Diese Arbeit wurde von der Human Frontier Science Program Organization (HFSP Award 2007, RGP0058/2007-C) unterstützt. Wir danken Prof. Richard Roberts für die Initiierung des Projektes und für fruchtbare Diskussionen.

<ol>
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I., Keller, A., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+model+for+identifying+proteins+by+tandem+mass+spectrometry.">A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 4646-4658 (2003).</li></ol>

ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger und HubertKosterare durch caprotec Bioanalytik GmbH, Inc, daß einige der Reagenzien in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.

Die folgenden Vorsichtsmaßnahmen und Anmerkungen kann nützlich sein, wenn nach dem beschriebenen Protokoll: a) Ein großer Vorteil der CCs liegt in der Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem CC und dem MTase, da dies eine nachträgliche stringentes Waschen Bedingungen. Die kovalente Vernetzung wird durch eine Photoreaktion durch UV-Licht (310 nm max.) Ausgelöst erreicht. Normale Oberlicht enthält nur einen kleinen Bruchteil der UV jedoch zum Schutz der SAH-CC von längeren Belichtungszeiten, um den Overhead oder sogar Sonnenlicht bis in die gesteuerte und gekühlte Bestrahlung im caproBox. b) Die biologischen Proben, aus denen die MTasen isoliert werden sollen können Proteine ​​neigen zur Denaturierung enthalten, folglich ist es zwingend erforderlich, damit die Proben zu kühlen und zu vermeiden Schaumbildung zu allen Zeiten. c) Die caproBox kühlt die Proben auf 0-4 ° C, die Lampen emittieren UV-Licht, aber auch Wärme abgeben. Deshalb ist es notwendig, kurz zentrifugieren die Fläschchen vor der Bestrahlung, so Proteine ​​Einhaltung der Kappen oder Fläschchen Wände können nicht Niederschlag bilden Samen. d) Falls eine erneute Aussetzung der magnetischen Kügelchen (z. B. in den Waschlösungen) ist nicht von Hand möglich ist, in Kürze gelten Ultraschall, indem die Proben in einem Ultraschallbad. e) Frisch bereiten die 0,2% TFA/60% ACN-Lösung. Wir fanden, dass sonst die aufgenommenen Proteine ​​nicht kann von den Beads abgespalten werden. f) Die abschließende Analyse der aufgenommenen Proteine ​​erfolgt durch LC-MS/MS durchgeführt. Die Massenspektrometrie ist eine hochempfindliche Methode. Es ist notwendig, ausschließlich LC-MS reinen Reagenzien in den letzten Schritten (Schritt 2.11 und weitere) zu verwenden. Vermeiden Sie die Kontamination der Experimente durch externe Protein-Quellen, z. B. Keratin aus Staub oder vom Experimentator. Besonders während der letzten Schritte der Verdauung, ist es empfehlenswert, die Aufmerksamkeit auf eine saubere Arbeitsfläche zu bezahlen, Handschuhe und einen Laborkittel und gegebenenfalls ein Haarnetz tragen oder im Idealfall führen Sie die letzten Schritte in einer sauberen Bank. Bereiten Sie die 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer für tryptischen Verdaus in LC MS-Wasser verwendet, Filter, durch 0,22 um Filter, Aliquot, Lagerung bei -20 ° C, und die Verwendung jedes Aliquot nur einmal zu Kontaminationen zu vermeiden. Die Trypsin-Lösung (Sequenzierung grade, Roche, Vorbereitung einer 0,5 ug / ul Lösung durch Zugabe von 1 mM HCl lyophilisiert Trypsin) kann bei 4 ° C gelagert werden für mehrere Wochen. g) Um eine zuverlässige Massenspektren zu erhalten ist es wichtig, einen stabilen Spray in ESI-MS/MS Analyse haben. h) Für andere LC-MS/MS Systeme als die in der vorliegenden Studie verwendet wird, muss Messparameter und Peptid Identifikationsalgorithmen individuell eingestellt werden. Die folgenden Änderungen werden mit Bezug auf die beschriebenen Protokoll möglich: a) Alternativ zur Freigabe der Proteine ​​von den Beads um 60% ACN/0.2% TFA (Schritt 2,11), können die Proteine ​​direkt tryptisch innerhalb eines Bead-Suspension (verdaut werden gleiche Volumen wie in Schritt 5.1) oder, für die SDS-PAGE können die Proteine ​​durch die Aussetzung und Heizung die Perlen nach dem Schritt von 2,9 bis 95 gesammelt veröffentlicht ° C für 10 min in SDS-Probenpuffer (beide, die ganze Aussetzung oder nur den Überstand geladen werden kann in das Gel Tasche). Wir fanden, dass die Perlen langsam loslassen kleine Mengen an Polymer in der wässrigen tryptischen Verdaus Lösung während on-bead tryptischen Verdaus auch nach mehreren wässrigen Waschschritte. Das Polymer Verschmutzung stört MS Peptid Identifikation und lässt sich die Perlen mit 80% ACN (mindestens dreimal) gewaschen werden. Nach dem 80% ACN Waschschritte, sollten die Perlen einmal mit Wasser gewaschen werden, bevor sie on-bead tryptischen Verdaus. b) Western Blots mit Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase und ECL Substrat kann auch verwendet werden, um erfolgreiche Vernetzung der Biotin enthält, CC, um die Proteine ​​sichtbar zu machen. Also entweder das Gel nach Schritt 3.2 erhalten werden können abgetupft oder, weil die Empfindlichkeit ist etwa 10-fach höher als Silberfärbung von Gelen, 10. Mai ul-Proben nach Schritt 2.7 auch mittels Western Blot analysiert werden. Daran, dass im letzteren Fall endogen biotinylierte Proteine ​​werden auch neben der Proteine ​​künstlich durch die SAH-CC biotinylierten erkannt werden. c) Wir fanden, dass es auf dem speziellen System (Lysat, adressiert Zielproteine, Selektivität und Reaktivität Funktion er CC) abhängt, ob die &quot;off-Bead&quot;-Konfiguration, wo die Vernetzungsreaktion findet zwischen freien CC-und Protein in Lösung 4 oder die hier beschriebenen &quot;on-bead&quot;-Konfiguration (Abbildung 1B) zu besseren Ergebnissen führt. Im Allgemeinen sollte die Methode auch kompatibel mit allen state-of-the art stabile Isotop Protein oder Peptid Etikettiertechnik oder Beurteilung der Capture Probe durch 2D-Gelelektrophorese. In der &quot;off-Bead&quot;-Konfiguration ist es auch möglich, Proteine ​​innerhalb ganzer Zellen (unveröffentlichte Ergebnisse) zu erfassen. Darüber hinaus kann das Medikament oder Cofaktor-Bindungsstelle eines Proteins durch die Bestimmung der nahe Vernetzung Position des CC in der Proteinsequenz von MS Peptidsequenzierung skizziert werden. Die Art der Bindung eines kleinen Moleküls an ein Protein kann durch die Verwendung unterschiedlicher c erkundet werdenhemische Befestigung Positionen bei der Selektivität Funktion und verschiedene Linker Längen. Wie in der vorliegenden Studie gezeigt, adressiert auch Protein Bindungspartner der Proteine ​​durch die Selektivität Funktion (RplK als Substrat PRMA) oder unbekannte kleines Molekül Protein-Interaktionen (SAH zu glnA) identifiziert werden können. Zusammengefasst, die zusätzliche Funktion des CCs, Foto-Vernetzungsreaktivität, ermöglicht die Isolierung und Identifizierung von niedrigen reichlich Proteine ​​oder funktionelle Protein-Familien aus komplexen Protein-Gemischen mit hoher Empfindlichkeit und liefert den Wissenschaftlern ein zusätzliches Werkzeug für die Untersuchung kleiner Moleküle - Protein-Interaktionen .

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

Es gibt eine Vielzahl von Ansätzen, um die Komplexität des Proteoms auf der Basis von funktionalen kleines Molekül-Protein-Interaktionen, wie Affinitätschromatographie 1 oder Activity Based Protein Profiling 2 zu reduzieren. Trifunktionale Capture Compounds (CCs, Abbildung 1A) 3 sind die Basis für einen generischen Ansatz, in der die ursprüngliche Gleichgewicht-driven Interaktion zwischen einem kleinen Molekül-Sonde (die Selektivität Funktion, hier S-Adenosyl-L-Homocystein, SAH, Abbildung 1A) und Target-Proteine ​​irreversibel auf Foto-Vernetzung zwischen einer unabhängigen Foto-aktivierbare Reaktivität Funktion (hier ein Phenylazid) der CC und die Oberfläche der Zielproteine ​​fixiert. Die Sortierfunktion (hier Biotin) dient dazu, den CC zu isolieren - Protein-Konjugate aus komplexen biologischen Mischungen mit Hilfe einer festen Phase (hier Streptavidin Magnetpartikel). Zwei Konfigurationen der Experimente sind möglich: &quot;off-Perle&quot; 4 oder der hier beschriebenen &quot;on-bead&quot;-Konfiguration (Abbildung 1B). Die Selektivität Funktion kann praktisch jedes kleines Molekül von Interesse (Substrate, Inhibitoren, Wirkstoffmoleküle) werden. S-Adenosyl-L-Methionin (SAM, Abbildung 1A) ist wahrscheinlich, Sekunde, um ATP, die am häufigsten verwendete Cofaktor in der Natur 5, 6. Es ist, als die großen Methylgruppendonator in allen lebenden Organismen mit der chemischen Reaktion durch SAM-abhängigen Methyltransferasen (MTasen), die DNA 7, RNA 8, Proteine ​​9 oder kleine Moleküle 10 Methylat katalysiert werden. Angesichts der entscheidenden Rolle der Methylierung in verschiedenen physiologischen Szenarien (Genregulation, Epigenetik, Stoffwechsel), kann die Profilierung der MTasen erwartet, dass eine ähnliche Bedeutung in der funktionellen Proteomik, wie die Profilierung der Kinasen zu werden. Analytische Werkzeuge für ihre Profilierung, aber bisher nicht zur Verfügung. Haben wir kürzlich eine CC mit SAH als Selektivität Gruppe auf diese technologische Lücke (Abbildung 1A) zu füllen. SAH, das Produkt von SAM nach Methyl-Transfer, ist eine bekannte allgemeine MTase Produkt-Inhibitor 11. Aus diesem Grund und weil die natürliche Kofaktor SAM wird durch weitere Enzyme der Übertragung in anderen Teilen der Cofaktor oder den Beginn der Radikalreaktionen sowie gebrauchte aufgrund seiner chemischen Instabilität 12, SAH eine ideale Selektivität Funktion für eine CC zu MTasen Ziel ist. Hier berichten wir über die Nützlichkeit der SAH-CC und CCMS durch Profilierung MTasen und andere SAH-bindende Proteine ​​aus dem Stamm DH5 von Escherichia coli (E. coli), einer der am besten charakterisierten Prokaryoten, die als das bevorzugte Modell gedient hat Organismus in zahllosen biochemischen, biologischen und biotechnologischen Studien. Photo-aktivierten Vernetzung erhöht die Ausbeute und die Empfindlichkeit des Experiments und die Spezifität kann leicht in Konkurrenz Experimente mit einem Überschuss an freien SAH getestet werden.

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Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds sind trifunktionelle kleinen Molekülen, um die Komplexität des Proteoms durch funktionelle reversible kleines Molekül-Protein-Wechselwirkung durch Photo-Vernetzung und Reinigung gefolgt reduzieren. Hier verwenden wir ein Capture Compound mit<em&gt; S</em&gt;-Adenosyl-<sub&gt; L</sub&gt;-Homocystein-Bindung, wie Selektivität Funktion Methyltransferasen aus einem isolieren<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ganzzelllysat und weisen sie von MS.

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

profiling-methyltransferases-other-s-adenosyl-l-homocysteine-binding

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

15.5K Aufrufe.  caprotec bioanalytics GmbH. Capture Compounds sind trifunktionelle kleinen Molekülen, um die Komplexität des Proteoms durch funktionelle reversible kleines Molekül-Protein-Wechselwirkung durch Photo-Vernetzung und Reinigung gefolgt reduzieren. Hier verwenden wir ein Capture Compound mit S-Adenosyl- L-Homocystein-Bindung, wie Selektivität Funktion Methyltransferasen aus einem isolieren Escherichia coli Ganzzelllysat und weisen sie von MS.

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl-_L-Homocystein-bindende Proteine von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)