Es gibt viele, trugen zu dieser Arbeit und die meisten sind aus dem Caffrey Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group, beide in Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder. An alle, und vor allem Jingquan Tan und Joseph Lyons, erweitern wir unseren herzlichen Dank und Anerkennung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), den National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 und U54GM094599) und FP7 COST und Marie Curie Actions (CM0902 und PIEF-GA-2009 unterstützt -235.612).

Ein. Laboratory Set-up Pre-Ernte <ol><li> In Vorbereitung für die Ernte, füllen Sie die trockenen Schaum Dewar mit flüssigem Stickstoff und platzieren Sie es neben dem Mikroskop, wo der Ernte stattfinden. </li><li> Tauchen Sie den Speicher Puck, open end up, in den flüssigen Stickstoff in der Schaum-Dewar und lassen Sie es vollständig abkühlen. </li><li> Sichern Sie sich eine micro-mount von einer Größe, die den Kristall auf einem Magnetstab (Abbildung 5) geerntet werden übereinstimmt. Es ist wichtig, zur Hand haben, eine Reihe von Ersatz-Metalldetektorstäbe mit Mikro-Halterungen vorgespannt, um für Situationen gerecht, wo es notwendig, mehrere Kristalle aus der ein Bolus ernten ist. Spare Zauberstäbe sollte jederzeit verfügbar sein. </li><li> Legen Sie eine Mikropipette, Tipps und das Fällmittel Lösung, die für das Kristallwachstum neben dem Ernte-Mikroskop verwendet wurde. Es kann erforderlich sein, um den Mesophasen-decken und ein Austrocknen zu vermeiden, wenn das Bohrloch geöffnet wird. </li><li> Haben ein Notizbuch und Stift auf der Bank in der Nähe und / oderder Computer zu öffnen. Diese werden verwendet, um Beobachtungen in Bezug auf die Qualität, Aussehen, Standort, Lagerung Puck Nummer, etc., von Kristallen, wie sie geerntet werden, Kryo-gekühlt und eingelagert aufzuzeichnen. </li><li> Wenn ein Assistent zur Verfügung, um mit der Ernte muss die Person klar zu verstehen, das Protokoll, die befolgt werden wird, in welcher Reihenfolge die verschiedenen Schritte stattfinden wird, und ihre Rolle im gesamten Prozess zu helfen. </li></ol> Mit all den Materialien und Geräte an Ort und Stelle unsere nächste Aufgabe ist es: 2. Identifizieren Platten und Wells, die Kristalle enthalten <ol><li> Die einfachste und direkteste Methode zum Auffinden erntefähige Kristalle in die Vertiefungen von Hand mit einem Mikroskop mit normalen und mit gekreuzten polarisierten Lichts zu inspizieren. Einstellen der Beleuchtung Lichtintensität am Mikroskop kann mit Ortung Kristalle helfen. </li><li> Alternativ, überquerte ein Imager, wo Platten werden automatisch mit normalen gesiebt und polarisierend light, können verwendet werden, um Kristalle zu suchen. </li><li> Bewerten von Auge aufgenommenen digitalen Bilder auf einem Computer-Monitor. </li><li> Kennzeichnen Sie diese Brunnen mit Kristallen für die Ernte und aufzeichnen Kommentare zu der Größe, Qualität und Lage der Kristalle in der Mesophase im Notebook oder auf einem Computer. </li><li> Entfernen Sie die Platte mit Kristallen für die Ernte aus dem Imager. </li></ol> 3. Öffnen einer gut mit kubischen Mesophase. Methode 1 Die Platten, in denen Kristalle wachsen durch die in meso-Methode sind Glas Sandwichplatten (Abbildung 2). Um die Mesophase und die Kristalle darin zuzugreifen, ist es notwendig, die ebenfalls öffnen. Dies wird durch Verwendung eines Glases Schneidwerkzeug um das obere Deckglas dass Dichtungen der Brunnen, kann dann entfernt werden geschnitten getan. Es gibt mehrere Ansätze für das Schneiden und Entfernen des Abdeckglases von über einer Kristallisation gut. Das man verwenden wird durch die Art o diktiertf Mesophase, bei dem der Kristall wachsen gefunden. Dies kann der hochviskose und klebrige kubischer Phase (3A) oder dessen flüssiger Variante der Schwamm Phase (3B) liegen. In diesem Video Artikel zeigen wir, wie man Brunnen zu öffnen und Kristalle aus diesen beiden Hosting-Materialien zu ernten. <ol><li> Legen Sie das Glas-Sandwich Kristallisationsplatte auf der Bühne eines Lichtmikroskops. </li><li> Verwendung eines Glases Schneidwerkzeug Punktzahl das Deckglas leicht mit zwei konzentrischen Kreisen über dem Abstandhalter und etwas außerhalb des Umfangs des Bohrlochs befindet. Mit einem neuen Schneidwerkzeug benötigt Scoring minimal angelegten Druck. Ersetzen Sie das Werkzeug mit einem neuen, wenn der Druck benötigt, um Gäste sogar noch geringfügig erhöht, dies tritt in der Regel nach dem Öffnen 10 Brunnen. </li><li> Aufbrechen des Glases in dem Raum zwischen den beiden Kreisen hat zum Zwecke der Freigabe der inneren Deckglas. Dieser generiert viele Glasscherben und Staub. Löschen Sie sie weg mit einem angefeuchtetenPapiertuch. </li><li> Entfernen Sie die befreiten Deckglas durch Greifen sie mit einer feinen Spitze Pinzette und kippen weg von und aus dem Brunnen. In diesem Fall bleibt der kubischen Phase stecken und an die Stelle auf der Grundplatte des Bohrlochs. </li><li> Vergrößern, um ein klareres Bild der kubischen Mesophase, die nun bereit ist für den Einsatz in crystal Ernte zu bekommen. </li></ol> 4. Öffnen einer Well mit Cubic Mesophase. Methode 2 <ol><li> Verwendung des Glases Schneidwerkzeug Punktzahl geraden parallelen Linien in dem Deckglas auf einer Seite des Bohrlochs und daß sich über die auch selber. Dies ermöglicht eine einfachere Pinzette Zugang zu und Entfernen des Abdeckglases. </li></ol> In diesem besonderen Demonstration, die Risse Deckglas bei der Befreiung der Deckglas von der klebrigen Abstandshalteroberfläche. In dem Verfahren, verschiebt sich das Deckglas in Position und das Fällungsmittel getrennt von der kubischen Phase. Wenn das Deckglas angehoben wird ein Teil des Fällungsmittels mit ihm geht. Wir sind mit einer exponierten b linksOlus der Mesophase ohne umgebende Fällungsmittel. Unmittelbar, fügen Sie ein ul frischem Fällungsmittel auf der Oberseite des Bolus mit einer Mikropipette, um die Mesophase vor dem Austrocknen und eine Phasenänderung, die die Kristalle beschädigen könnten verhindern. Der Bolus ist nun bereit, in Kristall Ernte eingesetzt werden. 5. Öffnen einer Well mit Schwamm Phase. Vergeblich Der Schwamm Phase weniger vergebende mit wegen seiner Fähigkeit zum Fließen zu arbeiten. Wenn dass Strömung führt zu dem Schwamm Phase Kontaktieren des Umfangs des Bohrlochs Kapillarität wird Ausziehen der Mesophase und die Kristalle gehen verloren. Ein Beispiel für dieses Ereignis wird in diesem Videoclip gezeigt. <ol><li> Zoom in auf dem Schwamm Phase und hin-und herschalten zwischen normalen und gekreuzten polarisiertes Licht Kristalle in der Schwamm-Phase zu finden. </li><li> In Vorbereitung für das Öffnen der auch Gäste und schneiden Sie das Deckglas, wie in Abschnitt 3 beschrieben. In dem Prozess, die Risse Deckglas. Im VersuchIng. zum Öffnen der Brunnen die Fällungsmittel Verschiebungen in Richtung des Risses, und schließlich kommt es in Kontakt mit dem Abstandhalter. Das Fällungsmittel mit einigen der Schwamm-Phase und seiner Ladung von Kristallen, die verloren geht. </li></ol> In dieser speziellen Sequenz werden die Polarisatoren auf dem Mikroskop nicht vollständig überquert, und die Kristalle als helle Objekte zur gleichen Zeit gesehen werden, dass die gut und dessen Inhalt sichtbar bleiben. 6. Öffnen einer Well mit Schwamm Phase. Erfolgreich <ol><li> Vergrößern Sie die Schwamm-Phase und identifizieren einen Kristall sowohl in Normal-und gekreuzten polarisiertem Licht. </li><li> Ergebnis, schneiden und entfernen einen Abschnitt Deckglas abdecken die auch, wie in Abschnitt 4,1. Unvollständig gekreuzt polarisiertes Licht verwendet wird, den Überblick über den Kristall zu halten. </li><li> Einführung eines Stück trockenen Tissue-Papier durch die Öffnung in dem Deckglas und in das Bohrloch, bis es gerade berührt die Fällungsmittellösung. Docht entfernt die Lösung vorsichtigly, bis sie fast alle weg und entfernen Sie dann das Gewebe. Dies bewirkt, dass der verbleibende Fällungsmittel und Schwamm-Phase, mit dem Kristall noch vorhanden ist, um unter dem Deckglas zurückzuziehen. </li><li> Ergebnis, schneiden und entfernen Sie mit einer Pinzette der Rest der Deckglas, wie in Abschnitt 4,1. In diesem Fall spaltet der Schwamm Phase; einige Überreste in dem Bohrloch und einigen klebt am Deckglas. Der Kristall ist im Bolus am Deckglas. Weil es sehr wenig Fällungsmittel, beginnt die Phase, um ein Schwamm Phasenübergang wahrscheinlich durch Austrocknung unterziehen. Dies kann als ein Ring von Doppelbrechung, die in Richtung der Mitte des Bolus wandert gesehen werden. Unmittelbar Fällungsmittel hinzufügen Bolus, um den Übergang zu stoppen. Der Bolus ist nun bereit für den Einsatz in crystal Ernte. </li></ol> 7. Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle aus der Cubic Phase <ol><li> Gehe hin und her zwischen normal und gekreuzten polarisiertes Licht Kristalle in den kubischen Phase Bolus im Freien gut zu lokalisieren. In tseinen Videosequenz bis zu vier doppelbrechende Kristalle in den kubischen Phase Bolus mit gekreuzten polarisierten Licht gesehen werden. </li><li> Verwenden Sie einen montiert Kryo-Schleife (Abbildung 5), um die frisch freigelegten Mesophase für Kristalle untersuchen, zu fischen Kristallen und sie dann stürzen, enthalten in der Kryo-Schleife, in flüssigen Stickstoff im Dewar sofort nach der Ernte. Idealerweise sollte die Ernte-und Schnappbefestigung Kühlung in einem kontinuierlichen und schnellen Bewegung passieren. So wenig haftende Mesophase wie möglich mit dem Kristall geerntet werden. Nach unserer Erfahrung ist Cryo-Schutzmittel nicht mit in meso-gezüchteten Kristalle benötigt. </li><li> Da es nicht möglich, für den Kristall in der Kryo-Schleife aussehen sofort nach der Ernte zu inspizieren die Mesophase Bolus zum Ernten zu verifizieren, dass der Kristall nicht mehr vorhanden ist darauf hindeutet, dass es erfolgreich wurde geerntet verwendet. </li></ol> 8. Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle aus der Sponge Phase <ol><li> Gehe hin und her zwischen normal und gekreuzten polarisiertes Licht Kristalle in der Schwamm-Phase Bolus im Freien gut zu lokalisieren. In dieser Videosequenz vielen doppelbrechende Kristalle kann im Bolus unter gekreuzten polarisierten Licht gesehen werden. </li><li> Verwenden einer montierten Kryo-Schleife (Abbildung 5) heraus zu fischen Kristalle aus dem Schwamm und diese Phase einzutauchen, enthalten in oder auf dem cryoloop, in flüssigen Stickstoff im Dewar sofort nach der Ernte. Wie bei der Ernte im kubischen Phase, idealerweise sollte die Kryo-Kühlung sofort geschehen der Kristall mit so wenig Zeit wie möglich vergeht zwischen der tatsächlichen Ernte Veranstaltung und das Eintauchen in flüssigen Stickstoff geerntet wird. So wenig haftende Schwamm-Phase sollten möglichst mit dem Kristall geerntet werden. Wie angemerkt, wird Kryo-Schutzmittel nicht mit in meso-gezüchteten Kristalle erforderlich. </li></ol> 9. Speichern Crystals in Dewars <ol><li> Nachdem stürzte die montiert Schleife in flüssigen nitrogen platzieren es in einem der Halteschlitze des Speichermediums Puck im Schaum Dewar. Alle Manipulationen mit der Schleife fertig sind, die Oberseite des magnetischen Zauberstab und den Puck in flüssigen Stickstoff eingetaucht. </li><li> Notieren Sie den Speicherort und die Einzelheiten der geernteten und Kryo-gekühlten Kristall im Notebook und / oder auf dem Computer. </li><li> Wenn der Puck im Schaum Dewar voll oder Ernten für den Tag Transfer der Puck in einer ad acta Puck Halter in einer Lagerung oder einem Transport Dewar abgeschlossen ist gefüllt mit flüssigem Stickstoff. Kristalle können in Verkehr Dewars der Synchrotron-Anlage für die Beugung der Datenerhebung versendet werden. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse Die Ziele der Ernte und Kryo-Kühlung Übungen zu zeigen hier, um einen Kristall aus dem Hosting Mesophase in Kryo-Schleifen zu übertragen, um die Loop-Kristall verglasen und es bei der Lagerung in flüssigem Stickstoff in einem Dewar. Die ideale Situation ist, wo die Ernte und cryo-Kühlung sind in der Weise, dass die Beugung Qualität des Kristalls in dem Prozess erhalten wird getan. So wenig Mesophase wie möglich mit dem Kristall geerntet werden. Dies ist, um den Kristall Anordnen und Zentrieren in der Röntgenstrahl, dass viel weniger anspruchsvoll, um Kryo-Kühlung im Hinblick auf die Beschleunigung der Verglasung sowie zur Minimierung störender Tonerflecken aus dem Mesophasen während Beugungsdaten angesehen. Einige Beispiele von Kryo-gekühlten Proben bei der das Glas nicht und kann gesehen werden, sind in 6 gezeigt. Wobei der Kristall nicht von Auge erkennbar ist es normalerweise notwendig, um Beugungseffekte Rasterung greifen, um den Kristall zu finden und zu zentrieren im Strahlengang für die Datensammlung 27. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung einer biologischen Membran, die die Lipid-Doppelschicht in und auf welchem ​​are liegt eine Vielzahl von Proteinen. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Ein voll beladen und verschlossen 96-well Glas-Sandwich Kristallisationsplatte. Jede Vertiefung enthält 50 nl kubischen Phase und 1 ul Fällmittellösung. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die kubische Phase mit dem Sudan Red angefärbt und die Fällmittellösung enthält Methylenblau. Von Reference 5. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Kristalle von Membranproteinen wächst in den Lipid-Mesophase. A. Die kubischen Phase mit einem Kristall von Bakteriorhodopsin aus H. halobium. B. Der Schwamm Phase, die einen Kristall des Vitamin-B12-Rezeptor / Transporter, btuB von E. coli. Von Reference 25. Die kubischen und Schwamm Phasen kontrastierenden Erscheirances wie durch den Vergleich Platten A offensichtlich und B. Die kubische Phase in A ist extrem zähflüssig und behält seine ursprüngliche Form zurück. Es fließt nicht. Dies zeigt sich insbesondere an den Rändern der Mesophase Bolus, die eine aufgerauhte Aussehen haben. Mit Vertrag ist das Schwamm-Phase deutlich weniger viskos und nicht fließt. Somit scheitert die Schwamm-Phase zu seiner ursprünglichen Form zu halten und seine Ränder sind charakteristischerweise glatt. Fällungsmitteln, die Jeffamine umfassen, PEG 400, 2-Methyl-2 ,4-Pentandiol, Pentaerythrit Propoxylat, Butandiol und Hexandiol, kann bei einem Übergang von der kubischen Phase auf den Schwamm 4,26 führen. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Das Flussdiagramm fasst die Schritte bei der Herstellung, Ernte und Kryo-Kühlung in meso-grown Membranprotein Kristalle (A) involviert. Nur diese Schritte durch die gestrichelte rote umgebenLeitung, und im Detail beschrieben in (B), werden in diesem JoVE Artikel behandelt. Panel A ist von Reference 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Eine leere Kryo-Loop montiert auf einem Stift, der an Ort und Stelle auf einem Magnetstab gehalten wird. Expanded Ansichten des Stiftes (A) und Mikro-Halterung (B) dieser wichtigen Werkzeug für die Ernte und Kryo-Kühlung gezeigt. Der leere Schlaufe am Ende des Mikro-mount in B ist 30 um im Durchmesser. Während nachdem keine anderen Loop-Typen ausgiebig getestet, so finden wir, dass die MiTeGen gezeigten Arbeiten Schleifen auch mit den beiden kubischen und Schwamm Phasen. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Harvested und Kryo-gekühlten Kristalle von Membranproteinen in Kryo-Schleifen, mit einem In-Line-Mikroskop auf einem Synchrotron Beamline angesehen. A, b. Beispiele geerntet Kristalle (Caa3 Cytochromoxidase 34 (A), Diacylglycerin Kinase, DgkA (B)), wobei die Kristalle (blauer Pfeil) sind durch die Kryo-gekühlten Mesophase auf einer Kryo-Schleife. C. Beispiel, wo das geerntete Kristall nicht in der Kryo-gekühlten Mesophase auf einer Kryo-Schleife sichtbar. Die Spitze der Schleife ist mit einem roten Pfeil gekennzeichnet. Die anhaftende Kryo-gekühlten Mesophase mit einem blauen Pfeil gekennzeichnet.

<ol>
	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination:+use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structure+determination+using+crystallography+and+lipidic+mesophases+-+recent+advances+and+successes.">Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes.</a> Biochemistry. , (2012).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li><li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor.">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li><li>Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+dopamine+D3+receptor+in+complex+with+a+D2/D3+selective+antagonist.">Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist.</a> Science. 330, 1091-1095 (2010).</li><li>Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+delta-opioid+receptor+bound+to+naltrindole.">Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole.</a> Nature. 485, 400-404 (2012).</li><li>Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+M2+muscarinic+acetylcholine+receptor+bound+to+an+antagonist.">Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist.</a> Nature. 482, 547-551 (2012).</li><li>Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335, 851-855 (2012).</li><li>Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2.6+angstrom+crystal+structure+of+a+human+A2A+adenosine+receptor+bound+to+an+antagonist.">The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist.</a> Science. 322, 1211-1217 (2008).</li><li>Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor.">Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor.</a> Nature. 482, 552-556 (2012).</li><li>Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+micro-opioid+receptor+bound+to+a+morphinan+antagonist.">Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist.</a> Nature. 485, 321-326 (2012).</li><li>Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta(2)+adrenoceptor.">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469, 175-180 (2011).</li><li>Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal++structure+of+the+&#946;2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex.">Crystal structure of the &#946;2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li><li>Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+engineering+yields+high-resolution+structural+insights+into+beta2-adrenergic+receptor+function.">GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function.</a> Science. 318, 1266-1273 (2007).</li><li>Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+an+irreversible+agonist-beta(2)+adrenoceptor+complex.">Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex.</a> Nature. 469, 236-240 (2011).</li><li>Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+histamine+H1+receptor+complex+with+doxepin.">Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin.</a> Nature. 475, 65-70 (2011).</li><li>Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+nociceptin/orphanin+FQ+receptor+in+complex+with+a+peptide+mimetic.">Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic.</a> Nature. 485, 395-399 (2012).</li><li>Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+CXCR4+Chemokine+GPCR+with+Small-Molecule+and+Cyclic+Peptide+Antagonists.">Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li><li>Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic.">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li><li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs,+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets.">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li><li>W&#246;hri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization.">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron.">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipid's+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases.">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li><li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein/water+system.">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization.">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases.">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712 (2010).</li><li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase.">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000 (2012).</li><li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa(3)-type+cytochrome+oxidase.">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Video Artikels wir demonstriert, wie Kristalle in einer lipidischen Mesophase wachsen geerntet und in Vorbereitung für die Verwendung in Beugung Datenerhebung und letztlich zur Strukturbestimmung Kryo-abgekühlt. Die Hosting-Mesophase kann der viskosen und klebrigen kubischen Phase oder mehr Flüssigkeit Schwamm-Phase 4 sein. Wie die Glas-Sandwich-Platten sind geöffnet und wie die Kristalle sehr viel geerntet hängt Mesophase Typ. Es ist daher wichtig zu wissen, welche der beiden ein mit sich vor der Zeit. Die Identität des Hosting-Lipid-und Fällungsmittel verwendet werden, sind in diesem Zusammenhang wichtig, und die physische Erscheinung der Mesophase Bolus bei der Kristallisation auch verwendet werden, um sie auseinander zu werden (Abbildung 3). Ernte von beiden Mesophase Typen wurde in diesem Artikel dargestellt. Harvesting kleine Kristalle aus einer Lipid-Mesophase in Glas-Sandwich-Platten ist ein mühsamer Prozess, der Zeit, Geschicklichkeit, exper benötigtience, Geduld und eine ruhige Hand. Es ist wichtig, beiseite stellen eine angemessene Menge an Zeit für die Ernte und die Einrichtung des Labors, so dass alle Versorgungsgüter und Ausrüstungsgegenstände zur Hand sind im Voraus. Eine zweite Person, die bei der Ernte zu helfen ist nicht unbedingt erforderlich, wird aber empfohlen. Diese Person kann mit der Lieferung vormarkierten Platten auf den einzelnen zu tun, die Ernte sowie Platzierung Kryo-gekühlten montiert Schleifen mit geernteten Kristalle in den Speicher Puck helfen. Der Assistent kann auch eine wichtige unterstützende Rolle bei der Dokumentation von Beobachtungen über die Kristalle während der Ernte das könnte entscheidend sein bei der Beugung der Datenerhebung gemacht. In Abwesenheit eines Helfers konnte ein sprachgesteuertes Audio-Aufzeichnungsvorrichtung, die Vorteile für die Dokumentation verwendet werden. Nach dem Protokoll in diesem Artikel beschrieben wird Ihnen helfen, den Viewer und läuft mit Kristall Ernte. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, dass das Verfahren nicht einfach und daß practice wird vor dem Start in die Ernte wertvolle Membranprotein Kristalle benötigt. Es wird daher Testplatten mit Kristallen von Proteinen, die nicht besonders wertvoll sind mit ersten experimentiert werden empfohlen. Dadurch wird die neophyte wertvolle Erfahrung Schneiden von Glas bereitzustellen, Entfernen Glasscherben, Anheben des Abdeckglases von über der Mesophase, unter Verwendung der polarisierenden Funktion auf dem Mikroskop, um Kristalle zu sehen und sie während des Erntens zu verfolgen, und schließlich die Handhabung der verschiedenen Arten von Mesophasen und Ernte von ihnen. Die Textur der Mesophase, und durch Erweiterung der Leichtigkeit, mit welcher sich Kristalle geerntet werden können, ändert sich mit der Zeit während der Kristallisation. Es ist daher wichtig zu üben Ernte mit weniger wertvolle Kristalle, sondern mit denen, die unter den gleichen Bedingungen wie die weitere wertvollsten gewachsen. Es ist möglich, Kristalle von Lysozym und Thaumatin durch die in meso-oder lipidische kubischen Phase Methode 28 wachsen und diese sollten consid werdenEred mittels gewinnt sich mit den Materialien und dem Verfahren. Man sollte auch bedenken das Arbeiten mit Protein-freie Mesophase erste seiner Launen zu lernen. Die Verfahren nachgewiesen hier wurden alle bei einer komfortablen 20 ° C oder ungefähr getan. Es ist möglich, Kristalle durch die im meso Verfahren wachsen bei niedrigeren Temperaturen. Somit kann Monoolein als Hosting Lipid in einer metastabilen Phase Zustand bei 4 ° C 1,2,29,30 verwendet werden. Eine Alternative besteht darin, die rational entworfen 7,9 MAG für Tieftemperaturkristallisation 31 verwenden. Wir tun niedrigen Temperaturen crysallogenesis routinemäßig mit bestimmten Membranprotein Ziele. In diesem Fall wird das Kristallwachstum und die Ernte in einem begehbaren in 4 ° C Kühlschrank getan. Arbeiten unter solchen Bedingungen hat ihre eigenen Herausforderungen nicht zuletzt von denen die Notwendigkeit für einen warmen und bequeme Kleidung ist. Der nächste Schritt im gesamten Prozess der Strukturaufklärung mit makromolekularen crystallography ist Beugungsdaten auf Kristalle geerntet und Snap-gekühlt in diesem Artikel gezeigt sammeln. In meso-grown-Kristallen sind in der Regel klein. Allerdings hat nützlich Beugung Datensammlung gewesen mit Kristallen mit einer maximalen Abmessung von 20 um 9 möglich. Zu diesem Zweck wird micro-beam Synchrotron-Strahlung und ist der Mittelpunkt eines separaten JoVE Artikel dieser Serie 32,33.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Komponenten </td></tr><tr><td> Gebogene Pinzette </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Pipettenspitzen </td><td> Gilson </td><td> Verschiedene </td><td> Wegwerf- </td></tr><tr><td> Foam Dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Glas und Metall Abfallbehälter </td><td> Daniels Healthcare </td><td> DD479OL </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Harvesting Schleifen </td><td> MiTeGen </td><td> Verschiedene </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Harvesting-Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Lab Notebook </td><td> Verschiedene </td><td> NA </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Magnetic PushButton Probenbeladung Zauberstab </td><td> Hampton Research / Molecular Dimensions </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Original Puck (für die Verwendung mit ALS-Stil Roboter nur) </td><td> Kristall Positioning Systems </td><td> CP-111 bis 035 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Pipettiervorrichtungen </td><td> Gilson </td><td> Verschiedene </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Fällungsmittel Lösungen </td><td> Verschiedene </td><td> Verschiedene </td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Kristall Positioning Systems </td><td> CP-111 bis 030 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Puck Etagenwagen Versandkosten Cane (original ALS-Stil) mit Haken Griff und Verriegelungsstange </td><td> Kristall Positioning Systems </td><td> CP-111 bis 029 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Gereinigtes Wasser </td><td> Millipore </td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Schutzbrille </td><td&gt; Various </td><td> NA </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Beispiel Pin Bases - Magnetic (non-Kupfer) </td><td> Kristall Positioning Systems </td><td> CP-111 bis 015 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Liefer-Dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Tissues </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Wegwerf- </td></tr><tr><td> Hartmetall-Glasschneider (TCT Reißnadel) </td><td> Silverline Tools (Yeovil, UK) </td><td> 633657 </td><td> Werkzeug </td></tr></tbody></table>

harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography

Ein wichtiger Weg zum Verständnis, wie Proteine ​​bei einer mechanistischen Ebene funktionieren, ist die Struktur des Zielproteins zur Verfügung zu haben, idealerweise mit atomarer Auflösung. Gegenwärtig gibt es nur einen Weg, solche Informationen zu erfassen, um integrale Membranproteine ​​(Abbildung 1), und die Komplexe bilden sie aufgebracht wird, und diese Methode ist makromolekularen Röntgenkristallographie (MX). Tun MX Beugungsqualität Kristalle nötig sind, im Fall von Membranproteinen, nicht leicht zu bilden. Ein Verfahren zur Kristallisation von Membranproteinen, die die Verwendung von lipidischen Mesophasen, speziell die kubischen Phasen 1-5 und Schwamm, beinhaltet hat erhebliche Aufmerksamkeit der späten Aufgrund der Erfolge in der G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Feld 6-21 gehabt hat gewonnen ( <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). Jedoch ist das Verfahren, fortan als die in Meso-oder Lipid-kubischen Phase-Verfahren bezeichnet, kommt mit seiner eigenen technischenHerausforderungen. Diese ergeben sich zum Teil aufgrund der im Allgemeinen viskosen und klebrigen Natur der lipidischen Mesophase bei dem die Kristalle, die oft Mikrokristalle, wachsen. Manipulation Kristallen wird schwierig als Ergebnis und besonders so bei der Ernte 22,23. Probleme ergeben sich auch bei dem Schritt, das Ernten der verlangt, dass die Glas-Sandwich-Platten, in der die Kristalle wachsen (Abbildung 2) 24,25 geöffnet werden, um den Mesophasen-Bolus freizulegen vorangeht, und die Kristalle darin zum Ernten, Kryo-Kühlung und späteren X Röntgenbeugung Datensammlung. Die kubischen und Schwamm Mesophase-Varianten (Abbildung 3), von der Kristalle gewonnen werden muss tief verschieden Rheologien 4,26. Die kubische Phase ist zähflüssig und klebrig ähnlich einem dicken Zahnpasta. Im Gegensatz dazu ist der Schwamm Phase mehr Flüssigkeit mit ausgeprägter Neigung zur Strömungsrichtung. Dementsprechend werden verschiedene Ansätze für die Öffnung der Kristallisation Brunnen containing Kristalle wachsen in der kubischen und der Schwamm-Phase werden als tatsächlich verschiedene Methoden zur Gewinnung von Kristallen aus den beiden Mesophase Typen erforderlich bezeichnet. Protokolle für genau das zu tun verfeinert worden sind und in der Membrane Strukturelle und Funktionelle Biologie (MS &amp; FB)-Gruppe implementiert und werden im Detail in diesem JoVE Artikel (Abbildung 4) beschrieben. Beispiele sind Situationen, in denen Kristalle erfolgreich geerntet und Kryo-abgekühlt gegeben. Wir bieten auch Beispiele von Fällen, in denen Probleme auftreten sollten, die die unwiederbringlichen Verlust von Kristallen und beschreiben, wie diese Probleme vermieden werden können. In diesem Artikel wird der Betrachter mit Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Öffnung der Glas-Sandwich Kristallisation Brunnen, für die Ernte und für Kryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen wächst in kubischer und Schwamm Phasen vorgesehen.

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography at JoVE.co

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Hierin wird Verfahren im Caffrey Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group zu ernten und Kryo-cool Membranprotein Kristalle in Lipid kubische und Schwamm Phasen für den Einsatz in der Struktur-Bestimmung mit makromolekularen Röntgenkristallographie gewachsen implementiert beschrieben.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K Aufrufe.  Trinity College Dublin. Hierin wird Verfahren im Caffrey Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group zu ernten und Kryo-cool Membranprotein Kristalle in Lipid kubische und Schwamm Phasen für den Einsatz in der Struktur-Bestimmung mit makromolekularen Röntgenkristallographie gewachsen implementiert beschrieben.

Serie: Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Forschung

Biologie

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.