PDK wird durch eine CIHR Betriebskostenzuschuss (MOP 86523) unterstützt

1. Operationstechnik <ol><li> Experimente durchgeführt werden sollte unter aseptischen Bedingungen und nach der Nutzung von Tieren Protokolle Ihrer spezifischen Institution. Instrumente und Materialien (Lösungen, Testsubstanzen, Tracer, Nadeln, etc.) in Kontakt mit lebendem Gewebe müssen steril sein, um Infektionen und nachteilige Auswirkungen auf den Tierschutz und mögliche negative Auswirkungen auf die Studie zu verhindern. </li></ol> 2. Anästhesie <ol><li> Ratten werden anästhesiert mit einer tierärztlichen Isofluran Verdampfer-System. Verwenden medizinischen Sauerstoff mit einer Rate von 0,8 L / min auf die Isofluran-Gas zu verdampfen. Legen Sie das Tier in der beigefügten Anästhesie-Box und wählen Sie in einer Isofluran-Konzentration von 4% bis zum Atmen hat sich verlangsamt und das Tier beruhigen. </li><li> Als nächstes schalten Sie den Gasstrom auf die Gasmaske Aufsatz für den stereotaktischen Rahmen und Ort des Tieres in den stereotaktischen Apparat. Schalten Sie die Isofluran-Konzentration auf 2% und zu überwachen Anästhesie. Größere Tiere (&gt; 300g) kann eine höhere Konzentration von Isofluran. Anästhesie sollte während der Operation überwacht werden und Isofluran Dosierung entsprechend angepasst werden. Tiefe und Geschwindigkeit der Atmung sollte ständig evaluiert werden, und Zehe Prise Evaluation (alle 5 min) für das Fehlen der tiefen Schmerz durchgeführt werden soll. </li><li> Nach der Operation abgeschlossen ist, schalten Sie die Isofluran und damit das Tier atmen Sauerstoff für einige Minuten vor der Entnahme aus der stereotaktischen Gerät. Die Körpertemperatur sollte durch Abdecken des Tieres mit einem chirurgischen Decke und / oder mit einem geregelten Heizdecke während der Operation beibehalten werden. </li></ol> 3. Chirurgische Vorgehensweise <ol><li> Wet das Fell auf der Oberseite des Kopfes mit 70% Ethanol, um das Fell leichter zu schneiden. Entfernen Sie das Fell zwischen den Augenbrauen mit einem Klipper oder eine scharfe Schere. Reinigen Sie den Schnitt Fläche, die dreimal mit wechselnden Anwendungen von Jod Reinigungslösung (Proviodine, Betadine, etc) um 70% Ethanol gefolgt. Pflegen Sie die Hornhaut feucht während der Operation durch die Anwendung Augenheilkunde Augensalbe (Tears Naturale PM) auf die Hornhaut. Verbreiten Sie die Salbe über die Oberfläche der Hornhaut durch manuelles Öffnen und Schließen der Augenlider. </li><li> Mit einer Klinge Nr. 11, einen Einschnitt entlang der Mittellinie des Kopfes von ca. 0,5 cm vor die Augen zu 1 cm hinter den Augen. Ziehen Sie die Klappe der Haut über dem Auge mit einer Pinzette und sanft zu necken sich die zugrunde liegende Bindegewebe mit der Rückseite des Skalpells. Dann Einfahren der Hautlappen seitlich und nach unten und halten Sie ihn mit einem chirurgischen Haken, die an der Basis der stereotaktischen Instrument aufgezeichnet werden können. </li><li> Machen Sie einen Schnitt entlang des oberen Randes des orbitalen Knochen und ziehen auf die darüber liegende Faszie mit scharfen Zangen. Dies wird widerrufen Faszie der Augenhöhle. Der Rand der orbitalen Knochen deutlich mit Pinzette drücken Sie auf die Faszie der Umlaufbahn abgegrenzt werden. Mit einem Brenneisen Gerät oder Skalpell, weiter der Schnitt nach hinten in Richtung der hinteren Grenze der Augenhöhle. Verwenden Sie die Knochen der oberen Bahn als Leitfaden für den Schnitt. Next weiterhin den Schnitt nach vorne in Richtung der vorderen Begrenzung der Augenhöhle. Der Schnitt der überlegenen Bahn erfolgt am besten mit einem kleinen Brenneisen Gerät, um Blutungen aus dem zugrunde liegenden Schiffe, die die Kommunikation mit dem Venensinus zu verhindern. </li><li> Kommt es zu Blutungen in mehreren Schritten ergriffen werden können. Erstens, Druck mit sterilen chirurgischen Tupfern oder Wattestäbchen. Wenn die Blutung anhält, wenden kalten, sterilen Phosphatpuffer (PBS), um den Bereich mit Hilfe einer Pipette und Druck aufrecht erhalten. Leichte Blutungen wird nach einigen Sekunden mit diesem Verfahren zu stoppen. Wenn die Blutung auftritt, gelten Traktion, um das Gewebe mit dem chirurgischen Tupfer oder Wattebausch, um die Quelle der Blutung zu identifizieren und schnell ausbrennen das kompromittierte Schiff. Nach dem Ausbluten enthalten ist, mit kaltem sterilem PBS auf die OP-Bereich von Blut zu reinigen. Der OP-Bereich sollten in regelmäßigen Abständen auf diese Weise gereinigt werden, um besser zu visualisieren Strukturen in der Augenhöhle. </li><li> Nach dem Einschnitt gereinigt worden ist, verwenden Sie Zangen und der Rückseite des Skalpells, um das Bindegewebe an der Rückseite des Auges, dass das Orbital Inhalte überlagert reinigen. Die Rückseite der Nr. 11 Skalpell arbeitet und die Spitze ist in Ordnung. Dies eröffnet tieferen Teile der Augenhöhle die Bereitstellung einer größeren chirurgischen Fenster zu arbeiten in. Verwenden Dumont # 7b scharf gebogenen geriffelten Zangen bei der Arbeit in die Augen, als ihre Krümmung und feinen Spitzen sind ideal für die Manipulation von Strukturen in den Orbit. Darüber hinaus helfen die Verzahnung mit Greif-Strukturen. </li><li> Dann entfernen Sie das Bindegewebe, das die ophthalmicus des Trigeminus-Nervs, die nahe der Mittellinie sitzt umgibt, und entfernen Sie die Nerven mit einer Pinzette. Dieser Schritt ist jedoch nicht notwendig, das Entfernen der Nerv wird einen größeren Fenster des Beitrittss zu den Sehnerv später. </li><li> Nach der Entfernung des Nervs, verwenden Pinzette auf die Blutgefäße unterhalb zurückziehen und vollständig ausbrennen des Schiffes. Dieser Schritt ist auch nicht erforderlich, ermöglicht jedoch Kauter des Schiffes es nach vorne bewegt werden, wodurch ein größeres Fenster, wenn der Sehnerv erreicht ist. </li><li> Mit einem scharfen Zange oder Pinzette, dass ihre Spitzen nach innen gebogen, sorgfältig auswählen und entfernen Sie die dünne Schicht von Bindegewebe in den Augenmuskeln und Tränendrüse zu haben. Ziehen Sie die zusätzlichen Augenmuskeln von anterior nach der Umlaufbahn posterior. Grip im proximalen Teil des Muskels mit einer Pinzette und mit einem zweiten Paar von gekrümmten gezackten Auge Kornzange nach außen Traktion auf den Muskel anzuwenden. Stellen Sie sicher, dass das Auge Kornzange orientiert sind in die gleiche Richtung wie der Muskel beim Ziehen um zu verhindern, zu reißen. Entfernen Sie den vorderen Muskel des Orbits (Superior Oblique) auf diese Weise. Der Muskel wird frei werden von tief in der Umlaufbahn und die verbleibende Länge kann zurückgezogen, um das Auge nach außen zu drehen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.8 mit der nächsten Muskel (M. rectus medialis), die zwischen den Lappen der Tränendrüse und Harderschen Gland in der Nähe der Mittellinie der dorsalen Oberfläche des Auges befindet. Band nach der Retraktor Traktion auf die Muskeln zu erhalten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig alle verbleibenden Bindegewebe über die Oberfläche der Tränendrüse und heben die Drüse nach oben mit einer Pinzette. Nicht komprimieren oder drücken Sie die Drüse. Um die Drüse einfahren, muss nur ein einziges Schiff am hinteren Pol zu ätzen. Heben Sie das hintere Ende der Drüse nach oben, und dann ausbrennen des Schiffes. </li><li> Als nächstes Klappe die Tränendrüse uns auf den hinteren Teil der Bahn zu öffnen und ermöglichen ungehinderten Zugang zu den Muskeln, die den Sehnerv überlagern. Halten Sie den Bereich ständig feucht mit sterilem PBS und Trocknen mit chirurgischer Tupfer oder einem Wattestäbchen. </li><li> Mit scharfen Pinzette wieder entfernen die dünne Bindegewebe, das die Muskeln der hinteren Augenhöhle (Levator palpebrae superioris und Superior Rectus) umgibt und trennen Sie die zugrunde liegenden Bündel von Muskel. Ziehen Sie die Muskeln unabhängig oder im Einklang mit den gekrümmten gezackten Auge Kornzange wieder, Ziehen im Einklang mit den Muskelfasern. Bringen Sie die restlichen Muskeln Längen der Retraktor zusammen mit den Muskeln, die in den Schritten 3,8 und 3,9 und Band auf der Retraktor eingefahren wurden, um Traktion anzuwenden. Insgesamt 4 Muskeln werden nun an den Haken befestigt werden. Dies wird das Auge nach vorne und nach außen drehen, um das Fett mit Hülle, die den Sehnerv umgibt offenbaren. </li></ol> 4. Zugriff auf die Optic Nerve <ol><li> Scharfe Pinzetten (Fine Spitze Dumont), um nach oben zu ziehen auf das Bindegewebe, dass die fetthaltige Hülle des Sehnervs umgibt. Machen Sie einen Längsschnitt durch kleine Vannas Frühjahr Schere. Erweitern Sie den Schnitt als notwendig. Das Fett durch die Scheide enthaltenen beginnt zu wölben, wenn der Schnitt gemacht wird. Nächstes entfernen Sie die Klappen des Bindegewebes durch vorsichtiges Ziehen nach oben aus dem Rand-und Abschalten der halbmondförmigen Klappen des Gewebes. </li><li> Entfernen Sie das Fett über dem Sehnerv mit einer Pinzette auf das Fett zu ziehen, während des Schneidens mit dem Vannas Frühjahr Schere. Halten Sie den Bereich sauber mit sterilem PBS und chirurgische Tupfer auf die geringe Mengen von Blut, das aus der Entfernung des Gewebes entstehen zu reinigen. </li><li> Der Sehnerv ist nun sichtbar. Um die Nerven zuzugreifen, muss der meningealen Hülle, die den Nerv umgibt, ohne die Arteria ophthalmica, die der inneren Netzhaut-Feeds entfernt werden. Untersuchen Sie die vaskuläre Muster der meningealen Mantel mit einer Pinzette vorsichtig drehen die Scheide. Suchen Sie nach einem Bereich frei von Blutgefäßen und ermöglicht einen Längsschnitt in der meningealen Scheide vorgenommen werden. </li><li> Mit feiner Spitze Dumont Pinzetten, kneifen die Dura und nach oben ziehen. In der Nähe der Basis des dreieckigen Keil der Dura, die erstellt wird, verwenden Sie die Vannas Frühjahr Schere einen kleinen Schnitt in der Scheide zu machen. Legen Sie die untere Klinge der Schere in den Einschnitt und schnitt den Mantel parallel zu der Richtung des Sehnervs, Achten Sie darauf, das Gefäßsystem mit seitlichen Schnitten beschädigt. Verwenden Sie die Pinzette und Schere, um die Dura zu beiden Seiten des Sehnervs zu drapieren. </li><li> Die einzige verbleibende Abdeckung der Nerv ist der Arachnoidea. Es ist sehr dünn und transparent. Um festzustellen, ob die Membran noch vorhanden ist, mit scharfen Zangen an der Oberfläche der Nervenzellen zu kneifen. Es ist die Arachnoidea vorhanden ist, kneifen die Membran und ziehen Sie nach oben, um ein dreieckiger Keil von Gewebe zu schaffen. Machen Sie einen kleinen Schnitt mit der Spitze der Schere ähnlich zu 4,4 Schritt. Dann legen Sie die untere Klinge der Schere und einen Längsschnitt in der Arachnoidea. Als Nächstes verwenden Sie Ihre Scheren und Zangen, um die Arachnoidea an beiden Seiten des Sehnervs zu drapieren. </li><li> Mit einem Mikro-surgische Haken, heben den Sehnerv aus der meningealen Scheide. Pass die Spitze des Hakens um den äußeren Rand des Nerven und stellen Sie sicher, dass der Haken in Kontakt mit den Nerven bleibt, so dass Sie nicht fangen die Meningen mit dem Haken und versehentlich Transekt sie. Heben Sie den Sehnerv aus der meningealen Mantel und vollständig Transekt den Nerv hinter dem Punkt, von dem Haken unterstützt. Die Durchtrennung des Sehnervs Stumpf wird nun ein freies Ende, so dass für das Entfernen des Hakens. </li><li> Wenn die RGCs gehen, um retrograd markiert werden, um das Überleben zu quantifizieren, setzen Sie ein kleines Stück Gelschaum in 3% Fluorogold eingeweicht (oder eine andere retrograde Tracer) über den Sehnerv durchtrennt Stumpf (siehe <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2261">JoVE Protokoll 2261</a> ). </li></ol> 5. Closing-und Recovery <ol><li> Entlasten Sie die Traktion auf den zusätzlichen Augenmuskeln und Rückkehr des Auges in eine neutrale Position. Während dabei sicher, dass die Gelschaum nach unten drücken, in die Augenhöhle, um sicherzustellen, dass das Auge wieder an seinen Platz gedreht wird, die Gelschaum um den Sehnerv Stumpf bleibt. Bringen Sie die Tränendrüse und extra Augenmuskeln, ihre natürliche Stellung. </li><li> Bringen Sie die Hautlappen an der Mittellinie und Naht der Wunde. Apply Augen Augensalbe in beide Augen. Dann schalten Sie die Isofluran-Quelle und damit das Tier atmen Sauerstoff für einige Minuten. Legen Sie das Tier in einem beheizten Käfig oder einem Käfig unter einer Wärmelampe zu erholen. Stellen Sie keine Betten im Aufwachraum Käfig um die Chance Absaugen Betten während der Wiederherstellung auszuschließen. </li><li> Die Tiere sollten unabhängig nach der Operation untergebracht werden. Postoperativen Analgetika sollten nach den Richtlinien der Tierpflege Behörden verwaltet werden, und Tiere sollten sorgfältig nach der Operation überwacht werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Durchtrennung des Sehnervs führt zum Verlust von 90% der Verletzten RGCs innerhalb von 14 Tagen postaxotomy 9-11. Der wichtigste Mechanismus der RGC Tod Apoptose 9, 12. Die normale Dichte von RGCs liegt bei etwa 2500 Zellen / mm 2. Epifluoreszenz oder konfokale Bildgebung lassen sich retrograd markierten RGCs nach Axotomie zu visualisieren. RGC Apoptose wird von ca. 4 Tage nach Axotomie verzögert, so dass ein Zeitfenster für experimentelle Manipulationen. An 1 Tag nach Axotomie und retrograde Markierung mit Fluorogold sind RGC Zellkörper in den Ganglienzellen der Netzhaut und Axon Faszikel in der Nervenfaserschicht der Netzhaut deutlich sichtbar, wenn Abbilden einer flatmounted Vorbereitung (Abb. 1a). Mit 14 Tagen nach Axotomie, hat die Mehrheit der RGCs starb, und ein paar verbliebenen RGCs zwischen retinalen Mikroglia (Abb. 1b) durchsetzt. Wenn RGCs Apoptose, Mikroglia phagozytieren die toten Zellen und als Folge werden transzellulär mit dem fluoreszierenden Tracer, mit denen die RGCs 13, 14 Label gekennzeichnet. Das Aussehen der Tracer in den Phagosomen von Mikroglia unterscheidet sich von dem in überlebenden RGCs. Mikrogliazellen enthalten die Tracer in hochkonzentrierter und extrem helle Phagosomen, die relativ groß und verstreut ihre Zytoplasma (Abb. 1c). RGCs haben eine mehr diffuse Muster der Färbung (Abb. 1c) mit kleinen punktförmigen Vesikel, die retrograd haben ihre Axone transportiert Einreichung Zytoplasma der Zelle. Diese Vesikel sind viel kleiner und haben weniger intensive Fluoreszenz so dass man zum Überleben RGCs von Mikroglia unterscheiden. Darüber hinaus haben Mikroglia viel kleinere Zellkörper und neigen dazu, sternförmig oder amöboide Morphologie zu RGCs, dass relativ große und abgerundete Zellkörper widersetzt haben. Die dendritischen Bäume RGCs kann auch helfen, unterscheiden sie von den kurzen hellen Prozesse der Mikroglia bei der Quantifizierung Überleben der Zelle. Das Überleben der Zelle kann in verschiedenen Regionen der Netzhaut quantifiziert werden und die Dichte (Zellen / mm 2) kann aus dem Bereich der entsprechenden Aufnahmen extrapoliert werden, da RGCs in einer Monoschicht in den Ganglienzellen zu finden sind. <img src="/files/ftp_upload/2241/2241fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Epifluoreszenz Aufnahmen von Fluorogold gekennzeichnet RGCs nach Axotomie und Anwendung der Tracer an den Sehnerv Stumpf. (A) 1 Tag nach Axotomie RGCs und deren Axon Faszikel mit der Tracer in einer feinen punktförmigen Weise gekennzeichnet. (B) Mit dem 14 Tage nach Axotomie, haben 90% der RGCs starb und hell markierte Mikroglia phagozytiert toten Zellen sind ebenfalls mit dem Tracer markiert haben. (C) Höhere Vergrößerung illustriert den Unterschied zwischen RGCs und Mikroglia (rote Pfeile) bei 14 Tagen postaxotomy. Balken in A und B ist 50 pm. Maßstabsbalken in C ist 25 um.

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	<li>Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+or+let+die+-+retinal+ganglion+cell+death+and+survival+during+development+and+in+the+lesioned+adult+CNS.">Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS.</a> Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).</li><li>Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+retinal+ganglion+cell+development,+survival,+and+regeneration.">Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration.</a> Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).</li><li>Koeberle, P. D., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+guidance+cues+for+regenerating+axons:+where+have+they+gone.">Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone.</a> J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).</li><li>Weishaupt, J. H., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+as+a+model+for+neuronal+apoptosis+in+the+central+nervous+system+-+molecular+death+and+survival+pathways.">Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways.</a> Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).</li><li>Valenzuela, G. a. r. c. i. a., E, S. C. S. h. a. r. m. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+retinal+ganglion+cells+from+axotomy-induced+apoptosis+through+TRK+oncogene+transfer.">Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer.</a> Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).</li><li>Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+by+adenoviral+vector+administration+at+the+optic+nerve+stump:+an+in+vivo+model+system+for+the+inhibition+of+neuronal+apoptotic+cell+death.">Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death.</a> Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).</li><li>Lingor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+apoptosis+mediators+by+RNAi+inhibits+axotomy-induced+retinal+ganglion+cell+death+in+vivo.">Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo.</a> Brain. 128, 550-558 (2005).</li><li>Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+adenoviral-mediated+gene+transfer+of+interleukin-10,+interleukin-4,+and+transforming+growth+factor-beta+on+the+survival+of+axotomized+retinal+ganglion+cells.">Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells.</a> Neuroscience. 125, 903-920 (2004).</li><li>Berkelaar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy+results+in+delayed+death+and+apoptosis+of+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats.">Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).</li><li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+peripheral+nerve+grafts+on+the+survival+and+regrowth+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats.">Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 8, 265-280 (1988).</li><li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+protracted+phases+of+retinal+ganglion+cell+loss+follow+axotomy+in+the+optic+nerve+of+adult+rats.">Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats.</a> J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).</li><li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+death+in+experimental+glaucoma+and+after+axotomy+occurs+by+apoptosis.">Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).</li><li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+transcellular+carbocyanine-labelling+of+rat+retinal+microglia+during+injury-induced+neuronal+degeneration.">Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration.</a> Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).</li><li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+transcellular+staining+of+microglia+in+the+adult+rat+after+traumatic+degeneration+of+carbocyanine-filled+retinal+ganglion+cells.">Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells.</a> Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).</li></ol>

Es gibt viele Variationen dieses chirurgischen Eingriffs und einige der Schritte in diesem Protokoll sind nicht erforderlich. Es ist nur notwendig, um die Muskeln, die den Sehnerv überlagern, um Zugriff auf die Nerven zu gewinnen zurückzuziehen. Allerdings, so resultiert dies in einer sehr begrenzten Arbeitsraum um den Nerv der kritischen Endphase der Durchtrennung erschwert. In bestimmten Situationen ist es wünschenswert, dass die Zellen des Sehnervs Stumpf und den erhöhten Zugang Raum durch Zurückziehen aller Aug...

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		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Gas Mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anesthesia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VetEquip</td>
<td>901806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (PrAErrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter Corp</td>
<td>DIN 02225875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI, Zeiss, Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>39286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gelfoam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacia &amp; Upjohn</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tears Naturale P.M.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proviodine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Medline</td>
<td>MDS093945H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine tip Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro surgical hook</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10062-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eye dressing serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #7b sharp curved serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11270-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cauterizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18010-00</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optic nerve transection: a model of adult neuron apoptosis in the central nervous system

Retinalen Ganglienzellen (RGC) sind ZNS-Neuronen, die Ausgabe visueller Informationen aus der Netzhaut zum Gehirn über den Sehnerv. Der Sehnerv kann innerhalb der Augenhöhle zugegriffen werden und vollständig durchtrennt (axotomized), Schneiden der Axone des gesamten RGC Bevölkerung. Sehnerv durchtrennt ist ein reproduzierbares Modell der apoptotischen Zelltod in der erwachsenen ZNS 1-4. Dieses Modell ist besonders attraktiv, weil der Glaskörper des Auges dient als Kapsel für Drug-Delivery auf die Netzhaut und ermöglicht experimentelle Manipulationen via intraokularen Injektionen. Die Diffusion von Chemikalien durch den Glaskörper sorgt dafür, dass sie sich auf die gesamte Bevölkerung RGC handeln. Darüber hinaus können RGCs selektiv, indem short interfering RNAs (siRNAs), Plasmide oder virale Vektoren, um das abgeschnittene Ende des Sehnervs 5-7 oder Injektion Vektoren in ihrem Ziel, dem Colliculus superior 8 transfiziert werden. Dies ermöglicht es den Forschern um apoptotische Mechanismen in der gewünschten neuronalen Population ohne verwirrende Auswirkungen auf andere Zuschauer Neuronen oder Gliazellen um zu studieren. Ein weiterer Vorteil ist die Leichtigkeit und Genauigkeit, mit der das Überleben der Zelle nach der Verletzung quantifiziert werden können. Die Netzhaut ist eine flache, geschichtete Gewebe und RGCs sind in der innersten Schicht der Ganglienzellen lokalisiert. Das Überleben der RGCs kann im Laufe der Zeit durch die Anwendung eines fluoreszierenden Tracer (3% Fluorogold), um das abgeschnittene Ende des Sehnervs zum Zeitpunkt der Axotomie oder durch Injektion des Tracers in die Colliculus superior (RGC target) eine Woche vor verfolgt werden Axotomie. Der Tracer wird retrograd transportiert, Kennzeichnung der gesamten RGC Bevölkerung. Da die Ganglienzellschicht ist eine Monoschicht (eine Zelle dick), kann RGC Dichten in Flach-montiert Gewebe quantifiziert werden, ohne die Notwendigkeit für Stereologie. Sehnerv durchtrennt führt zum apoptotischen Tod von 90% der Verletzten RGCs innerhalb von 14 Tagen postaxotomy 9-11. RGC Apoptose hat einen charakteristischen zeitlichen Verlauf, wobei Zelltod 3-4 Tage postaxotomy, wonach die Zellen schnell degenerieren verzögert wird. Dies ermöglicht ein Zeitfenster für experimentelle Manipulationen gegen Signalwege der Apoptose beteiligt sind.

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Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Optic Nerve Durchtrennung ist eine weit verbreitete Modell der erwachsenen ZNS-Verletzung. Neunzig Prozent der retinalen Ganglienzellen (RGC), deren Axone sind vollständig durchtrennt (Axotomie) sterben innerhalb von 14 Tagen nach Axotomie. Dieses Modell ist leicht zugänglich experimentelle Manipulationen und hoch reproduzierbar.

Optic Nerve Durchtrennung: Ein Modell des Adult Neuron Apoptose in das zentrale Nervensystem

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

optic-nerve-transection-model-adult-neuron-apoptosis-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.5K Aufrufe.  University of Toronto. Optic Nerve Durchtrennung ist eine weit verbreitete Modell der erwachsenen ZNS-Verletzung. Neunzig Prozent der retinalen Ganglienzellen (RGC), deren Axone sind vollständig durchtrennt (Axotomie) sterben innerhalb von 14 Tagen nach Axotomie. Dieses Modell ist leicht zugänglich experimentelle Manipulationen und hoch reproduzierbar.

Serie: Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Methoden für die experimentelle Manipulationen nach Optic Nerve Durchtrennung im Säuger-ZNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In-vivo-Abfrage des Zentralen Nervensystems durch Translatome Polyribosom Fraktionierung

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Visuell evozierten Potential-Aufnahme in einem Rattenmodell für Experimentelle Optic Nerve Demyelinisierung

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection is considered a useful and reproducible model. Compared with other optic nerve injury models used commonly for assessing secondary degeneration, e.g. complete optic nerve transection and optic nerve crush models, the partial optic nerve transection model is superior as it distinguishes primary from secondary degeneration in situ. Therefore, it serves as an excellent tool for evaluating secondary degeneration. This study describes a novel operative approach of partial optic nerve transection by directly accessing the area of the retrobulbar optic nerve through the orbital lateral wall of the eyeball. Moreover, we present a newly designed, low cost surgical instrument to assist with transection. As demonstrated by the representative results in distinguishing the boundary of primary and secondary injury areas, the new approach and instrument ensures high efficiency and stability of the model by providing adequate space for surgical operation. This in turn makes it easy to separate the meningeal sheath and ophthalmic vessels from the optic nerve before transection. An additional benefit is that this space-saving operative approach improves the investigators&#39; ability to administer drugs, carriers, or selective RGC tracers to the stump of the partially transected optic nerve, allowing the exploration of mechanisms behind secondary injury in RGCs, in a new way.

Secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. This study describes an innovative operative approach for partial optic nerve transection. The use of this space-saving operative approach extends the model's application range, and allows exploration of secondary injury mechanisms in RGCs in a new way.

Partielle Sehnerv Durchtrennung bei Ratten: ein Modell gegründet mit einem neuen operativen Ansatz zur sekundären Degeneration der retinalen Ganglienzellen bewerten

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with neurodegenerative diseases or injuries, but also in the normal brain. Here, we describe a newly-established micromechanical system to rapidly, reliably, and reversibly induce axonal varicosities, allowing us to understand the mechanisms governing varicosity formation and heterogeneous protein composition. This system represents a novel means to evaluate the effects of compression and shear stress on different subcellular compartments of neurons, different from other in vitro systems that mainly focus on the effect of stretching. Importantly, owing to the unique features of our system, we recently made a novel discovery showing that the application of pressurized fluid can rapidly and reversibly induce axonal varicosities through the activation of a transient receptor potential channel. Our biomechanical system can be utilized conveniently in combination with drug perfusion, live cell imaging, calcium imaging, and patch clamp recording. Therefore, this method can be adopted for studying mechanosensitive ion channels, axonal transport regulation, axonal cytoskeleton dynamics, calcium signaling, and morphological changes related to traumatic brain injury.

This protocol describes a physiologically relevant, pressurized fluid approach for rapid and reversible induction of varicosities in neurons.

Ein Microbiomechanical-System für das Studium Varizen-Bildung und Erholung in zentralen Neuronen Axone

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...