Die Untersuchung größerer Populationen kommt mit einer maschinengesteuerten Variation, die dadurch die tatsächliche Variation aus der natürlichen Vielfalt stammt. Hier demonstrieren wir eine Methode, um die technischen Variationen für die nachgelagerte Integrationsanalyse zu reduzieren. Zu den Vorteilen dieser Technik gehört eine auf Gesichtstrennung basierende Extraktion, die die Analyse verschiedener Metaboliten auf der jeweiligen analytischen Plattform ermöglicht, während der systemische Fehler beseitigt und die biologische Varianz erhalten bleibt.
Sobald die genotypischen und phänotypischen Informationen erhalten sind, kann diese Methode auf jede vielfältige natürliche Bevölkerung in jedem Reich des Lebens angewendet werden. Um mit der Entnahme von 20-Milliliter-Ernterohren zu beginnen, fügen Sie zwei Metallperlen mit einem Durchmesser von acht Millimetern zum Homogenisieren hinzu und beschriften Sie die Rohre. Füllen Sie dann einen Dewar mit flüssigem Stickstoff auf, unmittelbar nach dem Schneiden von frischen Blatt- und Wurzelgewebeproben in flüssigem Stickstoff durch Einfrieren von Flammen.
Lagern Sie die entnommenen biologischen Proben bei 80 Grad Celsius zur Weiterverarbeitung. Die Röhrchenhalter mit flüssigem Stickstoff vorkühlen. Als nächstes mahlen Sie das Gewebe bei 25 Hertz für eine Minute, um ein homogenes Pulver zu erhalten.
Wiederholen Sie das Einfrieren und Mahlen, wenn das Gewebe nicht homogen gemahlen ist. Wiegen Sie 50 Milligramm frisches Pflanzenmaterial in einem vorgekühlten, etikettierten, zwei Millimeter sicheren Mikrozentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, dass das Pflanzenmaterial während des Wiegevorgangs gefroren bleibt. Fügen Sie einen Milliliter vorgekühlte Extraktionsmischung 1 bis 50 Milligramm Aliquot der Probe hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen kurz auf, bevor Sie es auf Eis halten.
Inkubieren Sie die Proben auf einem Orbitalschüttler bei 800 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, gefolgt von einer Beschallung in einem eisgekühlten Beschallungsbad für 10 Minuten. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um den Proben auch 500 Mikroliter Extraktionsmischung hinzuzufügen und mischen Sie die Extrakte durch kurzes Vortexen, dann zentrifugieren Sie die Mischung bei 11.200 mal G für 5 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation werden 500 Mikroliter der abgetrennten oberen lipidhaltigen Phase in ein vormarkiertes 1,5-Milliliter-Safe-Lock-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, wobei der Rest der oberen Phase entfernt wird.
In separaten, 1,5-Milliliter-Safe-Lock-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen 150 Mikroliter der unteren semipolaren Phase vier GCMS und 300 Mikroliter der semipolaren Phase vier U-H-P-L-C MS-Analyse. Verwenden Sie einen Vakuumkonzentrator für die Lösungsmittelverdampfung, um alle extrahierten Fraktionen ohne Erwärmung zu konzentrieren und die getrockneten Fraktionen bei 20 Grad Celsius zu lagern. Um die Probe für die ultrahohe Leistung vorzubereiten, suspendieren Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie oder H-P-L-C MS die getrockneten semipolaren Fraktionen in 180 Mikrolitern einer Mischung aus Methanol und Wasser erneut.
Dann beschallen Sie die semipolare Phase für 2 Minuten, gefolgt von einer Zentrifugation bei 11.200 mal G für eine Minute. Nach der Zentrifugation 90 Mikroliter des Überstands in eine Glasdurchstechflasche geben und zwei Mikroliter der Extrakte in die gegossene LCMS-Probe injizieren. Führen Sie die Metabolitfraktionierung an einer umgekehrten Phase-C18-Säule durch, die bei 40 Grad Celsius gehalten wird, und einem Durchfluss von 400 Mikrolitern pro Minute mit allmählichen Änderungen der Abwässer A und B, erfassen Sie die Massenspektren der Testblind- und Qualitätskontrollproben im negativen Ionisationsmodus mit einem Massenbereich von 102 1500 Massen-zu-Ladungs-Verhältnis.
Führen Sie für die Proben der semipolaren Metaboliten eine gepoolte QC-Probe in der datenabhängigen Tandemmassenspektrometrie im negativen und positiven Ionisationsmodus durch. Verwenden Sie die erhaltenen Massenspektren für die Annotation. Führen Sie die Normalisierung des Datensatzes durch, indem Sie die Verteilung des internen Standards überprüfen.
Normalisieren Sie die Daten, indem Sie das Signal einzelner oder mehrerer interner Standards korrigieren. Als nächstes korrigieren Sie die aus dem Chromatogramm erhaltenen Spitzenintensitäten über das genaue Probengewicht. Um die Intensitätsdrift über Multi-Batch-Serien zu korrigieren, führen Sie QC-basierte Korrekturmethoden wie lokal geschätzte Streudiagrammglättung mit R durch.Bevor Sie genomweite Assoziationsstudien oder GWAS durchführen, filtern Sie die genotypischen Daten auf kleinere Allelfrequenzen von weniger als 5% und eine fehlende Rate von mehr als 10% mit einer Quaste.
Dadurch werden niederfrequente Verzerrungen vermieden. Um die Verzerrung zu eliminieren, die sich aus den Umweltfaktoren ergibt, verwenden Sie das R-Paket LME vier und berechnen Sie die besten linearen, unverzerrten Vorhersagen oder Blopps für jedes normalisierte Merkmal über die experimentellen Wiederholungen. Verwenden Sie Blips jedes Features einzeln, um GWAS mit dem rMVP-Paket in R durchzuführen.Die lipidomischen Daten über mehrere häufige Bohnenarten hinweg werden basierend auf den rohen Basis-Peak-Chromatogrammen von zwei QC-Proben aus verschiedenen Chargen gezeigt.
Für bestimmte Lipidklassen wurde eine Variation der Signalintensitäten beobachtet. Der systemische Fehler wurde deutlicher, als die Hauptkomponentenanalyse an den Rohdaten durchgeführt wurde. Das Normalisierungsverfahren, einschließlich der lokal geschätzten Streudiagrammglättung, führte zum Clustering der QC-Stichproben.
Beim Sezieren in die einzelnen Cluster wurden maschinengesteuerte Fehler in Batch sieben und acht vor der Normalisierung deutlich, die korrigiert wurde. Die postnormalisierten und transformierten individuellen metabolomischen Cluster wurden für GWAS verwendet, was zu mehreren Merkmalsmarkerassoziationen führte. In der repräsentativen Analyse werden verschiedene Verbindungsklassen in verschiedenen Farben hervorgehoben, während die Marker, die mehreren Verbindungsklassen zugeordnet sind, mit ihrem nächsten Gen angezeigt werden.
Datennormalisierung und -transformation sind einer der wichtigsten Schritte. Stellen Sie sicher, dass eine ordnungsgemäße Korrektur durchgeführt wurde, um systemische Fehler zu korrigieren, und stellen Sie die Normalität der Verteilung sicher. Durch die Korrektur der analytischen Variation können mehrere Integrationsansätze durchgeführt werden, wie z.B. die metabolische Korrelationsanalyse und die Integration in phänomische Daten, um komplexe Merkmale zu beleuchten.
