1. Cell Preparation und Seeding auf Mikrostrukturen <ol><li> Platz 2 CYTOOchips in 2 unabhängige Vertiefungen einer 6-Well Platte sicherzustellen, dass Sie &quot;CYTOO&quot; in der unteren rechten Ecke des CYTOOchip lesen. Mikrostrukturen können fluoreszierend mit Cy3 oder Cy5 Farbstoffen markiert werden. CYTOOChips für dieses Experiment verwendet haben Cy3 Fluoreszenz Mikrostrukturen bezeichnet. ACHTUNG: Halten Sie Chips in der Dunkelheit. </li><li> Sammeln HeLa-Zellen (~ 80% konfluent) durch Trypsinierung. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass die Zellen richtig durch die Trypsin-Behandlung verteilt. Sammeln und Zentrifuge Zellen bei 300g für 4 min, dann vorsichtig Zellpellet. Zählen von Zellen und verdünnt auf eine Konzentration von 15.000 Zellen / ml in abgeschlossenen DMEM/F12 Kulturmedien. </li><li> Dispense 4 mL (60.000 Zellen) in jedes Well mit einer CYTOOchip. ACHTUNG: Die Platte sollte so wenig wie möglich bewegt werden, um zu vermeiden Induktion einer rotierenden Bewegungen in das Medium als dies dazu, um Zellen in der Mitte zu konzentrieren. </li><li> Lassen Sie die Zellen Sediment für 10 min unter der Haube dann verschieben Sie sie in die Zelle Inkubator. Nach 10-20 min werden die Zellen beginnen, um die Mikrostrukturen haften. Nach 10 min, regelmäßig zu überprüfen, unter dem Mikroskop. </li><li> Sobald Zellen angebracht, ändern Sie die Zell-Medium und vorsichtig spülen Deckglas Oberfläche mit dem folgenden Verfahren: </li><li> Keeping die Platte flach, leicht absaugen das Medium mit einer Pipette von der Seite des Brunnens. ACHTUNG: Lassen Sie niemals den Chip austrocknen, bedeutet dies nicht absaugen alle Flüssigkeit, aber lassen genug, um die CYTOOchip jederzeit zu decken. </li><li> 4 mL PBS und saugen zunächst wieder ab der Mitte des Chips gehen dann zu der Seite des Brunnens. Absaugen der PBS als ohne den Chip an der Luft beschrieben. Wiederholen Sie 3-4 mal. </li><li> Überprüfen Sie unter dem Mikroskop für schwimmende Zellen: <ul><li> Wenn eine große Anzahl von schwimmenden Zellen bleiben, wiederholen Sie den Waschvorgang. </li><li> Wenn Sie sehr wenige Zellen zu sehen, absaugen Teil der PBS und ersetzen Sie es mit 2 mL frisches Medium. Absaugen und 4 ml frisches Medium zweimal. </li></ul></li><li> Die Platte wird in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für ein Minimum von 3 Stunden zu erlauben Zellen in voller Ausbreitung zu erreichen. HINWEIS: Mit dieser Methode zwischen 10-30% (2000 bis 6500) Mikrostrukturen durch eine einzelne oder mehrere Zellen belegt werden. ACHTUNG: Die benötigte Zeit für die Zellen vor dem Waschschritt und die Zeit für die vollständige Ausbreitung von Zellen auf Mikrostrukturen werden spezifisch für jede Zelllinie benötigt einhalten. </li></ol> 2. Blebbistatin Behandlung <ol><li> Lösen Sie die blebbistatin in 100% DMSO zu einer Stammlösung von 17 mM zu erhalten. Stammlösung weiter auf 5 mM mit 100% DMSO. Machen Sie eine Endverdünnung in Kulturmedium in einer Endkonzentration von 5 uM blebbistatin in 0,1% DMSO erhalten. </li><li> Zur Kontrolle Bedingungen vorzubereiten 4 ml Medium mit 0,1% DMSO nur. </li><li> Saugen Sie das Medium, auf Zellen und ersetzen sie durch die 4 ml Medium für Behandlungs-und Kontrollgruppe Bedingungen hergestellt. </li><li> Inkubieren Zellen für 1 Stunde bei 37 ° C. </li></ol> 3. Zell-Fixierung und Färbung von Actin <ol><li> Zubereitung der Lösung für die Zell-Fixierung Bitte beachten Sie Reagenz Abschnitt für die Herstellung von Zytoskelett-Puffer (CB) und PFA 5%. CB ist besonders für Fluoreszenz-Markierung von Aktin-Filamenten und Mikrotubuli empfohlen. <ul><li> Bereiten 1xCB-Saccharose: add 1 g Saccharose zu 2 ml CB. Aufnahme von Saccharose schont internen Zellstrukturen. </li><li> Bereiten Sie 4% PFA-CB-Saccharose: 1 mL 1xCB-Saccharose zu 4 ml warmes PFA 5%. ACHTUNG: Diese Lösung kann bei 4 ° C aufbewahrt werden für ein paar Tage nur. </li></ul></li><li> PFA Fixierung <ul><li> Verwenden einer Pinzette abholen CYTOOchip auf der CYTOO Logo und platziere sie (ohne Waschen) in eine Vertiefung einer 6-well-Platte mit 2 ml 4% PFA-CB-Saccharose-Lösung </li><li> Inkubieren 10 min bei RT </li><li> Entfernen PFA-CB-Saccharose und waschen einmal mit PBS </li><li> Haben ein zweites Waschen mit 2 ml 100 mM NH 4 Cl für 10 min, um restliche PFA Vernetzung Aktivität löschen HINWEIS: PFA fixiert Dias können in PBS für mehrere Tage bei 4 ° C vor Organelle Färbung für Fluoreszenz-Imaging gespeichert werden. </li></ul></li><li> Permeabilisierung der Zellmembran mit Triton X-100 Permeabilisierung der Zellen mit Waschmittel können Antikörper oder andere Sonden, die Zellmembran zu durchdringen und beseitigt einige der cytosolischen Pool von Cytoskelett-Proteinen, die sonst zu reduzieren kann der Kontrast des Zytoskeletts Polymeren macht es schwierig, ihre Lokalisation zu analysieren. <ul><li> Entfernen NH 4 Cl und 2 mL / well von 0,1% Triton X-100-CB 3 min bei RT </li><li> Zweimal waschen mit 2 mL PBS </li></ul></li><li> Aktinfärbung Fluorescent-Phalloidin, dieh bindet an nativen Aktin nur verwendet werden, um Aktinfilamente Fleck. <ul><li> 2 ml des FITC-konjugierten Phalloidin verdünnt 1:2000 in PBS mit 1,5% BSA </li><li> Inkubieren 1 h bei RT </li><li> Wash einmal mit 2 mL PBS </li></ul></li><li> Kerne Färbung <ul><li> Geben Sie 2 ml Hoechst (Fleck mit 1 g / mL in PBS) </li><li> Inkubieren 3 min bei RT </li><li> Wash 2 mal mit 2 ml PBS </li></ul></li><li> Montage der Folie <ul><li> Nehmen Sie den CYTOOchips auf der CYTOO Logo und montieren CYTOOchip auf einem Standard-Mikroskop-Objektträger mit 25-30 ul von Mowiol oder sonstige Montage-Lösung. </li></ul></li></ol> 4. Mikroskop-Setup und Automated Image Acquisition Zahlreiche Imaging-Software-Pakete gibt, die Steuerung des Mikroskops für eine schnelle automatisierte Bildaufnahme und Anzeige. In diesem Beispiel wird Metamorph Imaging-Software und automatische Übernahmen sind auf einem Nikon Eclipse Ti-Mikroskop mit einer CCD-Kamera und einem Hamamatsu Intensilight Quecksilber-Faser-Hilfslicht ausgestattet war. Bilder werden mit 20-facher Vergrößerung in drei Wellenlängen entsprechenden DAPI (Kernen), Cy-3 (Mikrostrukturen) und FITC-Phalloidin (Aktin) erworben. Die Zahl der Mikrostrukturen visualisiert pro Feld ist abhängig von der Kamera und Ziel-Setups. CYTOO Mikrostrukturen werden in festgelegten Intervallen von einander (100 oder 130 um) auf dem Chip erheblich erleichtern Akquisition positioniert. <ol><li> Wählen Sie 20-facher Vergrößerung </li><li> Öffnen Mehrdimensionale Bildaufnahme (in der Menüleiste: Apps / Mehrdimensionale Bildaufnahme) und richten Sie die verschiedenen Parameter des Experiments: <ul><li> Anzahl der Wellenlängen: 3 </li><li> Wavelength-Typen: DAPI, FITC, Cy3 </li><li> Set Belichtungszeit für jede Wellenlänge, indem Sie zunächst mit Schwerpunkt auf einem Feld von Zellen </li><li> Autofokus kann auf jeder Wellenlänge durchgeführt werden </li><li> Wählen Sie, wo die Daten zu speichern </li></ul></li><li> Wählen Cy3 Wellenlänge und Position der Kamera so, dass 12 Mikrostrukturen visualisiert und zentriert in der Kamera Feld (4 Spalten und 3 Reihen von Mustern) sind. </li><li> Erstellen Sie eine Zeitschrift läuft Mehrdimensionale Bildaufnahme. Das Verfahren zum Erstellen einer Zeitschrift ist in Abbildung 1 beschrieben. </li><li> Offene Bühne Scan-Funktion (in der Menüleiste: Geräte / Bühne / Scan Stage). Zum Erwerb 24 Bilder je 12 Mikrostrukturen bei 20-facher Vergrößerung, geben Sie 6 Spalten und 4 Zeilen mit -400 um X Schrittweite und 300 um Y-Schrittweite. In Set Journal to Execute, laden Sie die Zeitschrift MDA.JNL. Dann drücken Sie Scan, um die automatisierte Übernahme der gesamten Block in den drei Wellenlängen zu starten. HINWEIS: Die X-und Y-Schrittweite hier angegebenen werden nach der Anzahl der Mikrostrukturen in einem Kamera-Bereich variieren. Abhängig von Ihrer Bühne einzurichten, Richtung in X-und / oder Y negative Werte für Bewegung in die richtige Richtung erfordern. </li></ol> 5. Automatisierte Bildverarbeitung und-analyse Viele Bildbearbeitungs-und Analyse-Software-Pakete gibt. Die nachfolgend beschriebenen Verfahren skizzieren Bildverarbeitung und-analyse Schritten von 2 maßgeschneiderte Makros für die Open-Source-Programm ImageJ geschrieben durchgeführt. Das erste Makro CellRef schafft eine Referenzzelle, die zweite Hypotenuse Maßnahmen Steifigkeit / Zusammenbruch der Zellmembran. Beide sind auf Anfrage erhältlich durch <a href="www.cytoo.com">www.cytoo.com</a> . <ol><li> Neues Bild-Stacks für alle drei Kanäle auf Mikrostrukturen (Makro CellRef) zentriert. Verwendung von Mikrostrukturen vermeidet Zelle Clustering und Verklumpung, stark vereinfacht den ersten Schritt in der automatisierten Bildverarbeitung, die Lokalisierung und Segmentierung der einzelnen Zellen ist. Die fluoreszenzmarkierten Mikrostruktur Bilder werden verwendet, um zu definieren und abzugrenzen Regionen auf der Mikrostrukturen zentriert. Diese Regionen werden dann auf die Bilder in andere Kanäle erworben umgesetzt und beschnitten. Entsprechende beschnittene Bilder werden dann in Stapel für jede Wellenlänge zusammengesetzt. Ein RGB-Stack ist auch aus der Zusammenführung der drei Kanäle (Abbildung 2) erstellt. </li><li> Übernehmen einzelne Zelle Auswahlfilter (Makro CellRef) Wie bereits erwähnt, sind 10-30% (2000 bis 6500) der Mikrostrukturen durch eine einzelne Zelle oder mehrere Zellen besetzt, während die übrigen Mikrostrukturen leer sind. Sie können die Bilder, die Mikrostrukturen von nur einer einzigen Zelle besetzt zeigen, erkennt das Makro die Anzahl der Kerne pro Bild und eliminiert aus allen Stacks (RGB und verschiedene Wellenlängen) solche mit mehr als einem Kern oder gar keine Kerne (Abb. 3). </li><li> Beseitigen Sie nicht normierten und Zellen, die nicht vollständig über die Mikrostruktur gestreckt mit Zellfläche cut-off Filter (Makro CellRef) So entfernen Sie sich teilenden Zellen, dass die Kerne Filter entgangen wäre, einen anderen Filter mit dem FITC-Kanal für Aktin angewendet wird. Zellfläche berechnet und diese unter einen bestimmten abgeschnitten (Zellbereiche etwa 2-mal weniger als Interphase Zellfläche) sind von allen Stapel entfernt. Die Zellhülle Bereich wird durch die Größe des Musters bestimmt. </li><li&gt; Align Zelle Bilder (Makro CellRef) Von den vorherigen Schritten wurden Bilder mit einzelnen mikrostrukturierten Zellen ausgewählt. Auch wenn diese Bilder auf Mikrostrukturen zentriert sind, werden sie niemals alle perfekt aufeinander abgestimmt. Zum Abschluss der Bildverarbeitung, ein ImageJ-Plugin (MultiStackReg) wird angewandt, um alle gesammelten Bilder und alle Kanäle auf die Mikrostruktur Position basiert auszurichten. Dieser Schritt erzeugt ausgerichtet Stapel von einzelnen Bildern, die nun für einzelne Zelle Analyse oder Schaffung einer Referenz Cell (Abbildung 4) verwendet werden können </li><li> Der Aufbau eines Referenz-Cell (Makro CellRef) Wachsende Zellen auf Mikrostrukturen bedeutet, dass alle Zellen ähnliche Formen haben. Diese Normierung erlaubt eine präzise Ausrichtung und Überlagerung von vielen Zell-Bilder. Zusammenfassend das Signal in jedem Bild über den gesamten Stapel ermöglicht es, zu visualisieren und zu messen eine &quot;durchschnittliche Drogen-Effekt&quot;. Die endgültige Gesamtbild oder Reference Cell ist ein einzigartiges und nützliches Werkzeug für die Darstellung und Bildanalyse und kann nur mit mikrostrukturierten Zellen (Abbildung 4) bezogen werden. In ImageJ, die Referenzzelle wird, indem eine Projektion des gefilterten und ausgerichtet Bilder aus einem Stapel aufgebaut (Bild&gt; Stacks&gt; Z-Projekt). Mehrere Projektion Methoden wie beispielsweise die durchschnittliche oder maximale Intensität aufgetragen werden aber in der Regel eine mittlere Projektion gewählt wird, die beseitigt wichtigsten Ausreißer des Bildes Stapel. Zur Erleichterung der Prüfung der Ergebnisse ist eine LUT (Look Up Tables) Umwandlung der einfarbigen Bild in eine farbcodierte Frequenz Karte angewendet. </li><li> Messung und Quantifizierung von Parametern von Interesse (Makro Hypotenuse) In diesem Video-Artikel sind L-Mikrostrukturen verwendet, weil die Form organisiert das Aktin-Zytoskelett in einen einzigen großen Stress Faser. Durch die Hervorhebung Aktin auf diese Weise kann blebbistatin die Auswirkungen auf das Zytoskelett in vielen Arten bestimmt werden: die Messung von Veränderungen in der Krümmung des Aktin-Stress-Faser, Färbeintensität, Länge oder Dicke des Stress-Faser, Änderungen in morphometrische Merkmale des Aktin-Filamenten oder Zellform etc. Diese Parameter können entweder auf einzelne Zelle Bilder oder auf die letzte Referenz Zelle selbst gemessen werden. Hier wurde der Einfluss von 5 uM blebbistatin durch Zählen der Anzahl der eingestürzten Zellen mit einem zweiten ImageJ Makro namens Hypotenuse (Abbildung 7) charakterisiert. Kurz gesagt, werden Schwellenwert Bilder der L-Mikrostruktur verwendet werden, um eine theoretische Hypotenuse der Zelle Dreiecksform zu definieren. Als nächstes wird Schwellenwert des Aktin gefärbt Bildern durchgeführt, um annähernd den tatsächlichen Zellform. Der Bereich zwischen der theoretischen Hypotenuse der Zelle Dreieck und dem tatsächlichen konkave Zellmembran wird dann gemessen. Wenn die Zelle zusammengebrochen ist, wird ein Bereich unterhalb des theoretischen Hypotenuse. Der Anteil der kollabierte Zellen genutzt, um Kontrolle zu vergleichen und behandelt Bedingungen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Beispiele von dem, was Zellen möchte auf Mikrostrukturen sofort schauen und mehrere Stunden nach der kritischen Waschschritten in 1,6 bis 1,8 beschrieben werden, sind in Abbildung 5 dargestellt. Nach 15 min auf CYTOOchips, sind rund HeLa-Zellen in gleichen Abständen darauf hinweist, dass sie auf die Fibronektin Mikrostrukturen (Abbildung 5a) eingehalten beobachtet. Die Haftung ist abgeschlossen, wenn die Zellen immobilisiert trotz leichtem Schütteln des Kulturgefäßes bleiben. Zur Minimierung der Anzahl der Mikrostrukturen von mehreren Zellen besetzt sind Chips dann mit PBS gespült, um Zellen schweben über dem cytophobic Bereichen zu entfernen. Nach mehreren Stunden werden die Zellen, die vollständig über die Mikrostrukturen sind gespannt, wie sie in Abb. 5b gezeigt aussehen. Typische einzelne Zelle Bilder nach Inkubation von Zellen mit blebbistatin, Fixierung und Färbung von Aktin und Kerne sind in Abbildung 6 dargestellt. Nach automatisierte Übernahme von mehreren Bildern und Bildverarbeitung mit dem ImageJ CellRef Makro ist eine farbcodierte Frequenz Karte generiert, zeigt die Intensität der Aktin gemittelt über alle Zellen Bilder (Abb. 6c und 6f). Der Vergleich der Referenzzelle für unbehandelten und behandelten Bedingungen zeigt das Potenzial dieses Ansatzes für die einfache Beobachtung des Phänotyps unter Studium und ist besonders nützlich für die Erkundung zellulären Arzneimittelwirkungen. Ein Beispiel für eine mögliche Analyse der Wirkung von blebbistatin auf Zellen ist in Abbildung 7 dargestellt. Die Zahl der Zusammenbruch Zellen (dh Zellen mit einem leeren Bereich bestehenden unter dem theoretischen Hypotenuse) in 50 Kontroll-Zellen erkannt und 50 Zellen mit 5 uM blebbistatin behandelt werden, als von der ImageJ Hypotenuse Makro erkannt wird, erscheint. Die erhöhte Anzahl von zusammengebrochen Zellen in der blebbistatin behandelten Population spiegelt Entspannung der Stress-Fasern und damit Spannung an der Membran durch blebbistatin Hemmung der actinomyosin kontraktilen Kräfte innerhalb der Zelle. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Vorgehensweise, um eine neue Zeitschrift mit Metamorph erstellen. </p&gt; <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Flussdiagramm der automatischen Bildverarbeitung Verfahren. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Herausfiltern einzelner Zellen. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Building a Reference Cell. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Zellaussaat. A) Hela Zellen Mikrostrukturen nach dem Spülschritt (4-fache Vergrößerung) eingehalten B) HeLa-Zellen nach der vollständigen Verteilung auf L Mikrostrukturen (10fache Vergrößerung). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Vergleich nonpatterned und mikrostrukturierten Zellen in Kontroll-und Drogen behandelt Bedingungen. HeLa-Zellen wurden für 3 Stunden ausgesät und mit 5 uM blebbistatin für 1 Stunde (unteres Bild) oder unbehandelt (oberes Bild). In der Kontrollgruppe nonpatterned Zellen (a), montiert Aktin in mehrere Fasern, die sich unmerklich nach Behandlung mit 5 uM blebbistatin (d) zu demontieren. Auf L-Mikrostrukturen, Kontroll-Zellen eine dreieckige Form (b) erlassen und entwickeln eine große Aktin-Faser (Stress-Faser) zwischen den 2 Spitzen der L. Im Vergleich zu nonpatterned Zellen (d), induziert blebbistatin eine große phänotypische Veränderungen auf L-mikrostrukturierten Zellen (e). Direkte Visualisierung von Arzneimittelwirkungen und den Vergleich von Kontroll-und behandelten Bedingungen können sich schnell visualisiert werden mit der Referenzzelle Präsentation aus 20 Zellen aufgebaut. Ähnlich wie einzelne Zellen, ist eine klare und intensive Beanspruchung Faser, die zur Kontrolle Reference Cell (c), während blebbistatin Zellen kollabieren und den großen Stress Faser verschwindet (f) behandelt. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Beispiel für eine Analyse der Auswirkungen von blebbistatin auf Zellen mit dem Makro Hypotenuse. Während 25% der Kontroll-Zellen wurden zusammengebrochen, das 3-fache auf 75% erhöht in den 5 uM blebbistatin behandelten Zellen spiegelt die geschwächte actinomyosin kontraktilen Netz (n = 50 Zellen).

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Alle Autoren außer Anne Béghin sind Mitarbeiter von CYTOO SA, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel vorgestellten produziert.

Wahl der Mikrostruktur Während die Wirkungen von 5 uM blebbistatin kaum nachweisbar auf Standard-Kultur unterstützt werden, ist eine effiziente Quantifizierung auf Mikrostrukturen, die Aktin-Konzentration in einem einzigen großen Stress Faser möglich. Dies verbessert die Visualisierung des Aktin-Zytoskeletts Beihilfe genaue Quantifizierung der blebbistatin Auswirkungen auf die Zelle. Die Wahl der Mikrostruktur Form ist entscheidend bei der Gestaltung des Tests und ist nach der phänotypischen Veränderung in der Studie hervorgehoben werden entwickelt. Schlussfolgerungen Mikrostrukturen erleichtern die Visualisierung und Quantifizierung von Arzneimittelwirkungen, vor allem bei niedrigen Konzentrationen. Der Ersatz von homogenen ebenen Substraten mit Klebstoff Mikrostrukturen für die Zell-basierte Assays verbessert die Genauigkeit, Empfindlichkeit und Qualität der produzierten Daten. In Folge werden weniger Zellen für die Analyse notwendig, um zu erreichen robusten statistischen Ergebnisse 3. Adhesive Mikrostrukturen bieten eine echte Chance für die Verbesserung der funktionellen Studien und die Erforschung phänotypische Veränderungen bei niedrigeren Wirkstoffkonzentrationen, um zu vermeiden toxische oder indirekten Arzneimittelwirkungen. Wenn adäquate Screening-Plattformen verwendet werden, können Mikrostrukturen erfüllen die Anforderungen der Pharma-Unternehmen zur Verbesserung der Gen / Wirkstoff-Screening-Anwendungen. Einige weitere Beispiele für aktuelle Publikationen, die Mikrostrukturen ausgebeutet haben für die Analyse und Quantifizierung von zellulären Phänomen sind unten 3-13 zitiert.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Zellkultur </td></tr><tr><td colspan="2"> CYTOOchips 20x20 LM-FN </td><td> CYTOO </td><td> 10-114 </td><td> CYTOOchips sind für die Adsorption des Proteins Ihrer Wahl </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS 1x </td><td> Gibco </td><td> 14040-091 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Zählkammer (Kova Folie) </td><td> Prolabo </td><td> 71287,01 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMEM/F-12 + Glutamax-I </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> FBS (f tal Rinderserum) </td><td> PAA </td><td> 31331-028 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Penicillin &amp; Streptomycin </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 6 Vertiefungen-Platte </td><td> Dutscher </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Zentrifuge </td><td> Fisher Scientific </td><td> M65838 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Drogen, Fixierung und Immunfärbung </td></tr><tr><td colspan="2" > Zytoskelett Buffer 1X (CB) </td><td > Sigma </td><td > MES: M8250 KCl: I2636 MgCl: M2393 EGTA: E3889 </td><td > 10 mM MES pH 6,1, 138mm KCl, 3 mM MgCl, 2mM EGTA </td></tr><tr><td colspan="2" > Sucrose </td><td > Sigma </td><td > S2395 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 32% </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15714 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 5% </td><td></td><td></td><td> Mix 10 ml PFA 32% mit 54 ml CB 1.185X </td></tr><tr><td colspan="2"> Triton-X100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PBS-Tabletten </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 18912-014 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Bovin Serumalbumin (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A7806 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phallodin-FITC </td><td> Sigma </td><td> P5282 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Hoescht </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Blebbistatin </td><td> Euromedex </td><td> BN0640 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> NH 4 Cl 0,1 M </td><td> Sigma </td><td> M11209 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Image Acquisition </td></tr><tr><td colspan="2"> Epifluoreszenz-Mikroskop </td><td> Nikon</td><td> Eclipse-Ti </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> CCD-Kamera </td><td> TBC </td><td> TBC </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ImageJ Software </td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

improved visualization and quantitative analysis of drug effects using micropatterned cells

Bis heute sind die meisten HCA (High Content Analysis) Studien mit adhärenten Zelllinien auf ein homogenes Substrat in Gewebekultur-behandelte Mikro-Platten gezüchtet durchgeführt. Unter diesen Bedingungen verbreiten Zellen teilen und in alle Richtungen, was zu einer inhärenten Variabilität in der Zellform, Morphologie und Verhalten. Die hohe Zell-Zell-Varianz der Gesamtbevölkerung behindert den Erfolg des HCA, vor allem für die Medikamentenentwicklung. Die Fähigkeit von Mikrostrukturen, die Form und der inneren Polarität von jeder einzelnen Zelle zu normalisieren bietet eine enorme Chance für die Lösung dieser kritischen Engpass 1-2. Um den Zugang und die Nutzung der Mikrostrukturierung Technologie hat CYTOO eine Reihe von bereit Mikrostrukturen zu verwenden, in Deckglas und Mikrotiterplatten-Formate entwickelt. In diesem Video-Artikel bieten wir Ihnen ausführliche Protokolle über alle Verfahren von Zellaussaat auf CYTOOchip Mikrostrukturen, medikamentöse Behandlung, Fixierung und Färbung der automatisierten Erfassung, automatische Bildverarbeitung und abschließende Analyse der Daten. Mit diesem Beispiel zeigen wir, wie Mikrostrukturen können Zell-basierte Assays zu erleichtern. Veränderungen der Zelle Zytoskeletts sind nur schwer in Zellen auf homogenen Substraten kultiviert quantifizieren, aber die Kultivierung von Zellen auf Mikrostrukturen führt zu einem reproduzierbaren Organisation des Aktin-Geflecht durch systematische Positionierung der Zelladhäsion Kontakte in jeder Zelle. Solche Normalisierung der intrazellulären Architektur ermöglicht die Quantifizierung der auch kleine Effekte auf das Aktin-Zytoskelett, wie in diesen Satz von Protokollen über blebbistatin, einem Inhibitor der Aktin-Myosin-Interaktion gezeigt.

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Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Adhesive Mikrostrukturen, dass zelluläre Architektur normalisieren kann die Empfindlichkeit in der Detektion von Arzneimittelwirkungen, die Verbesserung der Reproduzierbarkeit und vereinfachen automatisierte Bildaufnahme und-analyse werden. Eine solche Technologie profitieren Arzneimittel / siRNA Screening-Assays, auf konventionellen Zellkultur unterstützt durchgeführt und somit leidet übermäßige Zelle zu Zelle Variabilität.

Verbesserte Visualisierung und quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K Aufrufe.  Grenoble, France. Adhesive Mikrostrukturen, dass zelluläre Architektur normalisieren kann die Empfindlichkeit in der Detektion von Arzneimittelwirkungen, die Verbesserung der Reproduzierbarkeit und vereinfachen automatisierte Bildaufnahme und-analyse werden. Eine solche Technologie profitieren Arzneimittel / siRNA Screening-Assays, auf konventionellen Zellkultur unterstützt durchgeführt und somit leidet übermäßige Zelle zu Zelle Variabilität.

Serie: Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Mikrostrukturierten Oberflächen zum Studium Hyaluronsäure Wechselwirkungen mit Krebszellen

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Forschung

Biotechnik

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogele für Neural Kultur-Systeme mit Dynamic Mask Projektion Photolithographie

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Gentransfektion in Richtung Spheroid Zellen auf mikrostrukturierten Kulturplatten für genetisch veränderte Zelltransplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Primärklärung der CHO geernteten Zellkulturflüssigkeit mittels eines akustischen Separators

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...