PDK wird durch eine CIHR Betriebskostenzuschuss (MOP 86523) unterstützt

1. Operationstechnik <ol><li> Experimente durchgeführt werden sollte unter aseptischen Bedingungen und nach der Nutzung von Tieren Protokolle Ihrer spezifischen Institution. Instrumente und Materialien (Lösungen, Testsubstanzen, Tracer, Nadeln, etc.) in Kontakt mit lebendem Gewebe müssen steril sein, um Infektionen und nachteilige Auswirkungen auf den Tierschutz und mögliche negative Auswirkungen auf die Studie zu verhindern. </li></ol> 2. Anästhesie <ol><li> Ratten werden anästhesiert mit einer tierärztlichen Isofluran Verdampfer-System. Verwenden medizinischen Sauerstoff mit einer Rate von 0,8 L / min auf die Isofluran-Gas zu verdampfen. Legen Sie das Tier in der beigefügten Anästhesie-Box und wählen Sie in einer Isofluran-Konzentration von 4% bis zum Atmen hat sich verlangsamt und das Tier beruhigen. </li><li> Als nächstes schalten Sie den Gasstrom auf die Gasmaske Aufsatz für den stereotaktischen Rahmen und Ort des Tieres in den stereotaktischen Apparat. Schalten Sie die Isofluran-Konzentration auf 2% und zu überwachen Anästhesie. Größere Tiere (&gt; 300g) kann eine höhere Konzentration von Isofluran. Anästhesie sollte während der Operation überwacht werden und Isofluran Dosierung entsprechend angepasst werden. Tiefe und Geschwindigkeit der Atmung sollte ständig evaluiert werden, und Zehe Prise Evaluation (alle 5 min) für das Fehlen der tiefen Schmerz durchgeführt werden soll. </li><li> Nach der Operation abgeschlossen ist, schalten Sie die Isofluran und damit das Tier atmen Sauerstoff für einige Minuten vor der Entnahme aus der stereotaktischen Gerät. Die Körpertemperatur sollte durch Abdecken des Tieres mit einem chirurgischen Decke und / oder mit einem geregelten Heizdecke während der Operation beibehalten werden. </li></ol> 3. Spritze Vorbereitung für Intraokularlinsen-Injektionen <ol><li> Zunächst versammeln sich die Spritze zur Durchführung des intraokularen Injektionen. Ein 10 l RN Gasdichte 1701 Hamilton-Spritze ist zur Injektion verwendet. Entfernen Sie alle Nadel oder RN Mutter auf dem Ende der Spritze. </li><li> Legen Sie die PFA Ferrule in die PEEK Tasse Ferrule der Klemmverschraubung. Dann legen Sie die komplette Montage in das Ende der Spritze und lose Schraube der RN Mutter über top. </li><li> Legen Sie das eine Ende des 1 / 16 inch PEEK-Schlauch in die Klemmverschraubung, durch die Öffnung in der RN Mutter. Achten Sie darauf, die PEEK-Schlauch richtig sitzt. Ziehen Sie die RN Mutter, um die Ferrule zu komprimieren, Abdichten der PEEK-Schlauch. </li><li> Führen Sie Schritt 3.2 an beiden Enden des Dual RN Glas Koppler. Befestigen Sie das freie Ende des PEEK-Schlauch an einem Ende des Dual RN Glas Kupplung durch Anziehen der RN Mutter. </li><li> A gezogen Glasmikropipette bilden die Nadel und Zylinder für die Einspritzanlage. Verwenden Sie 1,5 mm OD dickwandige Glas Kapillarrohr auf das Glas Pipetten herzustellen, und legen Sie die Glaspipette in das freie Ende des Dual RN Glas Koppler. Ziehen Sie die RN Mutter, um die Pipette zu fixieren. </li><li> Die feine Spitze gezogen Glasmikropipetten ist in der Regel zu klein für die Durchführung von intraokularen Injektionen. Um ein Trinkgeld von entsprechenden Durchmesser zu schaffen, brechen die Spitze der Glaspipette unter Sichtkontrolle mit einem Operationsmikroskop. Der mattierte Ende ein Glas Objektträger ist gut geeignet, um die Pipette zu brechen. Halten Sie die Pipette in einem Winkel und reiben Sie die Spitze entlang der Glas Zuckerguss, eine Pause zu schaffen. Idealerweise sollte die abschließende Spitze leicht abgeschrägt werden. Es kann einige Versuche, einen guten Tipp produzieren zu nehmen, so ziehen mehrere Pipetten vor Gebrauch. </li><li> Das Einspritzsystem ist hydraulisch. Daher muss die Spritze, PEEK-Schlauch-Linker, Dual RN Glas-Koppler und Glasmikropipette mit Mineralöl vor der Verwendung befüllt werden. Mit dem Priming-Kit von Hamilton Spritze Co. (PRMKIT), füllen Sie die Grundierung Spritze mit Mineralöl. Verwenden Sie einen großen Durchmesser Nadel leichte Passage des viskosen Öl zu ermöglichen. Ersetzen Sie die Nadel mit der Hamilton 90030 Nadel, die in den Lauf der 10 ul Hamilton Spritze passt. Als nächstes legen Sie eine Gummi-septum über die Hamilton 90030 Nadel, um eine Abdichtung während der Injektion der Mineralölindustrie. </li><li> Legen Sie die Hamilton 90030 Nadel des Priming Spritze in den Rücken der Lauf der 10 l Hamilton-Spritze des Einspritzsystems. Drücken Sie die Scheidewand dicht an das Ende der Spritze, um eine Dichtung zu schaffen. </li><li> Drücken Sie langsam den Kolben. Sie finden die Mineralöl-Durchlauf durch die Glaselemente der Einspritzanlage zu sehen, und schließlich Befüllen der Glaspipette. Schieben Sie das gesamte Öl durch die Einspritzanlage, um eventuell vorhandene Luftblasen an der Darm-Trakt zu entfernen. Wenn die Füllung Spritze läuft aus Mineralöl, langsam ziehen Sie die Nadel unter ständigem Verzicht Öl Luftblasenbildung zu verhindern. Füllen Sie die Grundierung Spritze aufgezogen und wieder. </li><li> Wenn das gesamte System mit Mineralöl und blasenfrei gefüllt ist, legen Sie die Original-Stempel der 10 l Hamilton-Spritze. Drücken Sie den Kolben bis zum Ende seiner Reise, um zusätzliche Mineralöl aus dem System zu entfernen. Wischen Sie die Glasmikropipette sauber und das Ende der Spritze sauber mit 70% Ethanol. </li><li> Withdraw den Kolben der Spritze an die 2 ul Markierung auf den Lauf. Das Ende der Glasmikropipette wird mit Luft bietet eine Pufferzone zwischen der Mineralölindustrie und der gewünschten Flüssigkeit injiziert werden zu füllen. Die Pipette Fass kann nun, indem sie das Ende der Mikropipette in die gewünschte Lösung und Aberkennung der Kolben der Hamilton-Spritze gefüllt werden. Injizieren Sie nicht mehr als 4-5 ul der Lösung in einer erwachsenen Ratte Auge. </li></ol> 4. Intraokulare Injektion Vorgehensweise: Targeting der Retina Globally <ol><li> Mit dem Tier narkotisiert und gesichert in den stereotaktischen Rahmen (wie in Abschnitt 2 beschrieben), verwenden Sie Alcaine Augentropfen topisch zu betäuben der Hornhaut. Öffnen Sie die Augenlider mit den Fingern und einen Tropfen des Anästhetikums Lösung auf der Oberfläche der Hornhaut. </li><li> Injection zwei Personen benötigt: eine der Glaspipette in den Glaskörperraum einzufügen und zu pflegen Pipette Position, und ein anderer auf den Kolben der Spritze die gewünschte Lösung liefert drücken. </li><li> Unter einem Operationsmikroskop, greifen die Glasmikropipette-und Dual-RN Glas Koppler mit den Fingern. Verbreiten Sie die Augenlider mit den Fingern der freien Hand und bilden ein &quot;V&quot;-Form gegenüber der Injektionsstelle. Durch die Anwendung Traktion auf die Augenlider, wird das Auge aus der Augenhöhle angehoben werden, Freilegung der hinteren Fläche hinter dem Limbus. Durch die Schaffung eines &quot;V&quot;-Form mit den Fingern gegenüber der Injektionsstelle, ist eine Wiege für das Auge bieten Stabilität bei der Injektion gebildet. </li><li> Schieben Sie die Spitze des Glasmikropipette durch die Bindehaut, in einem Gebiet ohne Blutgefäße, und durch die Lederhaut, in einem Winkel nach unten. Sie sollten sich ein kleines &quot;Plopp&quot;, wenn die Pipette dringt in die Lederhaut. Einsetzen der Pipette in einem leichten Winkel nach unten reduziert die Wahrscheinlichkeit des Schlagens das Objektiv beim Einsetzen der Nadel. </li><li> Die Person, die die Spritze sollte nun injizieren die 4 ul Lösung durch Drücken Sie den Kolben auf die 2 ul Markierung auf der Spritze. Die Injektion sollte etwa 1-2 Sekunden in insgesamt nehmen. Injektion mit einer sehr langsamen Geschwindigkeit&gt; 3 Sekunden reduziert die anfängliche Ausbreitung der Lösung durch den Glaskörper. Sie können auf die injizierte Lösung Spülung durch den Glaskörper unter dem Mikroskop zu sehen, damit die Überprüfung der Erfolg des Eingriffs. </li><li> Halten Sie die Mikropipette stetigen für ca. 5 Sekunden und dann zurücktreten, in die gleiche Richtung wie die Nadel eingeführt wurde. Die Bindehaut wird wieder Klappe über die kleine Öffnung, um so die Lederhaut-Stich-Dichtung. </li><li> Bedecken Sie die Oberfläche der Hornhaut mit ophthalmologischen Augensalbe (Tears Naturale PM), um Hornhaut Trocknung während der Wiederherstellung zu verhindern, und wieder das Tier zu einer Erholung Käfig. </li><li> Post-OP-Analgetika sollten nach den Richtlinien der Tierpflege Behörden verwaltet werden, und Tiere sollten sorgfältig nach der Operation überwacht werden. </li></ol> 5. Selektives Targeting retinalen Ganglienzellen aus dem Optic Nerve Stump <ol><li> Anwenden von Tracer-, Drogen-, Plasmide, siRNAs oder virale Vektoren zu Sehnerv Stumpf nach Axotomie, zielt direkt retinalen Ganglienzellen durch retrograden Transport. Hierzu wird zunächst der Durchführung einer Sehnerv durchtrennt nach dem &quot;Optic Nerve Durchtrennung Protocol&quot; 22 erreicht. </li><li> Es gibt zwei Methoden, um dieses Verfahren durchzuführen: mit Gelschaum oder direkte Injektion in den Sehnerv. </li><li> Die Gelschaum Methode ähnelt retrograde Tracing, aber bei der Auslieferung von experimentellen Behandlungen an den Sehnerv ist es wünschenswert, pre-Label der retinalen Ganglienzellen durch die Injektion retrograde Tracer in den Colliculus superior 1 Woche vor Axotomie. Dies ist für die Zell-Tracing, weil in einigen Fällen neuronale Tracer mit dem retrograden Transport von experimentellen Substanzen oder umgekehrt stören können wichtig. </li><li> Unmittelbar nach den Sehnerv geschnitten wird, ist ein kleines Stück Gelschaum in der experimentellen Lösung getränkt über die durchtrennten Sehnerven Stumpf gelegt. Die Orbital-Inhalte werden dann in ihre vorherige Position zurück. Wenn das Auge ist es, eine neutrale Position ist es notwendig, Pinzette verwenden, um das Stück Gelschaum hinunter in die Umlaufbahn zu drücken, dass es über das Ende des Sehnervs bleibt zurück. </li><li> Die Injektionstechnik ist effektiver für die Lieferung von Stoffen, die den Zugang in das Cytoplasma des Axons gewinnen müssen, um retrograd durch Axoplasmafluß transportiert werden. Dazu gehören siRNAs und Plasmide, und in einigen Fällen viraler Vektoren. A 5-10 ul Hamilton-Spritze wird verwendet, um die gewünschte Lösung in den durchtrennten Sehnerven zu injizieren. </li><li> Fassen Sie den Rand des Sehnervs mit feiner Spitze Dumont Pinzetten. Führen Sie das Ende der Nadel in den Sehnerv, parallel mit den Nerven, bis die Schräge nicht mehr sichtbar ist. Die eingesetzten Nadel wird auf allen Seiten umgeben sein von den Nerven. Eine Nadel mit einem kurzen Kegel ist wünschenswert. </li><li> Sobald die needle in den Nerven eingelegt ist, drücken Sie vorsichtig die Seiten des Nerven mit der feinen Spitze Pinzette und injizieren ein Viertel der Lösung beim Drehen der Spritze eine viertel Umdrehung im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn. </li><li> Weiter wiederholen Schritt 5,7 bis Sie eine vollständige Drehung der Nadel abgeschlossen haben und injiziert den gesamten Inhalt der Spritze. Für beste Ergebnisse zu injizieren insgesamt 10 ul Lösung mit einer gasdichten 10 l Hamilton-Spritze. </li><li> Entfernen Sie die Spitze der Spritze aus dem Nerv. Lassen Sie die überschüssige Flüssigkeit injiziert, die von den Nerven in die Umlaufbahn Rückfluss erhitzt hat, da dies einen zusätzlichen Pool für die Aufnahme durch die Enden der Axone bilden wird. </li><li> Bringen Sie die Orbital Inhalte in ihre ursprüngliche Position, in der Nähe der Wunde, und damit das Tier sich zu erholen. </li><li> Post-OP-Analgetika sollten nach den Richtlinien der Tierpflege Behörden verwaltet werden, und Tiere sollten sorgfältig nach der Operation überwacht werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Intraokularen Injektionen richten sich an alle Zellen in der Netzhaut global und funktionieren gut für die Lieferung Substanzen verletzt RGCs seit Ganglienzellen in der innersten neuronalen Schicht der Netzhaut, angrenzend an den Glaskörperraum befinden. RGCs kann auch direkt durch Abgabe von Stoffen, die durchtrennten Sehnerven Stumpf ausgerichtet sein. Fluorogold retrograd markierten RGCs können gezielte Verwendung von Peptiden, Drogen, Vektoren, Plasmide oder siRNAs aus dem Nervenstumpf wie in Abbildung 1 dargestellt werden. Abbildung 1A-C zeigt die Lokalisation eines Cy3 markierte Peptid in der Somata RGCs, dass durch die Injektion in den Colliculus superior Fluorogold wurden bereits beschriftet. Cy3 markierten Peptiden wurden in den Sehnerv unmittelbar nach Axotomie injiziert, und die Netzhaut abgebildet wurde lebendig, um die Peptide aus Auslaugen des Gewebes zu verhindern während der Fixierung. 1D-F zeigt die Lokalisierung von Cy3 markierten siRNAs und die retrograde Tracer in axotomized RGCs Fluorogold. Cy3 markierten siRNAs wurden in den Sehnerv Stumpf sofort nach Axotomie injiziert, und die Netzhaut abgebildet wurde lebendig. <img src="/files/ftp_upload/2261/2261fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Epifluoreszenz Aufnahmen von RGCs in flatmounted Netzhaut an 1 Tag nach Axotomie und Injektion von entweder markierten Peptiden oder siRNAs in den Sehnerven Stumpf. (A) Fluorogold retrograde Markierung in axotomized RGCs an 1 Tag postaxotomy (B) Cy3 Fluoreszenz in RGCs folgende retrograde Transport von markierten Peptiden, 1 Tag nach Axotomie und Peptid-Injektion in den Sehnerv. (C) Überlagerung von (A) und (B) zeigen die selektive Lokalisierung von Cy3 markierten Peptiden in Fluorogold gekennzeichnet RGCs. (DF) Die Zellkörper der Fluorogold gekennzeichnet RGCs (D) sind auch mit Cy3 markiert siRNAs (E) in den Sehnerven Stumpf injiziert 24 Stunden früher als in der Überlagerung (F) gezeigt gefüllt. Maßstabsbalken in AC ist 50 pm. Maßstabsbalken in DF ist 20 um.

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Sehnerv durchtrennt ist ein hoch reproduzierbares Modell der erwachsenen ZNS-Neuron Apoptose. Die experimentelle Manipulationen in diesem Manuskript gezeigt erlauben das Studium der Mechanismen der Apoptose RGC nach der Verletzung. Intraokularen Injektionen sind für die globale Ausrichtung der Netzhaut nützlich. Dieses Verfahren erfordert einige Übung, da es wichtig ist, dass Sie das Objektiv mit der Spitze der Glaspipette verletzen. Objektiv beschädigt wurde gezeigt, dass die Freisetzun...

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Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Gas Mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anesthesia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VetEquip</td>
<td>901806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (PrAErrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter Corp</td>
<td>DIN 02225875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI, Zeiss, Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alcaine Eye Drops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tears Naturale P.M.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine tip Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2&#x201D;/2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>80030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch Compression Fittings</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55751-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supelco, Bellefonte, PA</td>
<td>Z226661</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual RN Glass Coupler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55752-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>PRMKIT</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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methods for experimental manipulations after optic nerve transection in the mammalian cns

Retinalen Ganglienzellen (RGC) sind ZNS-Neuronen, die Ausgabe visueller Informationen aus der Netzhaut zum Gehirn über den Sehnerv. Der Sehnerv kann innerhalb der Augenhöhle zugegriffen werden und vollständig durchtrennt (axotomized), Schneiden der Axone des gesamten RGC Bevölkerung. Sehnerv durchtrennt ist ein reproduzierbares Modell der apoptotischen Zelltod in der erwachsenen ZNS 1-4. Dieses Modell ist besonders attraktiv, weil der Glaskörper des Auges dient als Kapsel für Drug-Delivery auf die Netzhaut und ermöglicht experimentelle Manipulationen via intraokularen Injektionen. Die Diffusion von Chemikalien durch den Glaskörper sorgt dafür, dass sie sich auf die gesamte Bevölkerung RGC handeln. Virale Vektoren, Plasmide oder short interfering RNAs (siRNAs) kann auch auf die Glaskörperraum geliefert werden, um zu infizieren oder zu transfizieren Netzhautzellen 5-12. Die hohen Tropismus Adeno-Associated Virus (AAV)-Vektoren ist vorteilhaft für Ziel RGCs, mit einer Infektionsrate von annähernd 90% der Zellen in der Nähe der Injektionsstelle 6, 7, 13-15. Darüber hinaus können RGCs selektiv, indem siRNAs, Plasmide oder virale Vektoren, um das abgeschnittene Ende des Sehnervs 16-19 oder Einspritzen Vektoren in ihrem Ziel der Colliculus superior 10 transfiziert werden. Dies ermöglicht es den Forschern um apoptotische Mechanismen in der verletzten neuronalen Population ohne verwirrende Auswirkungen auf andere Zuschauer Neuronen oder Gliazellen um zu studieren. RGC Apoptose hat einen charakteristischen zeitlichen Verlauf, wobei Zelltod 3-4 Tage postaxotomy, wonach die Zellen schnell degenerieren verzögert wird. Dies stellt ein Fenster für experimentelle Manipulationen gegen Signalwege der Apoptose beteiligt sind. Manipulationen, die direkt für die Zielgruppe RGCs aus der durchtrennten Sehnerven Stumpf sind zum Zeitpunkt der Axotomie durchgeführt, sofort nach dem Schneiden des Nervs. Im Gegensatz dazu, wenn Substanzen, die über eine intraokulare Route ausgeliefert werden, können sie vor der Operation oder innerhalb der ersten 3 Tage nach der Operation injiziert werden, vor der Einleitung der Apoptose in axotomized RGCs. In diesem Artikel zeigen wir verschiedene Methoden für experimentelle Manipulationen nach Sehnerv durchtrennt.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Optic Nerve Durchtrennung ist eine weit verbreitete Modell der erwachsenen ZNS-Verletzung. Dieses Modell ist ideal für die Durchführung einer Reihe von experimentellen Manipulationen, die die Netzhaut Ziel global oder direkt auf den verletzten neuronalen Population von retinalen Ganglienzellen.

Methoden für die experimentelle Manipulationen nach Optic Nerve Durchtrennung im Säuger-ZNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K Aufrufe.  University of Toronto. Optic Nerve Durchtrennung ist eine weit verbreitete Modell der erwachsenen ZNS-Verletzung. Dieses Modell ist ideal für die Durchführung einer Reihe von experimentellen Manipulationen, die die Netzhaut Ziel global oder direkt auf den verletzten neuronalen Population von retinalen Ganglienzellen.

Serie: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Optic Nerve Durchtrennung: Ein Modell des Adult Neuron Apoptose in das zentrale Nervensystem

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Forschung

Neurowissenschaften

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Ein Optic Nerve Crush Injury Mausmodell zur retinalen Ganglienzellen Survival Study

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

In-vivo-Imaging von Optic Nerve Fiber Integrität von Contrast-Enhanced MRI in Mäuse

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Minimal-invasive Technik für die Injektion in Ratten-Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Visuell evozierten Potential-Aufnahme in einem Rattenmodell für Experimentelle Optic Nerve Demyelinisierung

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to non-human primates. The large brain size of the pig allows the use of conventional clinical brain imagers and the direct use and testing of neurosurgical procedures and equipment from the human clinic. Further macroscopic and histological analysis, however, requires postmortem exposure of the pig central nervous system (CNS) and subsequent brain removal. This is not an easy task, as the pig CNS is encapsulated by a thick, bony skull and spinal column. The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and the pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.