Diese Arbeit wurde von der Wellcome Trust durch Zuschüsse finanziert APM [076566/Z/05/Z], JCK [074318] und einem Kern Zuschlag auf das Wellcome Trust Centre for Human Genetics [075491/Z/04].

1) Cell Culture <ol><li> Wählen Zelltypen Expression des Gens von Interesse. </li><li> Wählen Zelllinien heterozygot sowohl für die DNA-Risiko-Varianten und transkribiert Codierung Polymorphismus im Gen von Interesse (Abbildung 1). </li><li> Kultur der ausgewählten Zelllinien nach den Spezifikationen des Lieferanten und für das 2 x 10 cm Petrischalen für die DNA-und RNA-Extraktion bzw.. </li><li> Wenn die Zellen bis zu 80% Konfluenz starten Sie die Prozedur, um die Ernten Zellen und Isolierung von DNA und RNA entweder nach dem unten beschriebenen Verfahren oder unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits. </li></ol> 2) DNA-Extraktion <ol><li> Entfernen Sie das Medium aus der Schale, mit PBS waschen und hinzufügen, um die Schale 500 ul einer Lyse-Lösung (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA und 50 pg / mL RNase A). </li><li> Rock the Platte sanft 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Kratzen Sie die Zelllysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen und bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Add Proteinase K in einer Endkonzentration von 100 ug / ml und bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Extrahieren Sie die DNA mit dem gleichen Volumen Phenol-Chloroform-pH 8, wiederholen, dann mit dem gleichen Volumen Chloroform / Isoamylalkohol extrahiert. </li><li> Fällung der DNA mit 1 / 10 th Volumen 3 M NaCl und 2,5 Volumen 100% Ethanol. </li><li> Lassen Sie auf Eis für 5 min und dann Spin bei 13.000 rpm für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die DNA mit 70% Ethanol, an der Luft trocknen und resuspendieren in 200 ul TE zu ermöglichen. </li><li> Inkubation bei 65 ° C für 10 min und verlassen dann für 2 Tage bei Raumtemperatur. </li><li> Lagerung bei 4 ° C oder langfristig bei -20 ° C. </li></ol> 3) RNA-Extraktion <ol><li> Entfernen Sie das Medium aus der Schale, mit PBS waschen, 1 mL TRIzol und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Scrape Zellen, Pipette einige Male, Transfer in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubation für 5 min. </li><li> Spin für 10 min bei 10.000 rpm bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und mit 200 ul Chloroform. </li><li> Shake und Spin für 10 min bei 10.000 rpm bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen und ein gleiches Volumen 70% Ethanol. </li><li> Laden Sie die Lösung auf 1 oder 2 (je nach Volumen) RNeasy Säule und Spin für 30 sec bei maximaler Geschwindigkeit. </li><li> Von hier folgen Sie den Anweisungen des RNeasy-Kit (Qiagen). </li></ol> 4) von Nukleinsäuren <ol><li> Quantifizierung der DNA-und RNA-Konzentration mit einem NanoDrop Spektralphotometer (Thermo Scientific). </li><li> Bereiten from 500-1000 ng der RNA mit zufälligen Dekameren und SuperScript III Reverse Transkriptase (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers cDNA. </li></ol> 5) PCR und Primer Extension Assay <ol><li> Design zwei Paare von PCR-Primer für jeden DNA-Marker, ein Paar für die genomische DNA-Amplifikation und das andere Paar für cDNA-Amplifikation (Abb. 2). Legen Sie vor-und rückwärts-Primer für cDNA-Amplifikation in verschiedenen Exons, um genomische Kontamination zu vermeiden. Design-Primer ein PCR-Produkt im Bereich von 100-500 bp Länge zu erhalten. </li><li> Bereiten Sie eine 10 l PCR-Reaktion mit 0,5 U Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M jedes Primers und 20 ng entweder cDNA oder DNA. Amplify jede Probe in vier unabhängigen Reaktionen. </li><li> Führen Sie die PCR-Reaktion unter den Bedingungen für jedes Primerpaar halten Taktzahl in der linearen Phase der Amplifikation optimiert. </li><li> Nehmen Sie PCR-Primer und dNTPs überschüssige durch Inkubation des PCR-Produkts mit Exonuklease I und Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) bei 37 ° C für 20 Minuten. </li><li> Spot jedes PCR-Produkt zweimal auf einer 384-Well-Platte, so dass 8 Messungen verfügbar sein wird für jede Probe. </li><li> Entwerfen Sie die Erweiterung Primer mit dem Assay-Design (Sequenom) Software, so dass die gleichen Primer für beide genomischen und cDNA PCR-Produkte verwendet werden kann. Geben Primer Länge im Bereich von 14-18 bp und Erweiterung Mix einschließlich Kombinationen von 3ddNTPs (Abb. 2). </li><li> Führen Sie die Primerverlängerungsreaktion und MALDI-TOF/MS Analyse mit dem MassARRAY-System (Sequenom) nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Ein typisches Primerverlängerungsreaktion gehören ein Start bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 40 Zyklen von 94 ° C für 5 s, 52 ° C für 5 s und 72 ° C folgte für 5 s. </li><li> Die Primer-Extension-Produkte sind mit SpectroCLEAN Harz gereinigt und übertragen auf Microarray-(Chip) von SpectroPOINT Nanoliter Dispenser. </li><li> Die erweiterte Oligonukleotide werden durch MALDI-TOF mit einem SpectroREADER Massenspektrometer quantifiziert. </li></ol> 6) Statistische Analyse <ol><li> Überprüfen Sie MALDI-TOF/MS Ergebnisse mit dem MassARRAY Typer Software für allgemeine Qualität des Experiments. </li><li> Entpacken Sie die Allelotyping Bericht, der die Peakfläche Daten enthält. </li><li> Für jedes einzelne Spektrum berechnenVerhältnis zwischen der Peakfläche von Allel 1 und Allel 2 (Peakflächenverhältnis). </li><li> Für jede cDNA-Probe abzuleiten Peakflächenverhältnis Mittelwert und Standardabweichung, über die entsprechende Funktion in Excel, über die 8 Messungen. </li><li> Leiten Sie das gleiche bedeuten Peakflächenverhältnis über den 8 Messungen für genomische DNA. </li><li> Teilen Sie die cDNA mittlere Verhältnis von der genomischen mittlere Verhältnis der Abweichung der erwarteten 1:1-Verhältnis zu bewerten. </li></ol> 7) Experimentelle Kontrollen <ol><li> Um auszuschließen, experimentelle Artefakte, wiederholen Sie das Experiment mindestens dreimal. </li><li> Wann immer möglich, Design-Assays für weitere DNA-Marker. </li><li> Entwerfen Sie mehrere PCR-Primerpaare und Erweiterung Primer Annealing sowohl vorwärts als auch rückwärts Stränge. </li><li> Wann immer möglich Test als Negativ-Kontrollen Zelllinien, die heterozygot für DNA-Marker sind jedoch nicht mit der DNA Risiko-Varianten mit dem Phänotyp assoziiert (Abb. 1 und Abb.. 3) </li></ol> 8) repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für eine Allel-spezifische Expressions-Analyse ist in Abbildung 3 mit Beispielen der Massenspektrometrie Spuren gezeigt. Die Abbildung zeigt die Ergebnisse aus der Analyse von 4-Allel-spezifischen Primer Extension-Produkte auf 4 verschiedene Vorlagen durchgeführt. Die Top-Grafiken stellen die Ergebnisse aus der Analyse der genomischen DNA von zwei verschiedenen Zelllinien, die sowohl heterozygot für eine transkribiert Codierung Polymorphismus erhalten. Allerdings nur Zelllinie A ist heterozygot für das Risiko DNA-Variante (Abbildung 1). Die unteren Diagramme stellen die Ergebnisse aus der Analyse der cDNA aus dem gleichen Zelllinien erzeugt wird. Als Ergebnis der experimentellen Artefakt der erste Gipfel ist immer höher als die zweite Spitze auch in der Genomanalyse. Daher sind die Ergebnisse aus der genomischen Analyse verwendet, um die cDNA Daten zu normalisieren. Nach der Normalisierung ist das Allel-Verhältnis signifikant von 1 in Zell-Linie A (wobei der zweite Peak erscheint niedriger im Vergleich zu den anderen Spektren), während es ist sehr nahe an 1 liegt in Zell-Linie B. Die Daten, die Zell-Linie deuten auf eine trägt eine DNA-Variante, in Phase mit dem Allel durch die zweite Spitze, die die Expression des Gens in der Analyse reduziert gemessen. Zelllinie B bietet eine sehr komfortable negative Kontrolle. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Zelllinie Auswahl Strategie. Zelllinien A und B sind heterozygot für eine transkribiert Codierung Markierung (Dreieck), sondern nur Zelllinie A ist heterozygot für das Risikomanagement DNA-Variante (Kreis). Die blaue Allel das Risiko-Variante assoziiert ist (entweder mit einem direkten Effekt, oder weil in enger Korrelation mit dem tatsächlichen funktionelle Variante) mit einer niedrigeren Ebene der Transkription. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Allel-spezifische Primer-Extension-Assay. Diese Zahl zeigt die Work-Flow des experimentellen Verfahrens für beide cDNA (links) und genomischer DNA (rechts) Vorlagen durchgeführt. PCR-Primer (graue Rechtecke) sind entworfen, um eine heterozygote Kodierung Polymorphismus (Dreieck) zu verstärken. Zur Vermeidung von Kontaminationen genomischer PCR-Primer anlagern Sequenzen in verschiedenen Exons (hellblaue Linien), wenn Amplifikation auf cDNA-Template durchgeführt platziert. Das PCR-Produkt wird dann als Vorlage für eine Primer-Extension-Reaktion mit einer Verlängerung Primer durchgeführt verwendet, Glühen eine Basis neben dem Polymorphismus und die geeignete Dosierung von drei Didesoxynukleotid (ddNTPs) Terminatoren (Quadrate) und eine Desoxynukleotid (Kreis) zu verlängern die Grundierung von einem oder zwei Basis bzw.. Die daraus resultierende Primerverlängerungsprodukte haben unterschiedliche Massen, die Trennung und Quantifizierung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie ermöglicht. Die Menge des Produkts entsprechend der blauen Allel des DNA-Marker ist relativ niedriger die rote Allel. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Ergebnisse einer Allel-spezifische Expression Assays. Die Abbildung zeigt die Massenspektrometrie ergibt sich aus der durchgeführten Analyse der genomischen DNA und der cDNA der Zelllinie A-und B-Zelllinie (Abbildung 1).

<ol>
	<li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li><li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide.">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li><li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+human+gene+expression.">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li><li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS.">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li><li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform.">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li><li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome.">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation.">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li><li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading.">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li><li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression.">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li><li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States.">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li><li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319,+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration.">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li></ol>

Diese Methode ermöglicht die Evaluierung der Wirkung von krankheits-assoziierte DNA-Varianten auf die Genexpression durch die Beurteilung in vivo Allel-spezifischen Unterschied in der Niederschrift Ebene. In diesem Protokoll relativen Transkript Fülle von MALDI-TOF, sondern auch andere Technologien, die Allel-spezifische Quantifizierung, wie TaqMan 6,7 gemessen wird, verwendet werden können. Die wesentliche Einschränkung dieses Ansatzes ist die Verfügbarkeit von transkribiert Codierung Marker. Methoden, die auf dem Prinzip, hier beschriebenen, aber unter Ausnutzung der verschiedenen Klassen von Polymorphismen beschrieben worden. Die haploChip Assay misst Allel-spezifische Expression mittels Markern innerhalb von 1 kb der transkriptionellen Anfang oder Ende Gelände eines Gens, das vorhanden sein würde in Chromatin Immunopräzipitation Material mit spezifischen Antikörpern gegen RNA-Polymerase II 8 isoliert gelegen. Alternativ können intronischen SNPs verwendet werden, wenn die Vorlage heteronukleare RNA 9 sein. Die spezifischen hier beschriebene Protokoll, in Kombination mit dem haploChip Assay wurde erfolgreich zu einem Kandidatengen für Legasthenie (oder Leseschwäche) zu identifizieren. Zunächst wird eine genetische Assoziation Studie identifizierte eine DNA-Sequenz mit Legasthenie und die war über drei Gene 10 zugeordnet. Die Allel-spezifische Gen-Expression Assays zeigten, dass in Anwesenheit der Legasthenie-assoziierten DNA-Varianten Ausdruck Variation wurde für nur einen der drei Genen beobachtet, nicht aber die anderen beiden 11.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4417-100TAB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27788.366</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-500MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77617</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100777C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immolase Taq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DNTP100A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease 1</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>E70092Z</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCLEAN resin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10053</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND ddNTP/dNTP mix </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Varies according to assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND thermosequenase </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled microcentrifuge</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroPOINT nanolitre dispenser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroREADER mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an allele-specific gene expression assay to test the functional basis of genetic associations

Die Anzahl der signifikanten genetischen Zusammenhänge mit häufigen komplexe Merkmale nimmt ständig zu. Allerdings haben die meisten dieser Verbände nicht auf molekularer Ebene verstanden worden. Einer der Mechanismen der Vermittlung der Wirkung von DNA-Varianten auf Phänotypen wird die Genexpression, die gezeigt hat, als besonders relevant für komplexe Merkmale 1. Diese Methode testet im zellulären Kontext die Wirkung spezifischer DNA-Sequenzen auf die Genexpression. Das Prinzip ist die relative Häufigkeit der Transkripte aus den beiden Allele eines Gens, Analyse-Zellen, die eine Kopie der DNA-Sequenzen mit der Krankheit (das Risiko Varianten) 2,3 assoziiert tragen zu messen. Daher sollten die Zellen für diese Methode verwendet erfüllen zwei grundlegende genotypische Anforderungen: Sie müssen sowohl für die DNA-Risiko-Varianten und für die DNA-Marker, die typischerweise Codierung Polymorphismen, die Transkripte auf ihre chromosomale Herkunft (Abbildung 1) unterscheiden kann heterozygot. DNA Risiko Varianten und DNA-Marker müssen nicht das gleiche Allel-Frequenz haben, aber die Phase (haplotypic) Beziehung der genetischen Marker verstanden werden muß. Es ist auch wichtig, um Zelltypen, die das Gen von Interesse exprimieren wählen. Dieses Protokoll bezieht sich speziell auf das Verfahren angenommen, um Nukleinsäuren aus Fibroblasten-Extrakt aber die Methode ist gleichermaßen anwendbar auf andere Zelltypen einschließlich Primärzellen. DNA und RNA aus dem ausgewählten Zelllinien extrahiert und cDNA generiert. DNA und cDNA sind mit einem Primer-Extension-Assay entwickelt, um die kodierenden DNA-Marker 4 Ziel analysiert. Die Primer-Extension-Assay wird mit dem MassARRAY (Sequenom) 5-Plattform nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Primer Extension-Produkte werden dann durch Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Zeit-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF/MS) analysiert. Da der ausgewählte Marker heterozygot sind, werden sie generieren zwei Spitzen auf der MS-Profile. Die Fläche der einzelnen Peaks ist proportional zur Niederschrift Fülle und kann mit einer Funktion des MassARRAY Typer Software eine allelische Verhältnis (Allel 1: Allel 2) erzeugen gemessen werden Berechnung. Die Allel-Verhältnis für cDNA gewonnen wird normiert, wobei die aus genomischer DNA, wo die allelische Verhältnis voraussichtlich 1:1 bis zur technischen Artefakten richtig gemessen. Markers mit einem normierten allelische Verhältnis signifikant zu 1 darauf hin, dass die Menge des Transkripts aus den beiden Chromosomen in der gleichen Zelle generiert anders ist, was darauf hindeutet, dass die DNA-Varianten mit dem Phänotyp assoziiert einen Effekt auf die Genexpression haben. Experimentelle Kontrollen sollten verwendet werden, um die Ergebnisse zu bestätigen.

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An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Genetische Assoziationen oft im Dunkeln bleiben auf funktionaler Ebene. Diese Methode zielt darauf ab, die Wirkung der Phänotyp-assoziierten genetischen Marker auf die Genexpression zu beurteilen durch die Analyse von Zellen heterozygot für transkribiert SNPs. Die Technologie ermöglicht eine präzise Messung durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Allel-spezifischen Primer Extension-Produkte zu quantifizieren.

Ein Allel-spezifische Gene Expression Assay zur Funktionsanalyse Grundlage genetischer Verbände testen

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Aufrufe.  University of Oxford. Genetische Assoziationen oft im Dunkeln bleiben auf funktionaler Ebene. Diese Methode zielt darauf ab, die Wirkung der Phänotyp-assoziierten genetischen Marker auf die Genexpression zu beurteilen durch die Analyse von Zellen heterozygot für transkribiert SNPs. Die Technologie ermöglicht eine präzise Messung durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Allel-spezifischen Primer Extension-Produkte zu quantifizieren.

Serie: An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Hell / Dunkel Transition Test für Mäuse

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elektrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...