nacht. Day 2 (2-3 Std.): Isolieren primären Zellen von Haut undPlatte bei empfohlene Zelldichte. 3. Tag (3-4 Stunden): Infect Zellen mit Lentivirus. Entfernen Sie die Haut von einer anderen Gruppe von neugeborenen Welpen und lassen auf Dispase bei 4 ° C über Nacht. 4. Tag (6-8 Stunden): Isolieren primären Zellen von Haut, zählen, und lassen Sie auf dem Eis. Recover Lentivirus-infizierten Zellen durch Trypsinisierung und Zentrifugation, zählen, und kombinieren 7-10 x 10 6 Hautzellen und Keratinozyten in 50-100 ul PBS pro Graft. Erstellen Wundbett auf Maus legen Kammer und gelten Zellgemisch ins Bett gewickelt. Alternative Vorgehensweise Outlines Alternative Vorgehensweise Konturen wird das Verfahren von vier auf drei Tage zu verkürzen. <ol><li> Kombinieren Tag 1 und Tag 2, indem man mit der Maus Skins in Dispase bei 37 ° C für eine Stunde (geschätzte 5-7 h). </li><li> Kombinieren Tag 2 und Tag 3 durch Infizieren von Zellen mit Lentivirus nach dem Plattieren Zellen für zwei Stunden (geschätzte 5-7 h). </li></ol>

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	<li>Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIM+and+cortactin+antagonism+regulates+ciliogenesis+and+hedgehog+signaling.">MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling.</a> Dev Cell. 19, 270-283 (2010).</li><li>Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+dermal+papilla+cells+in+hydrogels+reveals+intrinsic+differences+between+Sox2-positive+and+-negative+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).</li><li>Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+procedure+to+reconstitute+hair-producing+skin.">A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).</li><li>Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+mouse+models+for+hair+follicle+reconstitution.">Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution.</a> Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).</li><li>Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+regulation+of+murine+hair+growth:+insights+from+grafting+defined+cell+populations+onto+nude+mice.">In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice.</a> J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462, 433-441 (2009).</li><li>Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+mouse+vibrissal+dermal+papilla+cells+and+de+novo+hair+follicle+induction.">Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction.</a> Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).</li><li>Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+dermal+papilla+cells+is+required+for+their+hair+follicle-inductive+properties.">BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties.</a> Genes Dev. 22, 543-557 (2008).</li><li>Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-lox-regulated+conditional+RNA+interference+from+transgenes.">Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).</li><li>Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+hair+follicle+development+in+vivo:+determination+of+follicle+formation,+hair+growth,+and+hair+quality+by+dermal+cells.">Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).</li><li>Woo, W. -. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+maintains+dermal+papilla+identity+and+hair+morphogenesis+via+a+Noggin-Shh+regulatory+loop.">Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop.</a> Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).</li><li>Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+dermal+papilla+cells+into+inductive+spheroidal+microtissues+on+poly(ethylene-co-vinyl+alcohol)+membranes+for+hair+follicle+regeneration.">Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration.</a> Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).</li><li>Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+from+dissociated+cells:+generation+of+mature+cycling+hair+follicles+from+skin-derived+cells.">Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells.</a> J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Haar Rekonstitution Assays bieten eine einzigartige Organregeneration Modell zur Untersuchung des Mechanismus von de novo Haarfollikelbildung. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Kammer Haar Assay nützlich zum Bestimmen der Genfunktion in Haarfollikelbildung. Unserem Assay basiert auf der Rekonstitution Haaren berichtet Kammer Assay 5, 6,11, die wir modifiziert, um eine Technik zur Expression lentiviralen Genüberexpression oder Knockdown entweder in den dermalen oder epidermalen Zelltypen zu erreichen einzuführen basiert. Unserem Assay stellt eine schnelle Alternative zum Gewebe-spezifische genetische Knockout Erzeugen. Dieser Test ermöglicht es uns, die Funktion von Genen in Haarfollikelbildung in weniger als drei Wochen nach Infektion Primärzellen mit Lentivirus zu pfropfen Sammlung zeigen. Unserem Assay erweitert werden, um genetische Wechselwirkungen unter Verwendung Kombination shRNA / cDNA Lieferung von Lentivirus in einem Zelltyp 12 angesprochen werden, sowie ermöglicht die Untersuchung der Signalisierung zwischen der dermalen und epidermalen Zellen typ.es. Unser Haar Assay wird am besten zum Erfassen starken Gewinn oder Verlust-Funktionsverlust-Phänotypen in Haarfollikel Regeneration geeignet, während feine Fehlstellen schwerer zu beobachten sind. Wir haben erfolgreich dermal spezifische Gen-Funktion von wenigen Genen mit unseren Haarregeneration Assay 1,12 demonstriert. Bezogen auf das GFP-Markers aus Lentivirus-Vektor, shRNA 10 coexprimierten zeigten wir, dass die shRNA exprimierenden dermalen Zellen Spenders in den regenerierten Haargrafts anhielt. GFP-positive Zellen waren in der dermalen Papille (DP) der regenerierten Haarfollikel (Abbildung 3). Die DP Zellen wahrscheinlich bestand aus verschiedenen Ebenen der Gen-Knockdown als Zellen exprimiert unterschiedlichem GFP, damit die beobachtete Haarfollikel Phänotyp eine Reihe von genetischen hypomorph auf null war. Eine Verbesserung für diesen Test wird es sein, eine schnelle und effiziente Auswahl für die hohen shRNA exprimierenden Zellen vor Graftin etabliereng wie mittels FACS eine starke GFP-exprimierenden Zellen zu reinigen. Eine Alternative ist die Mutante oder konditionale Knockout-Zellen in diesem Assay 9 ersetzen. Auf der anderen Seite, ist eine Kultur, das DP Zellfunktion bewahren kann sehr nützlich als DP Potenz allmählich verloren geht, sobald die primäre dermale Zellen passagiert werden. Potenzielle Kultur Systemen umfassen die Verwendung von Biomaterialien aus künstlichen Nischen-oder Aggregation Kulturen 2,7,8,13 abgeleitet. Eine weitere Verbesserung wird es sein, eine zuverlässige Epidermiszelle Einfriermethode mit einem hohen Zellwiederfindungsrate da dies die Verwendung des zweiten Satzes der Maus Welpen (Schritt 7) zu reduzieren, um frische Keratinozyten in dermal-spezifischen Verlust-oder generieren generieren gain-of- Funktions-Studien. Diese Kammer Haar Assay erzeugt Haarfollikel Dichte und Qualität ähnlich wie bei normalen Haut von Mäusen, obwohl das Haarwachstum ist etwas weniger synchronisiert und Follikel Orientierung ist eher zufällig. Ein paar Einschränkungen der Regeneration der Haare genetische Tests einschließliche das Erfordernis der großen Menge von Lentivirus und Zellzahlen, und es ist sehr arbeitsintensiv in Bezug auf chirurgische Verfahren, wenn auf andere Formen von Haaren Rekonstitution Assays wie dem Patch und Klappe Assays 3,4,14 verglichen. Allerdings ist die Qualität der Haarfollikel und Timeline, um das Haarwachstum zu erkennen besser als andere Assays 4. Unsere gezielte Regeneration der Haare Assay bietet einen schnellen und bequemen Begleiter zu bestehenden genetischen Modelle.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Cnt-07 </td><td> Zelle N Tec </td><td> CnT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMax-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMax-C100 Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase Typ 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107.689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Gewebekulturschale </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Präparierschere </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Zange </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> gewölbt </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex Versorgung </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> Größe Nr. 10 </td></tr><tr><td> 70 um Zell stainer </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49D </td><td></td></tr><tr><td> Alkoholtupfer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23-Gauge-Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Eye Schmierstoff </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providon-Jod Tupfer </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silicon Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Nahtmaterial </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Flexible Bandage </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Nichtadhärente Dressing </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materialien </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Waschlösung PBS 500 ug / ml Penicillin / Streptomycin 12,5 pg / ml Fungizone 100 ug / ml Gentamycin Dispase-Lösung HBSS 2,5 mg / ml Endkonzentration Dispase 100 ug / ml Gentamycin Neutralisierenden Medien HBSS 15% (v / v) FBS Kollagenaselösung 0,25% (w / v) Kollagenase, Typ 1 nhalt &quot;&gt; 100 ug / ml Penicillin / Streptomycin 2,5 ug / ml Fungizone 50 ug / ml Gentamycin Polybrene Lösung HBSS 8 ug / ml (w / v) Polybrene </td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

Haarfollikelmorphogenese, ein komplexer Prozess, Interaktion zwischen Epithelien abgeleiteten Keratinozyten und der zugrunde liegenden Mesenchym, ist ein attraktives Modellsystem zur Entwicklung der Organe und Gewebe-spezifische Signalisierung zu studieren. Obwohl Haarfollikel Entwicklung ist genetisch gefügig, schnelle und reproduzierbare Analyse der wesentlichen Faktoren für diesen Prozess bleibt eine Herausforderung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur gezielten Überexpression oder shRNA-induzierte Hemmung von Faktoren Verwendung Lentivirus in einer Gewebe-spezifischen Art und Weise zu erzeugen. Mit einer modifizierten Version eines Haarregeneration Modell 5, 6, 11, können wir erreichen, robuste Gewinn-oder Verlust-of-function-Analyse in primären Maus Keratinozyten oder Hautzellen, um das Studium epithelial-mesenchymale Signalwege, die Haarfollikelmorphogenese führen zu erleichtern . Wir beschreiben, wie die frische primären Maus Keratinozyten und dermalen Zellen, die Hautpapillazellen und deren Vorstufen enthalten isolieren, liefern Lentivirus ContaiNing entweder shRNA oder cDNA einem der Zellpopulationen, und verknüpfen die Zellen vollständig ausgebildet Haarfollikel auf dem Rücken von Nacktmäusen erzeugen. Dieser Ansatz ermöglicht die Analyse von Gewebe-spezifischen Faktoren erforderlich, um Haarfollikel innerhalb von drei Wochen zu generieren und bietet eine schnelle und komfortable Begleiter vorhandenen genetischen Modelle.

In Abbildung 1 zeigen wir das Ergebnis der dermal-spezifischen lentiviralen shRNA Knockdown von Smoothened (Smo), eine kritische Shh Signalgebungsbauteil, in einem 3-Wochen alten regenerative Haar-Transplantat. Steuerung Transplantate mit lentiviralen Vektor allein zeigen robust Haarwuchs (Abbildung 1A). Im Gegensatz dazu, dermal-spezifischen Knockdown von Smo führt zum Verlust des Haarwachstums (Abbildung 1B). Hämatoxylin und Eosin-Färbung zeigt das Stadium der Haarfollikel in Kontroll-und experimentellen Bedingungen (1C, D). Das Haarwachstum Phänotyp aus ähnlichen Behandlungen können unter Experimenten Variablen, einschließlich der positiven Kontrolle mit lentiviralen Vektor allein Infektion. Deshalb positive Kontrolle Transplantate sollte immer in jedem Experiment als Referenz als 30% der Transplantate kann als Folge der Narbenbildung oder unvollständige Befestigung der Transplantate nicht einbezogen werden. Im Fall der Prüfung einer Interaktion zwischen zwei Faktoren wie überexprimierenden cDNA eines Faktors erneutSCUE shRNA-vermittelte Knockdown von einem anderen Faktor, sollte man immer auch knockdown allein Transplantate zu manifestieren die loss-of-function Ergebnis in jedem Experiment. Dadurch wird eine notwendige Bandbreite, um zu bestimmen, wie ein bestimmtes Gen die Haarfollikel Regeneration Weg und wie zwei Gene interagieren stört. Entfernung von der Kammer (2A) muss mit Vorsicht durchgeführt werden. Die neu gebildete Pfropf sollte etwas undurchsichtig mit einer matten Oberfläche (Abbildung 2B). Das Transplantat kann die Kammer bleiben, so leichtes Anheben der einen Seite ist darauf zu achten, das Transplantat bleibt an der Wundbett. Das Transplantat ist recht stabil nach drei Tagen und sollte wenig Schwierigkeiten bereiten beim Entfernen des Verbandes. Robust Haarwuchs sollte nach drei Wochen (2C) beobachtet werden. Weglassen entweder mDCs oder KCs wird in einem wiederhergestellten Wunde ohne Haare (2D) 11 führen. Zelltod oder Zellverlust in einem derZelltypen führt auch ohne Haare im Gegensatz zu reduzierten Haarregenerierungszusammensetzung in dermo-Smo Knockdown wie in 1B gezeigt. Um einen erfolgreichen Test zu gewährleisten, ist es von entscheidender Bedeutung, um eine größere als 90% virale Infektion von Zellen mit geeigneten Überexpression oder Knockdown Effizienz vor dem Pfropfen. Aufgrund der zeitlichen Beschränkungen des Transplantationsverfahren, empfiehlt es Fehlersuche Virusinfektion Wirkungsgrade vor Beginn einer Pfropfung Experiment, und immer Speichern einen kleinen Teil der Zellen am Tag der Transplantation Verfahren zur verlustfreien oder gain-of-Expression zu verifizieren. Lentivirale Titer variieren je nach der verwendeten und konstruieren zu bestimmen vor der Infektion von 90 bis 100% Wirkungsgrad zu werden. Wir überwachen Virusinfektion Effizienz mit GFP aus dem lentiviralen Vektor koexprimiert. Wir routinemäßig quantitative PCR und / oder Western Blot um das Ausmaß der Knockdown oder Überexpression zu bestimmen. Verwendung Dual-Expressionsvektoren mit fluoreszierenden Markierungen zu kennzeichnenviral infizierte Zellen bietet eine Möglichkeit, perdurance des Signals und die Anzahl von Zellen, die unsere Konstrukte in reifen Transplantate hinweisen. Wir verwenden GFP durch einen CMV-Promotor aus der Lentivirusvektor pSicoR-CMV-GFP-10 in Kombination mit Smo shRNA angetrieben. In Abbildung 3 zeigen wir ein 3-Wochen alten dermal-spezifischen Graft, wo GFP in Hautpapilla einer repräsentativen Haarfollikel lentivirally-exprimiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Abbildung 1. Histologische Analyse der Haarfollikel Wachstum. (A) der Steuerung Haarregenerierungszusammensetzung Pfropf Ansicht mit dermalen Zellen mit leeren lentiviralen Vektor und unbehandelten Keratinozyten infiziert. (B) mit Smoothened Knockdown lentiviralen shRNA in dermalen Zellen mit unbehandelten Keratinozyten führt zu einem Verlust der Haarfollikel kombiniert. (C) Hämatoxylin und Eosin Färbung zeigt Anagenhaar follicles Kontrolle Transplantate erstrecken sich bis in die Dermis und (D) Smoothened Knockdown Haarfollikel bleiben gehemmt und weitgehend. Alle Bilder sind drei Wochen nach der Transplantation. Maßstab bedeutet 100 um. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Abbildung 2. Pfropfen primären Zellen. (A) nu / nu-Maus mit vernäht Kammergehäuses primäre dermale Zellen und Keratinozyten. (B) Entfernung von Kammer belichtet neu Haut, ist stumpf und undurchsichtig Charakter gebildet. (C) Ausgewachsene Haare auf Transplantats mit Wildtyp- Geben primäre dermale Zellen und Keratinozyten bei drei Wochen nach der Transplantation. (D) Zugabe von primären dermalen Zellen ohne Keratinozyten führt zu keiner Haar nach drei Wochen. Ähnliche Ergebnisse werden unter Zusatz von primären Keratinozyten ohne dermalen Zellen gesehen. Abbildung 3. Wartung der GFP-Expression in dermalen Papille. Konfokale Bilder von Hautpapilla von einem 3-Wochen alten regeneriert Transplantat. GFP wurde in der dermalen Zellpopulation aus einem lentiviralen Vektor exprimiert und detektiert in der dermalen Papille (grün). Versican (rot) grenzt die dermale Papille und Kerne waren Etikett mit Hoechst (blau). Anmerkung GFP ist speziell in dermalen Zellen, nicht aber in den umliegenden Keratinozyten exprimiert. Maßstab bedeutet 20 um.

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Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Gewebe-spezifische Analyse von einem Haarfollikel Regeneration Modell mit Lentivirus, um Gewinn-oder Verlust-of-function vermitteln.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine. Gewebe-spezifische Analyse von einem Haarfollikel Regeneration Modell mit Lentivirus, um Gewinn-oder Verlust-of-function vermitteln.

Serie: Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection der hippocampalen von erwachsenen Maus

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Forschung

Biologie

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Die Beurteilung Signaling Eigenschaften von ektodermale Epithel Während Craniofacial Entwicklung

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Extraktion und Analyse von Cortisol aus Menschen-und Affen-Haar

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Eine neue Technik zur quantitativen Analyse von Haarausfall in Mäuse mit Graustufen-Analyse

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...