Wir möchten die Mitglieder des Vancouver Institute of Visual Analytics (VIVA) für das Anbieten Kommentare und Ratschläge für das Projekt danken. Insbesondere möchten wir John Dill, Brian Fisher, und David Darvill danken. Wir möchten auch die Mitglieder des Kollmann Labor für ihre Unterstützung und hilfreiche Diskussionen danken. Diese Arbeit wurde teilweise durch National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institute of Health Grants N01 AI50023 unterstützt; Allergen NCE Grants 07-A1A und 07-B2B, und die Michael Smith Foundation for Health Research. TRK ist zum Teil durch ein Career Award in der Biomedical Science an der Burroughs Wellcome Fund einer Anzeige von einer kanadischen Institute for Health Research Training Grant in kanadischen Child Health Clinician Scientist Program, in Zusammenarbeit mit Sick-Kids-Stiftung, Kinder-und Family Research Institute unterstützt ( British Columbia), Frauen und Kinder Health Research Institute (Alberta) und Manitoba Institute of Child Health.

1. Exploration-based Analysis auf Tableau <ol><li> Sie haben einen Datensatz, und Sie möchten die verschiedenen Beziehungen zwischen den Spalten in den Daten zu entdecken. <ol><li> (Abbildung 1) Import des Datensatzes durch einen Klick auf &quot;Daten Connect &#39;. Wählen Sie den Typ der Datenquelle und folgen Sie den Anweisungen auf Ihrem Datensatz zu importieren. </li><li> (Abbildung 1) Stellen Sie sicher, dass die Abmessungen Regal kategorische Spalten enthält, während die Maßnahmen Regal enthält numerische Spalten aus Ihrem Datenbestand. Manchmal ist eine Dimension Spalte, z. B. Thema Kennung kann als Maßnahme aufgeführt werden, wenn sie nummeriert. Ändern Sie die Abmessungen mit der rechten Maustaste darauf und wählen &quot;Convert to Dimension&quot;. In Abbildung 1 sind kategorische Spalten aus dem Datensatz wie etwa Stimulus Konzentration und unterliegen Identifikatoren korrekt in Dimensionen Regal gestellt, und die beobachtete Konzentration der Zytokine sind korrekt in Maßnahmen Regal gestellt. </li><li> (Abbildung 2) Wenn bei der Analyse-Prozess, ein berechnetes Feld benötigt wird, einfach mit der rechten in beiden Dimensionen oder Maßnahmen Regal klicken, und wählen Sie &quot;Create Berechnetes Feld&quot;. Geben Sie die Berechnung in der Formel-Box mit Feldern mit Funktionen oder mathematische Operationen kombiniert. Abbildung 2 zeigt, wie man ein neues Feld namens PFD&gt; 2 durch Aggregation PFD2, PFD3 und PFD4 Werte zu schaffen. </li><li> (Abbildung 3) Erzeugen Sie eine 2-D Plot in Tableau, in der Regel mit einer Dimension und ein gewisses Maß an Interesse. Da die Schnittstelle bietet eine einfache Drag-and-Drop-Interaktion, kann die Wahl der Dimension und messen leicht geändert werden. Die Abmessungen sind in der Regel in Spalten Regal, und Maßnahmen in den Reihen Regal gestellt. In Abbildung 3 enthält die Abmessungen Regal Stimulus Konzentration, und die Maßnahmen Regal enthält beobachtet Konzentration von Zytokinen. </li><li> (Abbildung 3) Um die Visualisierung durch eine spezifische Dimension, statt zu differenzieren, dass Bemassungstext in Text, Farbe oder Größe Regal, je nach Art der Dimension. Text Regal versucht, Daten in die Visualisierung durch Etikettierung sie mit Textinformationen durch die Dimension ausgewählt vorgesehen unterscheiden. Farbe und Größe Regal wird automatisch unterschieden Daten nach Farbe und Größe, die mit dem Scroll-Leiste am unteren Rand jeder Regal befindet eingestellt werden kann. In Abbildung 3, indem Genotyp in Farbe Regal führt zur Trennung der drei Genotypen durch verschiedene Farben. </li><li> (Abbildung 3) Filter die Visualisierung durch die spezifische Spalte Variablen in anderen Dimensionen. Dies kann durch Ziehen der Dimension Label in den Filter Regal durchgeführt werden. Es wird ein Fenster mit der Liste der Werte zur Auswahl angezeigt. Der gewählte Wert wird nur blieben die Werte in der Visualisierung. </li><li> (Abbildung 4) können Sie die Visualisierung mit anderen Dimension zu kombinieren oder zu messen, um eine Matrix der Visualisierung zu erzeugen. Dies kann durch Fallenlassen mehreren Dimensionen in den Spalten Regal, und mehrere Maßnahmen in Reihen Regal durchgeführt werden. Abbildung 4 enthält ein Beispiel für Zwei-Säulen-Visualisierung Matrix, indem Sie zwei unterschiedliche Dimensionen in den Spalten Regal. </li><li> Um eine vergleichbare Darstellung, direkt an der aktuellen Tabelle auf der linken unteren Ecke klicken, und ausgewählte &quot;Duplikat Blatt&quot;. </li><li> Iterate den Analyseprozess zu interessanten Trends und Ausreißer, die Ihnen helfen zu generieren neue Hypothese über die Daten zu identifizieren. </li></ol></li><li> Sie haben mehrere Datensatz aus der gleichen Quelle erzeugt wird, und wollen die möglichen Verbindungen zwischen diesen Datensätzen zu entdecken. <ol><li> Legen Sie mehrere Datensätze in einer gleichen Quelle, dh Platz zwei Tabellen in derselben Arbeitsmappe, damit Tableau, auf diese Datenmenge durch die gleiche Verbindung zu verbinden. </li><li> (Abbildung 5) Schließen Sie die Datensätze durch logische Verknüpfung der zentralen Werte, um sicherzustellen, dass die Dimensionen, die das gleiche für mehrere Datensätze ausgewählt werden. In Abbildung 5 gibt es fünf zentrale Werte für den Beitritt: Zelltyp, Stimulus Konzentration, Bühne oder Gruppe, Reiz und vorbehaltlich Kennung. </li><li> Durchführen von Analysen ähnlich Abschnitt 1.1. </li></ol></li></ol> 2. Presentation-based Needs <ol><li> Sie kennen die Beziehungen zwischen Daten, aber Sie wollen in der Lage sein, schnell eine Liste von Visualisierungen für den Einsatz in der Präsentation. <ol><li> Follow-Protokoll in Abschnitt 1.1 beschrieben, und kommentieren Sie die Visualisierungen entsprechend. </li><li> Verwenden Sie die Export-Funktion in Tableau von Bildern von Visualisierungen zu produzieren. </li></ol></li><li> Sie haben einen mächtigen Satz von Visualisierungen in Tableau Arbeitsmappe erstellt und möchte, dass Arbeitsmappe freigeben. <ol><li> Speichern Sie die Arbeitsmappe als Tableau verpackt Arbeitsmappe und teilen Sie diese Datei. </li><li> Kollegen ohne Tableau Desktop kann download Tableau Reader, um die verpackten Arbeitsmappe öffnen. Tableau Reader ermöglicht Ihren Mitarbeitern, mit den Visualisierungen, die Sie erstellt haben, zu interagieren. </li></ol></li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Ein Screenshotvon Tableau nach dem Import der Tabellenkalkulation namens NFKBIA aus der Excel-Datei demo.xls. Die Dimensionen und Kennzahlen Regale waren richtig mit dem kategorischen und numerischen Daten gefüllt, bzw.. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Berechneten Feld Fenster wird aufgerufen, um ein spezielles berechnetes Feld erstellen, um in Tableau verwenden. Die Liste auf der linken unteren Feld hilft bei der Identifizierung möglichen Bereichen, und die Liste auf der rechten Seite enthält Abkürzung von Funktionen, die in der Formel verwendet werden können. In diesem Beispiel wollten wir die Werte für PFD4, PFD3 und PFD2 hinzufügen, um den endgültigen Wert, dass wir als PFD&gt; 2 erhalten <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Visualisierung von Stimulus Konzentration vs beobachtet Zytokin-Konzentration. Die Visualisierung zeigt eine grafische Darstellung der verschiedenen Konzentrationen des Stimulus 3M-002 gegen die beobachtete Konzentration der Zytokine TNF-α. Die Farben der Linien beziehen sich auf die unterschiedlichen Genotypen für eine Single-Nukleotid-Polymorphismus im Gen NFKBIA der Individuen in unserer angeborenen Immunsystems zu untersuchen. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Ein Screenshot von einer Zwei-Säulen-Visualisierung Matrix. Wir erzeugten eine Zwei-Säulen-Matrix zu einem Side-by-Side-Vergleich der Antworten auf zwei Reize, 3M-003 und LPS zu erleichtern. Die x-Achse sind die verschiedenen Konzentrationen der beiden Reize, und die y-Achse zeigt die Werte des berechneten Feldes, PFD&gt; 2. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Diese Tableau Dialog-Fenster zeigen, wie die Daten in verschiedenen Tabellen aufgenommen zu verbinden. Einbinden von Daten aus verschiedenen Tabellen können durch die Kombination dieser mit logischen Join-Klauseln der wichtigsten Werte erreicht werden. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="10"> Visualisierung und Analyse-Tool </td></tr><tr><td> Funktion </td><td> Bild </td><td> VIS-STAMP </td><td> xmdvtool </td><td> Ggobi </td><td> Sternenlicht </td><td> Gapminder </td><td> Visulab </td><td> InfoVis Toolkit </td><td> Geotime </td><td> Inspirieren </td></tr><tr><td> Parallel zu koordinieren Grundstücke </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td></tr><tr><td> Streudiagramm-Matrizen </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td></tr><tr><td> Dimensional Reduktion </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td></tr><tr><td> Zeitlichen Dimensionen </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td></tr><tr><td> Geospatial Dimensionen </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Nicht </td></tr><tr><td> Text-Mining </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Ja </td></tr><tr><td> Die direkte Manipulation von Daten </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Nicht </td></tr><tr><td> Filtering </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Ja </td></tr><tr><td> Erweiterbarkeit auf andere Plattformen (zB R) </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td></tr><tr><td> CSV-Tabelle Formate </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td></tr><tr><td> XML-Datenformate </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Nicht </td></tr><tr><td> Kann mit 1 Deal0000 + Zeilen </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Ja </td></tr><tr><td> Dokumentation </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td><td> Ja </td></tr><tr><td> Kommerzielles Produkt </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Nicht </td><td> Ja </td><td> Ja </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Liste der Visual Analytics-Tools und einige ihrer Funktionen.

<ol>
	<li>Thomas, J., Cook, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Path:+The+Research+and+Development+Agenda+for+Visual+Analytics.">Illuminating the Path: The Research and Development Agenda for Visual Analytics.</a> , (2005).</li><li>Steed, C., Swan, J., Jankun-Kelly, T., Fitzpatrick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+Analysis+of+Hurricane+Trends+Using+Statistical+Processes+Integrated+with+Interactive+Parallel+Coordinates.">Guided Analysis of Hurricane Trends Using Statistical Processes Integrated with Interactive Parallel Coordinates.</a> IEEE Symposium on Visual Analytics Science and Technology. , 19-26 (2009).</li><li>Saraiya, P., North, C., Lam, V., Duca, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Insight-Based+Longitudinal+Study+of+Visual+Analytics.">An Insight-Based Longitudinal Study of Visual Analytics.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 12, 1511-1522 (2006).</li><li>Kollmann, T. R., Crabtree, J., Rein-Weston, A., Blimkie, D., Thommai, F., Wang, X. Y., Lavoie, P. M., Furlong, J., Fortuno, E. S., Hajjar, A. M., Hawkins, N. R., Self, S. G., Wilson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+innate+TLR-mediated+responses+are+distinct+from+those+of+adults.">Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults.</a> J. Immunol. 183, 7150-7160 (2009).</li></ol>

Das Aufkommen von High-Throughput-Technologien in der modernen biomedizinischen Forschung führte zu einer Explosion der Forschung Daten, die eine effizientere Methode zur Analyse erfordert. Visual Analytics (VA) ist die Wissenschaft der analytischen Argumentation interaktiven visuellen Schnittstellen (1) erleichtert. Die VA-Ansatz stellt die analytische Kraft in den Händen der Menschen Analyst, im Gegensatz zu den traditionellen Ansatz, um Muster von Computer zu erkennen. Visual Analytics hat Forschung in verschiedene...

facilitating the analysis of immunological data with visual analytic techniques

Visual Analytics (VA) hat als einen neuen Weg, um große Datensätze durch interaktive Visualisierung analysieren entstanden. Wir zeigten den Nutzen und die Flexibilität eines VA-Ansatz in der Analyse von biologischen Datensätzen. Beispiele für diese Datensätze in der Immunologie zählen Durchflusszytometrie, Luminex Daten und Genotypisierung (zB Single-Nukleotid-Polymorphismus)-Daten. Im Gegensatz zu den traditionellen Informationsvisualisierung Ansatz, stellt die Analyse VA Macht in den Händen von Analysten, indem der Analytiker in Echtzeit Daten Exploration Prozess zu engagieren. Wir haben uns für die VA Software namens Tableau nach der Auswertung mehrerer VA-Tools. Zwei Arten der Analyse Aufgaben Analyse innerhalb und zwischen den Datensätzen wurden in der Video-Präsentation mit einem Ansatz namens gepaart Analyse nachgewiesen. Gepaart Analyse, wie in VA definiert, ist eine Analyse-Ansatz, in dem ein VA-Tool-Experte arbeitet Seite an Seite mit einem Domain-Experte bei der Analyse. Die Domain-Experte ist derjenige, der die Bedeutung der Daten versteht, und stellt die Fragen, die die gesammelten Daten könnten Adresse. Das Tool-Experte erstellt dann Visualisierungen zu helfen, finden Sie Muster in den Daten, die diese Fragen beantworten könnte. Die kurze Verzögerungszeit zwischen der Hypothese Generation und die schnelle visuelle Darstellung der Daten ist der Hauptvorteil eines VA-Ansatz.

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Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual Analytics (VA) ist ein neuer Ansatz zur Analyse von Daten interaktiv. In diesem Video sprechen wir die Daten Überlastung Problem durch High-Throughput-biologische Experimente gebracht werden, und schlagen VA als eine Lösung für dieses Problem nicht. Das Video demonstriert Analyse innerhalb und zwischen den immunologischen Datensätze mit einem VA-Tool namens Tableau.

Erleichterung der Analyse der immunologischen Daten mit Visual analytischen Techniken

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

facilitating-analysis-immunological-data-with-visual-analytic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K Aufrufe.  University of British Columbia. Visual Analytics (VA) ist ein neuer Ansatz zur Analyse von Daten interaktiv. In diesem Video sprechen wir die Daten Überlastung Problem durch High-Throughput-biologische Experimente gebracht werden, und schlagen VA als eine Lösung für dieses Problem nicht. Das Video demonstriert Analyse innerhalb und zwischen den immunologischen Datensätze mit einem VA-Tool namens Tableau.

Serie: Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Die Erleichterung Drug Discovery: Eine automatisierte High-Content-Assay Entzündung im Zebrafisch

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

Visualisierung der immunologischen Synapse von Dual Color Zeitgesteuerte Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoskopie

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically explore characteristics of their cellular samples. However, these technological advancements yield high-dimensional data sets that have become increasingly difficult to analyze objectively within traditional manual-based gating programs. In order to better analyze and present data, scientists partner with bioinformaticians with expertise in analyzing high-dimensional data to parse their flow cytometry data. While these methods have been shown to be highly valuable in studying flow cytometry, they have yet to be incorporated in a straightforward and easy-to-use package for scientists who lack computational or programming expertise. To address this need, we have developed ExCYT, a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that streamlines the analysis of high-dimensional flow cytometry data by implementing commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction by t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots. Additionally, ExCYT provides traditional gating options of select populations of interest for further t-SNE and clustering analysis as well as the ability to apply gates directly on t-SNE plots. The software provides the additional advantage of working with either compensated or uncompensated FCS files. In the event that post-acquisition compensation is required, the user can choose to provide the program a directory of single stains and an unstained sample. The program detects positive events in all channels and uses this select data to more objectively calculate the compensation matrix. In summary, ExCYT provides a comprehensive analysis pipeline to take flow cytometry data in the form of FCS files and allow any individual, regardless of computational training, to use the latest algorithmic approaches in understanding their data.

ExCYT is a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that allows users to analyze their flow cytometry data via commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction via t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots.

ExCYT: Eine grafische Benutzeroberfläche für die Straffung der Analyse hochdimensionaler Cytometry Daten

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Komplementärer Einsatz von mikroskopischen Techniken und Fluoreszenzlesen beim Studium von Cryptococcus-Amoeba-Interaktionen

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Anwendung konsistenter massageähnlicher Störungen an Mauskälbern und Überwachung der daraus resultierenden intramuskulären Druckänderungen

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Funktionalisierung von Atomkraftmikroskop-Auslegern mit Einzel-T-Zellen oder Einzelpartikeln für die immunologische Einzelkraftspektroskopie

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...