1. Herstellung des Gels <ol><li> Abwiegen die entsprechende Masse an Agarose in einen Erlenmeyerkolben. Agarosegele werden unter Verwendung von w / v Prozentsatz Lösung. Die Konzentration der Agarose in einem Gel wird auf der Größe der DNA-Fragmente abhängen, getrennt, wobei die meisten Gele im Bereich zwischen 0,5% -2% beträgt. Das Volumen des Puffers sollte nicht größer sein als 1/3 der Kapazität des Kolbens. </li><li> In Laufpuffer der Agarose-enthaltenden Flasche. Schwenken Sie zum Vermischen. Die häufigste Gel Laufpuffer sind TAE (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) und TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA). </li><li> Schmelzen Sie die Agarose / Puffer-Mischung. Dies wird am häufigsten durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen durchgeführt, kann aber auch über einen Bunsenbrenner durchgeführt werden. Bei 30 s-Intervallen, entfernen Sie den Kolben und schwenken, um den Inhalt gut mischen. Wiederholen, bis die Agarose vollständig gelöst hat. </li><li> In Ethidiumbromid (EtBr) auf eine Konzentration von 0,5 mg / ml. Alternativ kann das Gel auch nach elektro gefärbt werdenphorese in Laufpuffer enthält 0,5 mg / ml EtBr für 15-30 min, von Entfärben in Laufpuffer für eine gleich lange Zeit an. </li></ol> Hinweis: EtBr ist im Verdacht, krebserzeugend und müssen fachgerecht pro Institution Vorschriften entsorgt werden. Handschuhe sollten immer getragen beim Umgang mit EtBr-Gele werden. Alternative Farbstoffe für die Färbung von DNA zur Verfügung, jedoch EtBr bleibt die beliebteste aufgrund seiner Empfindlichkeit und Kosten. <ol start="5"><li> Lassen Sie die Agarose, um entweder auf dem Labortisch oder durch Inkubation in einem 65 ° C warmes Wasserbad abkühlen. Andernfalls wird verziehen den Gelträger. </li><li> Setzen Sie den Gelträger in die Gießvorrichtung. Alternativ kann man auch kleben die offenen Kanten eines Gelträger, um eine Form zu erzeugen. Setzen Sie einen geeigneten Kamm in das Gel Form, um die Brunnen zu schaffen. </li><li> Gießen Sie die geschmolzene Agarose in die Gelform. Lassen Sie die Agarose bei Raumtemperatur eingestellt. Nehmen Sie den Kamm und legen Sie das Gel in die Elektrophoresekammer. Alternativ kann die gel kann auch in Folie eingewickelt und bei 4 ° C bis zur Verwendung (1). </li></ol> 2. Einrichten von Gel-Apparatur und Trennung von DNA-Fragmenten <ol><li> In Ladepuffer zu den DNA-Proben zu trennen (Abb. 2). Gel Ladungsfarbstoff wird typischerweise bei 6X Konzentration (0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol, 30% Glycerin) hergestellt. Lädt Farbstoff hilft Ihnen wieder, wie weit Ihre DNA-Probe gereist, und ermöglicht auch die Probe in das Gel zu versenken. </li><li> Programm die Stromversorgung gewünschte Spannung (1-5V/cm zwischen den Elektroden). </li><li> In genug läuft, Puffer, um die Oberfläche des Gels bestimmt. Es ist wichtig, um die gleiche Laufpuffer wie die zur Herstellung des Gels verwendet. </li><li> Befestigen Sie die Kabel des Gel-Box an die Stromversorgung. Schalten Sie die Stromversorgung und stellen Sie sicher, dass sowohl Gel Box und Stromversorgung arbeiten. </li><li> Nehmen Sie den Deckel. Langsamund sorgfältig zu laden die DNA-Probe (n) in das Gel (Abb. 3). Eine entsprechende DNA-Größenmarker sollte immer zusammen mit experimentellen Proben beladen werden. </li><li> Setzen Sie den Deckel auf die Elektrophoresekammer. Die Kathode (schwarze Leitungen) sollte näher sein als die Brunnen der Anode (rote Leitungen). Überprüfen Sie, dass die Elektroden in die richtigen Schlitze in der Stromversorgung angeschlossen sind. </li><li> Schalten Sie die Stromversorgung. Führen Sie das Gel, bis der Farbstoff zu einem angemessenen Abstand migriert wurde. </li></ol> 3. Beobachten aufgetrennten DNA-Fragmente <ol><li> Wenn Elektrophorese beendet ist, schalten Sie die Stromversorgung und entfernen Sie den Deckel der Elektrophoresekammer. </li><li> Entfernen Gel aus dem Gel Box. Überschuss ablaufen lassen Puffer von der Oberfläche des Gels. Setzen Sie den Gelträger auf Küchenpapier, jede zusätzliche Laufpuffer absorbieren. </li><li> Entnehmen Sie das Gel aus dem Gel Tray und setzen Sie das Gel mit UV-Licht. Dies wird meist geschieht mit Hilfe eines Gel-Dokumentations-System (Abb. 4). DNA-Banden soll zeigen,als orange fluoreszierenden Bändern. Machen Sie ein Foto des Gels (Abb. 5). </li><li> Entsorgen Sie die Gel-und Laufpuffer pro Institution behördlichen Vorschriften entsorgen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse 5 zeigt ein typisches Ergebnis nach einer Agarose-Gelelektrophorese von PCR-Produkten. Nach der Trennung werden die erhaltenen DNA-Fragmente sichtbar klar definierten Bands. Die DNA-Standard oder einer Leiter sollte auf ein Maß, das für den nützlichen Bestimmung der Größe der Stichprobe erlaubt Bands getrennt werden. In dem gezeigten Beispiel werden DNA-Fragmente von 765 bp, 880 bp und 1022 bp auf einem 1,5% Agarosegel mit einem 2-log-DNA-Leiter getrennt. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> 1. Eine erstarrte Agarosegel nach der Entfernung des Kamms. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> Abbildung 2. Eine Studentin und fügt Ladefarbstoff ihr DNA-Proben. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein Student Laden der DNA-Probe in einen Brunnen im Gel. <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> 4. Ein Beispiel für ein Geldokumentationssystem. <img alt="Abbildung 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> Bild 5. Ein Bild von einem Gel nach der Elektrophorese. EtBr wurde an das Gel vor der Elektrophorese in einer Endkonzentration von 0,5 mg / ml, durch Trennung bei 100 V für 1 Stunde zugegeben, gefolgt. Das Gel wurde mit UV-Licht und das Bild mit einem Gel-Dokumentations-System übernommen ausgesetzt.

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	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Agarosegelelektrophorese hat sich als effiziente und effektive Art und Weise der Trennung von Nukleinsäuren sein. Agarose die hohe Gelfestigkeit kann für die Behandlung von geringen Prozentsatz Gele für die Trennung von großen DNA-Fragmenten. Molekularsiebkohle wird durch die Größe der Poren durch die Bündel von Agarose 7 in der Gelmatrix erzeugt wird. Im Allgemeinen, je höher die Konzentration von Agarose, desto kleiner ist die Porengröße. Traditionelle Agarosegelen sind am effektivsten bei der Trennung von DNA-Fragmenten zwischen 100 bp und 25 kb. Um DNA-Fragmente, die größer als 25 kb zu trennen, wird eine Notwendigkeit, Puls-Feld-Gelelektrophorese 6, die die Anwendung von Wechselstrom aus zwei unterschiedlichen Richtungen einbezogen werden, verwenden. Auf diese Weise größer dimensionierte DNA-Fragmente werden durch die Geschwindigkeit, mit der sie sich neu orientieren mit den Änderungen in der aktuellen Richtung getrennt ist. DNA-Fragmente kleiner als 100 bp getrennt sind wirksamer unter Verwendung von Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Im Gegensatz zuAgarosegelen, wird das Polyacrylamid-Gel-Matrix durch eine Radikalpolymerisation angetriebenen chemischen Reaktion gebildet. Diese Gele sind dünner höherer Konzentration, sind vertikal verlaufen und haben eine bessere Auflösung. In der modernen DNA-Sequenzierung Kapillarelektrophorese verwendet wird, wobei Kapillarröhrchen mit einer Gelmatrix gefüllt. Die Verwendung von Kapillarröhrchen ermöglicht die Anwendung von hohen Spannungen, wodurch die Trennung von DNA-Fragmenten (und die Bestimmung der DNA-Sequenz) schnell. Agarose kann modifiziert werden, um niedrig schmelzende Agarose durch Hydroxyethylierung zu erstellen. Niedrig schmelzende Agarose wird im Allgemeinen verwendet, wenn die Isolierung von DNA-Fragmenten getrennt erwünscht ist. Hydroxyethylierung verringert die Packungsdichte der Agarose-Bundles, eine effektive Senkung ihrer Porengröße 8. Dies bedeutet, dass ein DNA-Fragment der gleichen Größe länger dauert, bis durch eine leicht schmelzendem Agarosegel, um ein Standard-Agarosegel gegenüberliegenden bewegen. Da die Bündel miteinander verbindendurch nicht-kovalente Wechselwirkungen 9, ist es möglich, wieder schmilzt ein Agarosegel nach der Aushärtung. EtBr ist die häufigste Reagenz verwendet, um DNA in Agarosegelen 10 zu färben. Wenn UV-Licht ausgesetzt, Elektronen in dem aromatischen Ring der Ethidium-Molekül aktiviert werden, führt die zur Freisetzung von Energie (Licht) als Elektronen zurück zum Grundzustand. EtBr funktioniert durch Einlagern sich in der DNA-Moleküls in einer konzentrationsabhängigen Weise. Dies ermöglicht eine Abschätzung der Menge an DNA in einer bestimmten DNA-Bande auf ihrer Intensität. Aufgrund seiner positiven Ladung reduziert die Verwendung von EtBr die DNA-Migration Rate um 15%. EtBr ist ein Verdächtiger mutagen und karzinogen, also muss man Vorsicht walten lassen beim Umgang mit Agarosegelen enthält es. Darüber hinaus ist EtBr als Sondermüll und müssen entsprechend entsorgt werden. Alternative Flecken für DNA in Agarosegelen gehören SYBR Gold, SYBR Green, Kristallviolett und Methyl Blue. Von diesenMethyl Blue, Crystal Violet erfordern keine Exposition des Gels mit UV-Licht zur Visualisierung von DNA-Banden, wodurch die Wahrscheinlichkeit der Mutation wenn die Wiederherstellung der DNA-Fragment aus dem Gel gewünscht wird. Allerdings sind die Empfindlichkeiten niedriger als die von EtBr. SYBR Gold und SYBR Green sind beide sehr empfindlich, UV-abhängige Farbstoffe mit geringere Toxizität als EtBr, aber sie sind wesentlich teurer. Darüber hinaus, alle alternativen Farbstoffe können entweder nicht oder nicht gut funktionieren, wenn sie direkt zu dem Gel gegeben, damit das Gel muss nach gebeizt nach der Elektrophorese. Wegen der Kosten, einfache Handhabung, und die Empfindlichkeit, EtBr bleibt noch der Farbstoff der Wahl für viele Forscher. Doch in bestimmten Situationen, z. B. wenn die Entsorgung gefährlicher Abfälle ist schwierig, oder wenn junge Studenten sind der Durchführung eines Experiments kann eine weniger giftige Farbstoff bevorzugt werden. Lädt Farbstoffe in Gel-Elektrophorese verwendet dienen drei wichtige Zwecke. Zuerst fügen sie hinzu Dichte der Probe, So dass sie in das Gel zu versenken. Zweitens bieten die Farbstoffe Farbe und den Ladevorgang zu vereinfachen. Schließlich bewegen sich die Farbstoffe in Regelsätze durch das Gel, so dass für die Abschätzung der Entfernung, die DNA-Fragmente migriert. Die genaue Größe der aufgetrennten DNA-Fragmente können durch Auftragen der log des Molekulargewichts für die verschiedenen Bereiche von einer DNA-Standard gegen den Abstand von jedem Band erneut bestimmt werden. Die DNA-Standard enthält eine Mischung von DNA-Fragmenten von vorbestimmten Größen, die gegen die unbekannten DNA-Proben verglichen werden können. Es ist wichtig zu beachten, dass verschiedene Formen von DNA durch das Gel mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen. Superspiralisierter Plasmid-DNA, aufgrund ihrer kompakten Konformation, bewegt sich durch das Gel am schnellsten, gefolgt von einem linearen DNA-Fragment der gleichen Größe, mit der offenen Kreisform reisen die langsamste. Abschließend, da die Annahme von Agarosegelen in den 1970er Jahren für die Trennung von DNA, hatsich als eines der nützlichsten und vielseitigsten Techniken in den biologischen Wissenschaften Forschung sein.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Agarose I </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> Borsäure </td><td> Sigma </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Bromphenolblau </td><td> Sigma </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidiumbromid </td><td> Sigma </td><td> E7637 </td><td> Krebserzeugende-muss als gefährlicher Abfall entsorgt werden </td></tr><tr><td> Eisessig </td><td> Fischer </td><td> BP2401-212 </td><td> Ätzend </td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Fischer </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylene Cyanol FF </td><td> Sigma </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-Base </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Investigator / FX Gel-Dokumentations-System </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Owl EasyCast B1 Mini-Gel-Elektrophorese-System </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS-301 Netzteil </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

Agarose-Gelelektrophorese ist der effektivste Weg zur Trennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe im Bereich von 100 bp bis 25 kb 1. Agarose wird aus dem Seegras Gattungen Gelidium und Gracilaria isoliert und besteht aus wiederholten Agarobiose (L-und D-Galactose) Untereinheiten 2. Während Gelierung, assoziieren Agarose-Polymere nicht-kovalent und bilden ein Netzwerk von Bündeln, deren Porengröße eines Gels bestimmen die Eigenschaften molekularer Siebung. Die Verwendung von Agarosegelelektrophorese revolutioniert die Trennung von DNA. Vor der Verabschiedung von Agarosegelen wurde die DNA in erster Linie getrennt mit Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, die nur unter der Voraussetzung eine Annäherung an Größe. Um die DNA unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese zu trennen, wird die DNA in vorgefertigten Vertiefungen in dem Gel und einem angelegten Strom geladen. Die Phosphat-Rückgrat der DNA (oder RNA) Molekül negativ geladen ist, damit, wenn sie in einem elektrischen Feld platziert wird, um DNA-Fragmente der p migrierenositively geladenen Anode. Da die DNA weist eine einheitliche Masse / Ladungs-Verhältnis, werden DNA-Moleküle nach Größe in einem Agarosegel in einem solchen Muster, dass die Strecke umgekehrt proportional zu dem Protokoll seiner Molekulargewicht 3 getrennt ist. Das führende Modell für die DNA-Bewegung durch ein Agarosegel ist, wobei die Vorderkante nach vorne bewegt und zieht den Rest des Moleküls entlang 4 &quot;Reptation voreingenommen&quot;. ; 2) Agarose-Konzentration; 3) DNA-Konformation 5; 4) angelegten Spannung, 5) Gegenwart von Ethidiumbromid, 6), Typ 1) Größe des DNA-Moleküls: Die Rate der Migration von einem DNA-Molekül durch ein Gel wird durch folgende Faktoren bestimmt Agarose und 7) Elektrophoresepuffer. Nach der Trennung können die DNA-Moleküle unter UV-Licht sichtbar gemacht nach dem Färben mit einem geeigneten Farbstoff. Durch Einhalten dieses Protokoll sollen die Studierenden in der Lage: <ol><li> Verständnis des Mechanismus, durch den DNA-Fragmenten innerhalb einer Gelmatrix getrennt werden </li><li> Verstehen Sie, wie die Konformation desDNA-Molekül seine Mobilität durch einen Gel-Matrix zu bestimmen </li><li> Identifizieren Sie ein Agarose-Lösung geeigneter Konzentration für ihre Bedürfnisse </li><li> Bereiten Sie ein Agarosegel für die Elektrophorese von DNA-Proben </li><li> Richten Sie die Gelelektrophorese Apparate und Stromversorgung </li><li> Wählen einer geeigneten Spannung für die Trennung von DNA-Fragmenten </li><li> Verständnis des Mechanismus, durch den Ethidiumbromid ermöglicht die Visualisierung von DNA-Banden </li><li> Bestimmen Sie die Größen der aufgetrennten DNA-Fragmente </li></ol>

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Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Ein Basis-Protokoll für die Trennung von DNA-Fragmenten unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese beschrieben.

Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

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Research

JoVE Journal

Biology

759.4K Aufrufe.  University of California Los Angeles. Ein Basis-Protokoll für die Trennung von DNA-Fragmenten unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese beschrieben.

Serie: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio film communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 N sequence and how this sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.This is not a normal acry of my well, it needs to be kept at 60 degrees when it's run and the buffer needs to be pumped continuously. So we're gonna warm up the buffer for about an hour until it's at 60 degrees, and then we can run the towel. Now I'm gonna wash this plate with dilute uc solution, peeling around for impurities, andone, light that up.Anything like that can cause regularities. It is important to wipe off all the water. So when I assemble the gel, I'll put that chip on the outside of the gel.So the gel will be in between these two pieces of glass and the chip will be on the outside and it won't affect the gel in between. So now I'm gonna assemble the gel in these clamps and then I squeeze them together and tighten by turning to the right. As with any gel, it's important to make sure that the bottom is flush.To prevent making, we now turn the gel around and put it in here to get sealed with the gasket. So it's important when you do this that the gel, that the plates are actually lined up with the gasket here. So these knobs on the side then go in and you press down to type the seal.So this is a 30 mil syringe. And this part and this part come with the bio red kit and it just on like this. And that's just to get rid of the excess water in the tubes.So put the tubing onto the gel to load the gel. First you put an adapter into the tubing and then a needle look with that small adapter and put it right in the center of the gel just so it's fairly below the bottom glass. Then this wire adapter goes into the long tubing and it's going to connect to equal syringes containing the high and the low density solution.So these are pre-prepared solutions. The blue one, I've added a dye here that just indicates that this is the most denaturing solution and this is the least fitting train solution, the low density one. And they have everything in them.And now I'm gonna to make, gonna be Actually I twice as much the week. And once you've got the tempt, you have about five to seven minutes to fill the gel before the colon rises. And now we fill the syringe juice with the solution.So I'm gonna fill it with about 15 the solution. And then to get rid of any air bubbles, I'll turn it upside down and squeeze gently until that top air bubble is gone. Now this little screw here is gonna go into this groove.This adapter is gonna line up with this clamp here, and it's gonna get C clamped in very tightly. And then this tubing is gonna attach to the syringe. And the same thing is done on the other side with the high density matrix where it's time to deliver.And so I'm gonna be turning this wheel in a steady clockwise motion. And first the blue solution is gonna go out first because that's the the most in nature, and it's gonna form the bottom part of the gel. And then after a little while, the clear solution will start filling in the gel and the Gradient will be formed.One moment is the gently on an angle to And as soon as you finish pouring the gel to wash out your tubes immediately because they will polymerize Going, It's the group there. And then press down. So this little, And on the other side, I'll do the same thing.Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 F sequence and how the sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.So DGE is Dena gel electrophoresis. And basically the idea is that there's a gradient and the DNA, as it runs down the gradient gets de natured. And so different 16 species will stop at different points along the gradient.And so it ends up being a fingerprint of the different sexiness species in the community. So the goal of my experiment is to see who is in the community and how that's changing over time and space. And I can run the sexiness DDD gel and then I can cut out the bands and identify the species that are represented in each community.So one of the biggest issues when, when doing A DDG gel is to figure out the gradient that's the best. And so that is just something that needs to be played around with and figuring out for a particular community which type of gradient. So the one I'm using today is 35 to 55%urea.One of the big problems that can happen with this technique is that smears come up in in the leans. And I found for that, for whatever reason, one of the best things to do is to run the gels for a really long time and then the smears disappear. Well, today I'm just using it for general bacterial communities, but this can also be used for a specific family of bacteria to see how those change over time, and those tend to be very clean gels.You can also look at mutations in single genes with DDGE.

Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE)

Forschung

Biologie

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Optimierte Fibringel Bead Assay für das Studium der Angiogenese

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

Screening für Amyloid-Aggregation durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denaturierung Urea Polyacrylamidgelelektrophorese (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Electroeluting DNA Fragments

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a previous electrophoresis of the DNA fragments in order to separate the band of interest. Then, this band is excised out from an agarose or acrylamide gel and purified by using either: binding and elution from glass or silica particles, DEAE-cellulose membranes, "crush and soak method", electroelution or very often expensive commercial purification kits. Thus, selecting a method will depend mostly of what is available in the laboratory. The electroelution procedure allows one to purify very clean DNA to be used in a large number of applications (sequencing, radiolabeling, enzymatic restriction, enzymatic modification, cloning etc). This procedure consists in placing DNA band-containing agarose or acrylamide slices into sample wells of the electroeluter, then applying current will make the DNA fragment to leave the agarose and thus be trapped in a cushion salt to be recovered later by ethanol precipitation.

This procedure allows the purification of DNA fragments with high yield.

Electroeluting DNA-Fragmenten

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...