Name: Serie: Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy
Uploaded: 2014-03-24T20:00:00
Duration: 10 min
Description: 77.9K Aufrufe. Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine. Hier veranschaulichen wir das Protokoll für die Bildgebung durch Zwei-Farben-STED Nanoskopie die zytotoxische Immunsynapse von NK-Zellen auf Glas rekapituliert. Mit dieser Methode erhalten wir sub-100 nm Auflösung von Synapsen-Proteine und des Zytoskeletts.

Wir danken Geoff Daniels für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von R01 AI067946 zu JSO finanziert

1. Coat Deckgläser mit Antikörper <ol><li> Vorgewärmte (37 ° C) 30 ml RPMI-10% FCS-Medium und 1 ml BD Cytofix / Cytoperm. </li><li> Eine Lösung von 5 ug / ml gereinigtem Antikörper in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Zur Aktivierung der NK92-Zelllinie, die Verwendung von anti-CD18-und Anti-NKp30 empfohlen. <ol><li> Mark etwa ein Cent großen Kreis für jede Bedingung auf einem Deckglas # 1.5 mit einem PAP-Stift. Unbefleckt, Dual gefärbt, und zwei Einzelbuntbedingungen: Für ein Zweifarben-Experiment sollte es vier Bedingungen. Verzichtet werden 200 ul der Antikörperlösung in jedem Bereich und bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Waschen Deck durch leichtes Eintauchen jeweils in 50 ml PBS in einem 50 ml konischen Röhrchen bei Raumtemperatur. Waschen sollte unmittelbar vor der Zugabe von Zellen und darauf geachtet werden, um Antikörper Trocknen auf dem Deckglas zu vermeiden auftreten. </li></ol></li></ol> 2. Aktivieren NK-Zellen auf Deckrutscht, Fix und permeabilisieren <ol><li> Isolieren Sie 5 x 10 5 Zellen pro NK92 Zustand. Zentrifugen und Dekantierstand. Einmal mit 10 ml vorgewärmtem Medium aus Schritt 1.1 waschen. Zentrifugen und Dekantierstand. <ol><li> Die Zellen in vorgewärmten Medien aus Schritt 1.1 in einer Konzentration von 2,5 x 10 6 / ml. </li><li> Vorsichtig dekantieren 200 ul zum Zentrum der Region in Abschnitt 1.2.1 erstellt. Inkubieren bei 37 ° C für 20 min bei 5% CO 2. (Anmerkung: diese Zeit verlängert oder verringert werden, je nach der biologischen Funktion von Interesse für die NK-Zell-Granulat Polarisation, 20 min ausreichend.). </li></ol></li><li> Nach der Inkubation der Zellen vorsichtig waschen Deckgläser durch Eintauchen jeweils in 50 ml PBS Raumtemperatur in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> 1 ul Triton X-100 zu 1 ml vorgewärmten Fix / Perm-Lösung aus Schritt 1.1 und gründlich vortexen. Fix und permeabilisieren durch Zugabe von 200 ul Fix / Perm-Puffer (Schritt 2.3) zu den Zellen. Inkubation: 10 min der Dunkelheit bei Raumtemperatur. </li></ol> 3. Stain Cells <ol><li> Vorbereitung Färbepuffer: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1% BSA, 0,1% Saponin. <ol><li> Bereiten Lösung des primären Antikörpers in 200 ul Färbepuffer (siehe Schritt 3.1). (Anmerkung: Antikörper sollte vor Gebrauch titriert werden). Vermeiden Sie die Verwendung von primären Antikörper, der in den gleichen zum Beschichten der Deckglas (Schritt 1.2) Arten ausgelöst wird. Vermeiden Sie auch Strepatividin-Biotin-Bindungen für STED-Bildgebung. </li><li> Nach Abschnitt 2.3.1, vorsichtig waschen Deckgläser in 50 ml Puffer Färbung. Dab Kanten der PAP-Pen-Region mit Wattestäbchen, um überschüssige Puffer zu entfernen. Bewerben Antikörper-Lösung in Abschnitt 3.1.1 erstellt. Inkubieren 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. (Empfohlen: Inkubation Deckschieber in-Box mit einem feuchten Papiertuch, um Feuchtigkeit zu halten). </li></ol></li><li> Bereiten Lösung des sekundären Antikörpers in 200 ul FärbungPuffer. Empfohlene Fluorophore Alexa Fluor 488, Pacific Orange und V500. Im Allgemeinen ist eine 1:200-Verdünnung für STED-Bildgebung. <ol><li> Behutsam Deckgläser in 50 ml Puffer Färbung. Dab Kanten der PAP-Pen-Region mit Wattestäbchen, um überschüssige Puffer zu entfernen. Bewerben sekundären Antikörperlösung. Inkubieren 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Wiederholen Waschen und Färbung für zusätzliche Proteine ​​von Interesse. Erfassen, wenn F-Aktin mit Phalloidin, kann dies mit sekundären Antikörper enthalten, die allgemein bei einer 1:200 Verdünnung. </li></ol> 4. Berg Deckgläser auf Folien <ol><li> Bereiten Montagemedium. Hinweis: Verlängern oder Prolong Gold-vorzuziehen. Vectashield müssen vermieden werden, da es nicht mit STED kompatibel. 2,2-thiodioethanol muss vermieden werden, wenn Phalloidin verwendet werden. Mowiol akzeptabel ist. </li><li> Es werden ca. 10-20 ul Eindeckmedium auf einer Folie. Invert Deckglas (Zellseite nach unten) und montieren Deckglas vorsichtig, wobei darauf zuvermeiden Einführung von Luftblasen. Die Objektträger für 24 h (Deckglas nach oben) vor der Bildgebung. </li><li> Siegel Kanten des Deckglases mit Nagellack. </li></ol> 5. Versuchsaufbau <ol><li> Initiieren erforderlich Laser-und Software. Initiieren STED Erschöpfung Laser bei 100% Leistung. Richten STED-Laser, der im Falle von kommerziellen Systemen ist oft ein automatisiertes Verfahren. </li><li> Fokus der Probe, beginnend mit Einzelbuntkontrolle, am Mikroskop mit Okularen. </li></ol> 6. Optimierung der Einstellungen <ol><li> Scannen Sie den ersten Kanal und optimieren Laserleistung, Erregung Strahlposition und Detektor-Bereich. Wenn möglich, vermeiden einen Gewinn von&gt; 100. Nehmen Sie das Bild in der konfokalen, um die Einstellungen zu optimieren. Linien-und / oder Bildmittelung wird die Auflösung zu erhöhen. Überprüfen Sie für Pixelsättigung. Hinweis: Einige Sättigung ist in der konfokalen akzeptabel Anwendung der STED wird die Intensität der Emission zu reduzieren. Für STED wird eine optimale Pixelgröße unter 30 nm sein, wieimmer bessere Auflösung wird mit kleineren Pixelgrößen erreicht werden. Die Größe der Region von Interesse, das abgebildet wird die untere Grenze der Pixelgröße zu diktieren. Kleinere Pixelgrößen Photobleaching zu erhöhen. <ol><li> Bewerben STED Erschöpfung Strahl und Bildaufnahme, beginnend mit 50% Erschöpfung Laserleistung. Wenn eine Verbesserung der Auflösung zu sehen ist, können weitere Verarmung Laserleistung aufgebracht werden. Auf dieser Stufe kann es notwendig sein Anregungslaserleistung, Leitungs Durchschnitt und / oder Verstärkung einzustellen. </li><li> Bewerben Zeit-Gating in den Hintergrund (mindestens 0,3 ns) zu reduzieren. Passen Sie die Einstellungen, bis eine Verbesserung der Auflösung über konfokalen gesehen werden kann. Auflösung kann durch Schätzen Halbwertsbreite (FWHM) angenähert werden. Dies ist der Abstand, bei dem die Hälfte der maximalen Intensität eines Gaußschen Spitzen erstellt, indem eine Linie Profil über die Struktur von Interesse, und ist eine weit verbreitete Methode zur Schätzung Auflösung. </li><li> Sobald der erste Kanal zufriedenstellend ist, initiieren eine zweite Folge für sichQuential Scannen. In der Regel ist es am besten, die längere Wellenlänge Fluorophor ersten scannen. Wiederholen Sie Schritt 6.1 auf zweiten Kanal. </li></ol></li><li> Mangel an spektrale Überlappung Bestätigen System einzelne Bunt Kontrollen mit beiden Scan-Sequenzen. Mild spektrale Überlappung kann mit spektralen un-Mixing-Funktionen in der Software korrigiert werden, jedoch sollte nach Möglichkeit vermieden werden. </li></ol> 7. Image Acquisition <ol><li> Erwerben Bilder. Für die quantitative Bildgebung, ist es empfehlenswert, mindestens 20 Bilder / Zustand zu erhalten. Die genaue Zahl sollte jedoch nach der experimentellen Frage im Konzert mit einem statistischen Ansatz wie Probengrößenberechnung definiert werden. Sparen Experiment. </li></ol> 8. Entfaltung <ol><li> Öffnen Sie die Datei mit Entfaltungs Software oder Stapelverarbeitung. Überprüfen Sie die Parameter für jeden Kanal mit Hilfe von Software. Bestätigen Anregungs-und Emissionsspektren der einzelnen Kanäle, STED Erschöpfung Emission und Bildrichtungtion (nach oben oder unten, wenn das Bild 3-dimensional) im besonderen. </li><li> Entfalten, mit der Entfaltung Assistenten. Standardeinstellungen sind in der Regel ausreichend, jedoch Rausch-Verhältnis (sntr) Signal vom Fluorophor Fluorophor variieren und müssen für jeden Kanal und jedes Experiment individuell bestimmt werden. </li></ol>

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	<li>Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse+of+CTL+contains+a+secretory+domain+and+membrane+bridges.">The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges.</a> Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).</li><li>Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mature+activating+natural+killer+cell+immunologic+synapse+is+formed+in+distinct+stages.">The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).</li><li>Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microclusters+of+inhibitory+killer+immunoglobulin-like+receptor+signaling+at+natural+killer+cell+immunological+synapses.">Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses.</a> J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).</li><li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells.">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).</li><li>Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+the+movement+of+signaling+microclusters+with+cellular+motility+in+immunological+synapses.">Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses.</a> Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).</li><li>Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+agonist+MHC-peptide+complex-dependent+T+cell+receptor+microclusters+as+scaffolds+for+signaling.">Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling.</a> J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).</li><li>Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+TCR+signaling+from+geometrically+repatterned+immunological+synapses.">Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses.</a> Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster.">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li><li>Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse:+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques.">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front. Immunol. 3, 421 (2012).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li><li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy.">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).</li><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscopy+in+a+living+multicellular+organism+expressing+GFP.">Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP.</a> Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).</li><li>Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+resolution+in+GFP-based+microscopy.">Nanoscale resolution in GFP-based microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).</li><li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells.">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li><li>Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+cardiac+mitochondrial+protein+clusters+with+STED+microscopy.">Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy.</a> Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).</li><li>Tonnesen, J., Nagerl UV, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+for+neuroscience.">Superresolution imaging for neuroscience.</a> Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).</li><li>Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+multicolor+STED+nanoscopy+of+presynaptic+proteins+in+the+calyx+of+held.">Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held.</a> PLoS One. 8 (4), (2013).</li><li>Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolution+microscopy+reveals+an+array+of+MINOS+clusters+along+human+mitochondria.">STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination).">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination).</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski, ., Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42-interacting+protein-4+functionally+links+actin+and+microtubule+networks+at+the+cytolytic+NK+cell+immunological.">Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological.</a> J. Exp. Med. 204 (10), 2305-2320 (2007).</li><li>Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating.">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren. Teilweise Veröffentlichung Kosten dieser Artikel wurde von Leica Microsystems, Inc. bestritten

Die Verbesserung der Auflösung über konfokale wird etwas abhängig von Faktoren, die nicht kontrolliert werden können. Diese Faktoren schließen kleinere Aberrationen in Deckglasdicke und Ungereimtheiten bei der Montage Medien. Es ist wichtig, die Temperatur und Feuchtigkeit in dem Abbildungsraum so konstant wie möglich zu halten, und die STED-Strahl sollte etwa alle 60 min ausgerichtet werden. Wie im Verfahren erwähnt, muss Einsatz von Vectashield Montagemedium vermieden werden, da dies nicht mit der STED-kompatibel. Zusätzlich zu dem, sollte man immer mit # 1.5 Deckgläser, und wenn vorhanden, verwenden solche, die zu einer bestimmten Dicke verifiziert worden sind. Eine Modifikation der hier beschriebenen Ansatz ist es, Bild zusätzliche Kanäle in der konfokalen mit Fluorophore, die bei einer längeren Wellenlänge als der STED-Strahl emittieren. Auf diese Weise kann ein Bild bis zu vier Kanälen (zwei in der konfokalen, zwei in STED). Wenn die diesen Ansatz jedoch die Kanäle mit Fluorophore emitting über der STED-Laser Erschöpfung müssen zuerst abgebildet werden, als Anwendung der STED-Strahl Photonen in diesen Kanälen führen. Ein Vorteil dieser Technik ist die Anwendung von Zeit-Gating, die auch in der konfokalen Auflösung zu verbessern, indem Emission von Photonen mit kurzer Lebensdauer 34. Insbesondere wird der Einsatz von Zeit-Gating, den Zeitpunkt der Emissionsdetektoren mit gepulster Anregung STED entsprechen, Hintergrundfluoreszenz von Reflexion Deckglas zu verringern, wenn die Abbildung in dessen Nähe. Selbst in einem Experiment nicht für STED geeignet, wenn mit einem gepulsten Anregungsquelle, Zeit-Gating kann ein nützliches Instrument zur Verbesserung der Auflösung in der konfokalen sein. Es gibt verschiedene Modifikationen, die genutzt werden können, um die Auflösung in der STED verbessern. Einer ist, die Größe der Lochblende von der Standard 1 Airy Einheit zu verringern, obwohl dies auch die Menge an Licht, das die Probe zu verringern. Dies kann durch Erhöhung las kompensiert werdener Macht oder Gewinn. Eine andere ist, Rauh erhöhen, was die Menge an Informationen für jedes Photon gesammelt erhöhen wird, die Verbesserung der Auflösung. Wiederum kann dies jedoch auf Kosten der Photobleichung der Probe sein, damit ein Gleichgewicht muss zwischen Auflösung und Bleich gefunden werden. Ebenso wird die Verwendung von fluoreszierenden Proteine ​​wie GFP sorgfältige Optimierung erfordern, um die Bleich vermeiden. Dies kann durch eine Verringerung der STED-Laserleistung bei Bedarf durchgeführt werden. Längere Zeitpunkte werden auch für größere Photonen Erholung zu ermöglichen und zu reduzieren Bleichen. Korrektur für Photobleaching sollte bei der Analyse von Live-STED berücksichtigt werden. Natürlich ist Bildgebung in 3 Dimensionen in STED auch möglich, und wird auch eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen konfokalen Abbildung geben. Dies gilt insbesondere, wenn es in Kombination mit Dekonvolution durchgeführt wird, wobei darauf zu achten, um die Drift, die während der Bild mehreren Ebenen in der z-Achse erfolgt korrigieren. Bei Verwendung von Huygens Softwarezu entfalten, ist diese Korrektur mit der &quot;Bild stabilisieren&quot;-Funktion erhalten. Mit diesem Ansatz wird eine Auflösung in der z-Achse verbessert werden. Dies ist eine große Verbesserung gegenüber herkömmlichen konfokalen Bildgebung, die schlechte axiale Auflösung hat, und sogar über sich selbst nur STED, die auch eine relativ schlechte Auflösung der z-Achse. Während Erwerb mehrere Stapel in STED, muss darauf geachtet werden, um ein Ausbleichen der Probe zu vermeiden, und wenn nötig kann man Linie Mittelung oder Laserleistungsstärke, um so zu tun zu reduzieren. Wiederum sei darauf hingewiesen, dass, wenn die Abbildung anderer Fluorophore, die nicht geeignet sind für STED Anwendung des Verarmungsstrahls in der ersten sequentiellen Abtastung würde Emission aus diesen Kanälen zu verhindern. Daher ist eine gemischte STED / konfokalen Ansatz (bei Verwendung der konfokalen Scan in Kanäle, die bei einer Wellenlänge größer als 592 nm emittieren) wird leider nicht geeignet für 3D sein. Zusammenfassend haben wir STED als Ansatz aufgrund seiner relativen Einfachheit der App ausgewähltlichung und Verbesserung der Auflösung gegenüber Standard-konfokale Bildgebung. Für die Abbildung der Immunsynapse ist es eine effektive und wertvolle Technik, die uns zu Details in F-Actin-Architektur nicht möglich, bei einer Auflösung von mehr als 200 nm sehen können bewährt. Während viele dieser Details scheinen subtile, können sie eine tiefgreifende Wirkung auf die NK-Zell-Funktion. So werden wir die Anwendung der neuesten Imaging-Technologie, um nanoskopische Gewinnung von Informationen, die entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gesundheit des Menschen ist.

Die immunologische Synapse ist ein komplexes Milieu von Signalproteinen und Zytoskelett-Elemente. Die zytolytische Synapse wurde ursprünglich als mit einer &quot;Bullaugen&quot;-Struktur mit einem Ring aus Aktin und Adhäsionsmoleküle um einen zentralen sekretorischen Domain 1-4 beschrieben. Allerdings wissen wir jetzt, dass es aus der mikroskopischen Domänen aktives Melde, die eine kontinuierliche dynamische Reorganisation des Zytoskeletts für die Funktion benötigen 5-11. Viele der Informationen, die wir jetzt haben, über die Synapse ist von Mikroskopie abgeleitet und Immunologen haben Early Adopters von innovativen Imaging-Technologie. Eine dieser neuen Technologie ist Super-Resolution-Mikroskopie. Konventionelle Lichtmikroskopie ist räumlich durch die Beugungsgrenze des Lichts, das die untere Grenze der Auflösung der Fluoreszenzmikroskopie für alle, einschließlich der konfokalen, bei ca. 200 nm setzt begrenzt. In den letzten Jahren wurden verschiedene Techniken wurden developed, die Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze zu ermöglichen. Dazu gehören Stimulation Emission Depletion-Mikroskopie (STED), Structured Illumination Microscopy (SIM), stochastisch gelöst Mikroskopie (STORM) und photoaktivierbares Lichtmikroskopie (PALM). Diese Techniken wurden an anderer Stelle ausführlich 12-15 gelesen, dennoch werden im Folgenden erläutert. Subdiffraction begrenzte Auflösung wird in einzigartiger Weise in jedem System erzeugt. Die Auswahl der Super-Auflösungstechnik sollte daher durch das Experiment und Versuchssystem von Interesse bestimmt werden. STED Super Resolution wird mit einem hochintensiven Ringkernstrahl Erschöpfung, die selektiv &quot;Schweigen&quot; Fluoreszenz um jedes Fluorophor von Interesse nach der Anregung, was subdiffraction begrenzten Fluoreszenzmikroskopie 16-18 erreicht. Ein Vorteil ist, dass STED-Bildaufnahme ist schnell und erfordert relativ wenig Nachbearbeitung. Während die Farbstoffauswahl wird durch die Spezifikation vorgegebenLaufstellung der Sperrbalken, der in dem im Handel erhältlichen Systems bei 592 nm liegt, sind mehrere im Handel erhältliche Farbstoffe zur Verfügung, die Kombinationen von zwei Fluorophoren zu ermöglichen. Zusätzlich können häufig verwendete fluoreszierende Reporter wie GFP abgebildet werden, wodurch der Lebendzellexperimente möglich 19,20. Wir haben früher verwendet STED zur Identifizierung und Quantifizierung Regionen von F-Aktin Hypodensität die von NK-Zellen für die Degranulation 21,22 verwendet werden. Wir schlagen vor, dass STED ist eine gute Wahl für die Abbildung der Immunsynapse aufgrund seiner relativ flexible Verfügbarkeit der Fluorophore und überlegene Verbesserung der Auflösung in der xy-Achse. Zusätzlich zu den im Handel erhältlichen STED System für diese Experimente verwendet, ermöglicht eine schnelle Erfassung von Bildern mit minimalen Schäden an Proben die Verwendung einer hohen Geschwindigkeit (12.000 Hz) Tomographen. Eingeschränkte Flexibilität in Farbstoffauswahl gilt als ein Nachteil der STED-12,jedoch zweifarbigen STED ist relativ einfach mit einigen handelsüblichen Fluorophore. Die Integration der STED mit einem konfokalen Laserrastermikroskop bietet außerdem zusätzliche konfokale Bildgebung in Kombination mit STED, also, während STED ist auf zwei Kanäle, zusätzliche Strukturen in der konfokalen mit einer Auflösung von etwa 200 nm (E. Mace, unveröffentlichte Beobachtungen abgebildet werden ). Während wir beschreiben die Verwendung von STED zum Abbilden Immunzellen ist diese Technologie auf eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich neuronaler Zellen, und zur Visualisierung einer Vielzahl von Zellstrukturen 23-26 angelegt. SIM verwendet einen anderen Ansatz, um subdiffraction begrenzte Bilder zu erzeugen. Durch die Visualisierung bekannten periodischen Erregungsmuster können dann Informationen über den unbekannten Struktur, die folgende mathematische Transformation 27 studierte erhalten werden. Dies ergibt eine Erhöhung der Auflösung auf ~ 100 nm seitlich 28,29. Der Vorteil ist, dass es SIM-is mit allen Standard-konfokalen Farbstoffe und Sonden-kompatibel, aber der Nachteil ist, dass es viel langsamer, um Bilder zu erwerben und diese erfordern eine lange Post-Processing-12. Dies schränkt auch die Verwendung für Live Cell Imaging. Schließlich kann Super-Resolution-Bilder durch stochastische Foto-Schalt Fluorophore erzeugt werden. Dieser Ansatz wird in photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) und stochastischen optischen Rekonstruktion Mikroskopie (STORM) ausgebeutet. Durch das Scannen von mehreren Kamerarahmen und Lokalisierung von aktivierten Moleküle zufällig &quot;on&quot; und &quot;off&quot;, die im Laufe der Zeit eingeschaltet sind, werden die Bilder mit 20-30 nm Auflösung von angesammelten 30-32 Frames generiert. Die Trade-off für diese Auflösung ist die erforderliche Zeit, um Bilder zu erwerben. Hier zeigen wir im Detail, das Protokoll für die Vorbereitung und Dual Imaging Farbproben in STED. In diesem System ist die Anregung mit einer gepulsten, abstimmbaren, Weißlichtlaser. Aufgrund der Naturder gepulsten Anregungsstrahl wird die Zeit-Gating Nachweis möglich gemacht und ein weiterer Anstieg Auflösung. Darüber hinaus ist das System mit Gadolinium Hybrid (HYD)-Detektoren, die empfindlicher als herkömmliche Photovervielfacherröhren sind ausgestattet, so dass für niedrigere Laserleistungsanforderungen. Die Erschöpfung Strahl zur STED kontinuierlich angelegt und auf 592 nm, die die Wahl von Farbstoffen für die zwei Farb STED verfügbar diktieren abgestimmt. Häufig verwendete Farbstoff-Kombinationen sind in der Regel eine erregbare von 488 nm (wie Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights grün oder Chromeo 488) und eine erregbare von 458 nm (wie Pacific Horizon orange oder V500). Während also Detektion der beiden Farbstoffe wird in einem ähnlichen Bereich (und beide sind durch die Verarmungslaser zugänglich), Erregung mit verschiedenen Wellenlängen liegen. Mit einem abstimmbaren Weißlichtlaser und abstimmbare Detektoren, die Maximierung Signal, während die Beseitigung spektrale Überlappung ist ziemlich leicht gemacht. Als solche haben wir gute Erfolge mit Kombination hatteIonen von kommerziell erhältlichen Farbstoffen, wie Pacific Orange und Alexa Fluor 488 (verwendet). Unser Protokoll ist auf maßgeschneiderte und beschreibt die Bewertung der menschlichen NK-Zellen wie den historischen Schwerpunkt unserer Labor darstellt. Wir sind speziell die Nutzung der NK92-Zelllinie in diesem Beispiel, wie das ist, den wir regelmäßig in unserer experimentellen Arbeit 21,33 aufgebracht.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:602px;" width="602">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:230px;">#1.5 cover slips</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">BD Cytofix/Cytoperm</td>
			<td style="width:222px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:150px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Cotton tipped applicator</td>
			<td style="width:222px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S450941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Falcon centrifuge tubes (50 ml)</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Fetal calf serum (FCS) (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:150px;">S11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Goat anti-rabbit Pacific Orange</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P31584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Laboratory tissue wipers</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Nail polish</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">100491-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">NK-92 cells</td>
			<td style="width:222px;">ATCC</td>
			<td style="width:150px;">CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phalloidin Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Prolong anti-fade reagent</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-CD18</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">301202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-NKp30</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">325202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-perforin</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">308102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">RPMI 1640 medium (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Saponin from Quillaja bark</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Super PAP pen</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">008899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:222px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:150px;">22142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Material Name</td>
			<td style="height:27px;">Company</td>
			<td style="height:27px;">Catalogue Number</td>
			<td style="height:27px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Huygens deconvolution software</td>
			<td style="height:27px;">SVI</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Leica SP8 TCS STED microscope</td>
			<td style="height:27px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (sted) nanoscopy

Natürliche Killerzellen bilden streng reguliert, fein abgestimmte immunologischen Synapsen (IS), um viral infizierte oder tumorerzeugende Zellen zu lysieren. Dynamische Aktinreorganisation ist entscheidend für die Funktion der NK-Zellen und die Bildung des IS. Imaging von F-Aktin an der Synapse ist traditionell genutzt konfokale Mikroskopie, aber die Beugungsgrenze des Lichts beschränkt Auflösung der Fluoreszenz-Mikroskopie, konfokale darunter, etwa 200 nm auf. Jüngste Fortschritte in der Imaging-Technologie haben die Entwicklung der subdiffraction begrenzten Super-Resolution Imaging aktiviert. Um F-Actin-Architektur an der IS visualisieren rekapitulieren wir die NK-Zell-zytotoxischen Synapse durch Ankleben NK-Zellen zu aktivieren Rezeptor auf Glas. Wir haben dann Bild Proteine ​​von Interesse mit Zwei-Farben-stimulated emission depletion-Mikroskopie (STED). Dies führt zu &lt;80 nm Auflösung an der Synapse. Hier beschreiben wir die Schritte der Probenvorbereitung und der Akquisition von Bildern mit Dual-col beschreibenSTED Nanoskopie oder F-Aktin an der NK visualisieren IST. Wir veranschaulichen auch die Optimierung der Probennahme mit Leica SP8-Software und gated STED-Zeit. Schließlich nutzen wir Huygens-Software für die Nachbearbeitung Entfaltung der Bilder.

Klar ist, dass ein Hauptziel der Super-Resolution Imaging eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen konfokalen Mikroskopie. Allerdings gibt es einige Fallstricke, die zu suboptimalen Auflösung führen kann. Diese verlangen, dass jedes Experiment individuell optimiert werden. In unserer repräsentativen Experiment, wir sind die Abbildung der F-Actin-Netzwerk in einem NK-Zellen durch Antikörper gebunden an Glas aktiviert. Häufige Ursachen von (und für Korrekturen) einen Mangel der verbesserten Auflösung der STED über konfokalen sind wie folgt: <ol><li> Unter-Abtastung (Abbildung 1a). Dies kann zu Körnigkeit und Verlust von Pixelinformationen führen, wie durch schlechte Auflösung von F-Aktin-Filamenten gezeigt. Erhöhte Linie oder Bildmittelung kann oft korrigieren. </li><li> Bleich-und / oder Überabtastung (Abbildung 1b). Dies kann durch langwierige Pixelverweilzeit infolge übermäßigen Mittellinie hervorgerufen werden. Alternativ kann es aufgrund der Überabtastung des Bildes vor der Übernahme, einschließlich Übernutzung seindie Verarmungs Laser. Dies führt häufig in trübe oder unscharfe Bilder. Dies kann durch das Scannen des Interessengebiet nur minimal vor dem Erwerb oder, wenn möglich, die Erhöhung Laserscangeschwindigkeit korrigiert werden. Wenn das Problem weiterhin besteht, können die Erschöpfung Laserleistung reduziert werden. </li></ol> Mit dem Erreichen der richtigen Balance von Pixelverweilzeit, Erregung Laserleistung und Erschöpfung Laserleistung, ein Bild mit verbesserter Auflösung und ausreichende Informationen generiert werden können (Abbildung 1c). Auflösung kann durch die Verwendung der Entfaltungs (1d) verbessert werden. Beim Erwerb optimiert ist, wird Entfaltung Auflösung qualitativ und quantitativ zu verbessern und sub-100 nm Auflösung sollte routinemäßig erreichbar sein. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" /> Abbildung 1. Optimierung der Erwerb und die Fallstricke des STED-Bildgebung. NK92-Zellen wurden auf Anti-CD18 und NKp30-beschichtetes Glas für 20 min aktiviert, dann fixiert, permeabilisiert und für die F-Aktin mit Phalloidin Alexa Fluor 488 gefärbt. A) Ein Beispiel für Verlust von Bildinformationen durch Unterabtastung. b) Ein Beispiel für Verlust der Auflösung durch Bleichen / Oversampling c) Bedingungen optimiert d) optimierten Bedingungen führen zu einer größeren Verbesserung der Auflösung mit Entfaltung. Maßstabsbalken = 5 um.

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Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Hier veranschaulichen wir das Protokoll für die Bildgebung durch Zwei-Farben-STED Nanoskopie die zytotoxische Immunsynapse von NK-Zellen auf Glas rekapituliert. Mit dieser Methode erhalten wir sub-100 nm Auflösung von Synapsen-Proteine ​​und des Zytoskeletts.

Visualisierung der immunologischen Synapse von Dual Color Zeitgesteuerte Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoskopie

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

visualization-immunological-synapse-dual-color-time-gated-stimulated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

77.9K Aufrufe.  Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine.  Hier veranschaulichen wir das Protokoll für die Bildgebung durch Zwei-Farben-STED Nanoskopie die zytotoxische Immunsynapse von NK-Zellen auf Glas rekapituliert. Mit dieser Methode erhalten wir sub-100 nm Auflösung von Synapsen-Proteine ​​und des Zytoskeletts. 

Serie: Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

Erleichterung der Analyse der immunologischen Daten mit Visual analytischen Techniken

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure that optimizes B-cell receptor (BCR) signaling and BCR-mediated antigen acquisition. Both the remodeling of the actin cytoskeleton and the reorientation of the microtubule network towards the antigen contact site are essential for immune synapse formation. Remodeling of the actin cytoskeleton into a dense peripheral ring of F-actin is accompanied by polarization of the microtubule-organizing center towards the immune synapse. Microtubule plus-end binding proteins, as well as cortical plus-end capture proteins mediate physical interactions between the actin and microtubule cytoskeletons, which allow them to be reorganized in a coordinated manner. Elucidating the mechanisms that control this cytoskeletal reorganization, as well as understanding how these cytoskeletal structures shape immune synapse formation and BCR signaling, can provide new insights into B cell activation. This has been aided by the development of super-resolution microscopy approaches that reveal new details of cytoskeletal network organization. We describe here a method for using stimulated emission depletion (STED) microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and transfected GFP-tagged microtubule plus-end binding proteins in B cells. To model the early events in immune synapse formation, we allow B cells to spread on coverslips coated with anti-immunoglobulin (anti-Ig) antibodies, which initiate BCR signaling and cytoskeleton remodeling. We provide step-by-step protocols for expressing GFP fusion proteins in A20 B-lymphoma cells, for anti-Ig-induced cell spreading, and for subsequent cell fixation, Immunostaining, image acquisition, and image deconvolution steps. The high-resolution images obtained using these procedures allow one to simultaneously visualize actin structures, microtubules, and the microtubule plus-end binding proteins that may link these two cytoskeletal networks.

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

We present a protocol for using STED microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and microtubule plus-end binding proteins in B cells that have spread on coverslips coated with antibodies to the B-cell receptor, a model for the initial phase of immune synapse formation.

Visualisierung der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der B-Zelle immun Synapse mit stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

Studium der Organelle-Dynamik in B-Zellen während der Immunsynapse-Bildung

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic fever and autoimmune diseases. Since thousands of antibodies with different epitopes are circulating in blood, no universal method, except for the dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF), was reported to target specific harmful antibodies. The development of DCAF molecules makes significant contribution to the progress of targeted therapy, which were demonstrated to eliminate the antibody dependent enhancement (ADE) effect in a Dengue virus (DENV) infection model and to boost the acetylcholine receptor activity in a myasthenia gravis model. Here, we describe a protocol for the synthesis of a DCAF molecule (DCAF1), which can selectively block 4G2 antibody to attenuate ADE effect during Dengue virus infection, and illustrate the binding of DCAF1 to 4G2 antibody by an ELISA assay. In our method, DCAF1 is synthesized by the conjugation of a hydrazine derivative of a Fc-III peptide and a recombinant expressed long &#945;-helix with antigenic sequence through native chemical ligation (NCL). This protocol has been successfully applied to DCAF1 as well as other DCAF molecules for targeting their cognate antibodies.

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) is novel for the elimination of harmful antibodies. Here, we describe a detailed protocol for the synthesis of DCAF1 molecule, which can selectively block 4G2 antibody to eliminate antibody dependent enhancement effect during Dengue virus infection.

Gezielte Antikörperblockierung durch ein dual-funktionales Konjugat von antigenem Peptid und Fc-III-Mimetik (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...