1. Preparação de células e propagação em micropadrões <ol><li> Coloque 2 CYTOOchips em 2 poços independente de uma placa de 6 assim garantir que você lê &quot;CYTOO&quot; no canto inferior direito da CYTOOchip. Micropadrões pode ser fluorescente etiquetado com Cy3 Cy5 ou corantes. CYTOOChips utilizado para este experimento tem Cy3 fluorescente etiquetado micropadrões. CUIDADO: Mantenha fichas no escuro. </li><li> Coletar células HeLa (~ confluentes 80%) por tripsinização. Verificar sob um microscópio que as células são adequadamente dispersas pelo tratamento de tripsina. Coletar e centrifugar células em 300g por 4 min, em seguida, delicadamente ressuspender o pellet celular. Contagem de células e diluir para uma concentração de 15.000 células / mL em meio de cultura completou DMEM/F12. </li><li> Dispense 4 mL (60.000 células) em cada poço contendo um CYTOOchip. ATENÇÃO: A placa deve ser movido o menos possível para evitar a indução de qualquer movimento de rotação no meio como esse tendem a se concentrar células no centro. </li><li> Deixe o sedimento de células por 10 minutos sob o capô, em seguida, movê-los para a célula incubadora. Após 10-20 min, as células vão começar a aderir ao micropadrões. Após 10 min, verificar regularmente sob o microscópio. </li><li> Assim que as células têm ligado, mude o meio celular e lave suavemente a superfície lamela utilizando o seguinte procedimento: </li><li> Manter a placa plana, aspirar cuidadosamente o meio com uma pipeta do lado do bem. CUIDADO: Nunca deixe o chip de fora seca, isso significa que nunca aspirado de fora todo o líquido, mas deixe o suficiente para cobrir o CYTOOchip em todos os momentos. </li><li> Adicionar 4 mL PBS e aspire novamente a primeira partida no centro do chip, em seguida, mudar-se para o lado do bem. Aspirar fora da PBS, conforme descrito sem expor o chip para o ar. Repita 3-4 vezes. </li><li> Verifique sob o microscópio para células flutuante: <ul><li> Se um grande número de células permanecem flutuando, repita o procedimento de lavagem. </li><li> Se você ver muito poucas células, aspirado de parte do PBS e substituí-lo com 2 ml de meio fresco. Aspirar e adicionar 4 mL de meio fresco duas vezes. </li></ul></li><li> Coloque a placa em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 para um mínimo de três horas para permitir que as células para alcançar a plena divulgação. NOTA: Usando este método entre 10-30% (2.000-6500) micropadrões será ocupado por uma única célula ou múltiplos. ATENÇÃO: O tempo necessário para que as células aderem antes da etapa de lavagem eo tempo necessário para a plena divulgação de células em micropadrões será específica para cada linhagem celular. </li></ol> 2. Tratamento Blebbistatin <ol><li> Dissolver o blebbistatin em DMSO 100% para obter uma solução estoque de 17 mM. Diluir a solução estoque ainda mais a 5 mM com DMSO 100%. Fazer uma diluição final no meio de cultura para obter uma concentração final de 5 mM em DMSO blebbistatin 0,1%. </li><li> Para condições de controle, prepare 4 mL de meio contendo DMSO 0,1% apenas. </li><li> Aspirar a mídia sobre as células e substituí-lo com o meio mL 4 preparado para as condições tratadas e controle. </li><li> Células incubar por 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 3. Fixação de células e coloração de Actina <ol><li> Preparação da solução para a fixação das células Por favor, consulte a secção de reagentes para a preparação do citoesqueleto buffer (CB) e PFA 5%. CB é especialmente recomendado para a rotulagem de fluorescência de filamentos de actina e microtúbulos. <ul><li> Prepare 1xCB sacarose: adicionar 1 g de sacarose a 2 mL da CB. Inclusão de sacarose ajuda a preservar as estruturas celulares internas. </li><li> Prepare PFA 4% de sacarose-CB: Adicionar 1 mL de 1xCB sacarose para 4 mL de morno PFA 5%. ATENÇÃO: Esta solução pode ser mantido a 4 ° C por alguns dias apenas. </li></ul></li><li> Fixação PFA <ul><li> Use uma pinça para pegar o CYTOOchip no logotipo CYTOO e colocá-lo (sem lavar) em um poço de uma placa de 6 poços contendo 2 ml de solução 4% de sacarose PFA-CB- </li><li> Incubar por 10 min à temperatura ambiente </li><li> Remover PFA-CB-sacarose e lave uma vez com PBS </li><li> Fazer uma segunda lavagem com 2 mL de 100 mM NH 4 Cl por 10 min, a fim de saciar a atividade residual crosslinking PFA NOTA: slides PFA fixa podem ser armazenados em PBS durante vários dias a 4 ° C antes organela coloração para imagens fluorescentes. </li></ul></li><li> Permeabilização da membrana celular com Triton X-100 Permeabilização das células com detergente permite anticorpos ou outras sondas para penetrar a membrana celular e elimina algumas das piscina citosólico das proteínas do citoesqueleto que podem de alguma forma reduzir o contraste de polímeros do citoesqueleto tornando difícil analisar a sua localização. <ul><li> Remover NH 4 Cl e adicionar 2 mL / poço de 0,1% Triton X-100-CB por 3 min à temperatura ambiente </li><li> Lave duas vezes com 2 mL de PBS </li></ul></li><li> Coloração actina Fluorescente que phalloidinh se liga a actina nativa só é usado para manchar os filamentos de actina. <ul><li> Adicionar 2 mL de FITC-conjugado diluído 1:2000 phalloidin em PBS com BSA 1,5% </li><li> Incubar 1 hora a RT </li><li> Lavar uma vez com 2 mL de PBS </li></ul></li><li> Coloração núcleos <ul><li> Adicionar 2 mL de Hoechst (mancha com 1μg / mL em PBS) </li><li> Incubar 3 minutos à temperatura ambiente </li><li> Lavar 2 vezes com 2 mL de PBS </li></ul></li><li> Montagem de slides <ul><li> Pegue o CYTOOchips no logotipo CYTOO e CYTOOchip montagem em uma lâmina de microscópio padrão usando 25-30 mL de Mowiol ou qualquer outra solução de montagem. </li></ul></li></ol> 4. Setup microscópio e Aquisição de Imagem Automated Numerosos pacotes de software de imagem existem de que o controle do microscópio para aquisição de imagem rápida e automatizada e mostrar. Este exemplo usa Metamorph software de imagem automática e aquisições são realizadas em um microscópio Nikon Eclipse Ti equipado com uma câmera CCD e um Hamamatsu Intensilight iluminador de fibra de mercúrio. Imagens são adquiridas com ampliação de 20x em três comprimentos de onda correspondentes a DAPI (núcleos), Cy-3 (micropadrões) e FITC-faloidina (actina). O número de micropadrões visualizados por campo irá variar dependendo da câmera e configurações objetivo. Micropadrões CYTOO são posicionados em intervalos definidos entre si (100 ou 130 mm) através do chip facilitando bastante a aquisição. <ol><li> Selecione ampliação de 20x </li><li> Aquisição Multidimensional aberto (na barra de Menu: Apps / Multidimensional Aquisição) e configurar os parâmetros diferentes do experimento: <ul><li> Número de comprimentos de onda: 3 </li><li> Tipos de comprimento de onda: DAPI, FITC, Cy3 </li><li> Definir o tempo de exposição para cada comprimento de onda pela primeira foco em um campo de células </li><li> Autofoco pode ser executada em cada comprimento de onda </li><li> Selecione onde deseja salvar os dados </li></ul></li><li> Selecione Cy3 comprimento de onda e posicionar a câmera de modo que 12 micropadrões são visualizados e centrado no campo da câmara (4 colunas e 3 linhas de padrões). </li><li> Criar uma revista em execução Aquisição multidimensional. O procedimento para a criação de um jornal é descrito na Figura 1. </li><li> Função palco aberto Scan (na barra de Menu: Dispositivos / Estágio / Scan Stage). Para adquirir 24 imagens, cada uma contendo 12 micropadrões com ampliação de 20x, entre 6 colunas e 4 linhas com -400 M X tamanho do passo e 300 mm, tamanho do passo Y. No Jornal SET para executar, fazer o upload do MDA.JNL revista. Em seguida, pressione Digitalizar para iniciar a aquisição automatizada de todo o bloco nos três comprimentos de onda. NOTA: O X e Y tamanhos passo aqui indicado variará de acordo com o número de micropadrões presentes em um campo de câmera. Dependendo do seu palco montado, na direção X e / ou Y pode exigir valores negativos para o movimento na direção correta. </li></ol> 5. Processamento de Imagem e Análise automatizada Muitos pacotes de software de imagem de processamento e análise de existir. Os procedimentos descritos abaixo processamento de contorno da imagem e as etapas de análise realizada por 2 custom-made macros escritas para o open source programa ImageJ. O CellRef macro primeiro cria uma célula de referência, o segundo Hypotenuse medidas rigidez colapso / da membrana celular. Ambos estão disponíveis mediante solicitação através <a href="www.cytoo.com">www.cytoo.com</a> . <ol><li> Criar pilhas de imagens para todos os três canais centrados em micropadrões (macro CellRef). Uso de células micropadrões evita agrupamento e agregação, simplificando enormemente o primeiro passo no processamento de imagem que é automatizado de localização e de segmentação de células individuais. As imagens fluorescente etiquetado micropattern são usados ​​para definir e delimitar as regiões centrado na micropadrões. Estas regiões são então transpostos para as imagens adquiridas em outros canais e cortadas. Correspondente imagens cortadas são então reunidos em pilhas para cada comprimento de onda. A RGB-pilha é também criada a partir da fusão dos três canais (Figura 2). </li><li> Aplicar única célula de seleção de filtro (macro CellRef) Como indicado acima, 10-30% (2.000-6.500) da micropadrões são ocupados por uma única célula ou várias células, enquanto o micropadrões restantes estão vazios. Para selecionar as imagens que mostram micropadrões ocupado por apenas uma única célula, a macro detecta o número de núcleos por imagem e elimina de todos (RGB e diferentes comprimentos de onda) pilhas que contenham mais de um núcleo ou não núcleos (Figura 3). </li><li> Eliminar a não-normalizada e células que não são totalmente esticado em todo o micropattern usando cut-off área da célula de filtro (macro CellRef) Para remover células em divisão que teria escapado o filtro núcleos, outro filtro através do canal de FITC para actina é aplicada. Área da célula é calculado e aqueles abaixo de um off cortar certas (áreas de células cerca de 2 vezes menos de área celular interfase) são removidas todas as pilhas. A área envelope célula é determinada pelo tamanho do padrão. </li><li&gt; Alinhar imagens das células (macro CellRef) Das etapas anteriores, as imagens que contenham células único micropatterned foram selecionados. Mesmo que essas imagens estão centradas na micropadrões, eles nunca estão todos perfeitamente alinhados uns aos outros. Para concluir o processamento de imagem, um plugin ImageJ (MultiStackReg) é aplicada para realinhar todas as imagens recolhidas e todos os canais com base na posição micropattern. Esta etapa gera pilhas alinhado de imagens individuais que agora pode ser usado para a análise única célula ou a criação de uma célula de referência (Figura 4) </li><li> Construção de uma célula de referência (macro CellRef) Células que crescem em micropadrões significa que todas as células têm formas semelhantes. Esta normalização permite um alinhamento preciso e sobreposição de imagens de células muitos. Resumindo o sinal em cada imagem sobre a pilha inteira permite visualizar e medir um &quot;efeito de drogas média&quot;. A imagem final global ou célula de referência é uma ferramenta única e útil para a representação e análise de imagem e só pode ser obtido com células micropatterned (Figura 4). No ImageJ, a célula de referência é construída, fazendo uma projeção das imagens filtradas e alinhada a partir de uma pilha (Image&gt; Pilhas&gt; Z-projeto). Vários métodos de projeção pode ser aplicado como a intensidade média ou máxima, mas geralmente uma projeção mediana é escolhido o que elimina outliers principal da pilha de imagens. Para facilitar a análise dos resultados, uma LUT (Look Up Tables) converter a imagem monocolor em um mapa de freqüência com código de cores é aplicado. </li><li> Medir e quantificar os parâmetros de interesse (Hypotenuse macro) Neste artigo de vídeo, L-micropadrões são utilizadas porque a forma organiza o citoesqueleto de actina em uma fibra única grande estresse. Destacando actina, desta forma, o impacto blebbistatin sobre o citoesqueleto pode ser determinada de várias maneiras: medir as mudanças na curvatura da fibra estresse actina, coloração intensidade, duração ou a espessura da fibra stress, alterações nas características morfométricas dos filamentos de actina ou etc forma da célula Estes parâmetros podem ser medidos tanto em imagens de células individuais ou na célula de referência final em si. Aqui, o impacto de 5 blebbistatin mM foi caracterizado pela contagem do número de células usando um segundo colapso ImageJ macro chamado hipotenusa (Figura 7). Resumidamente, imagens thresholded da L-micropattern são usados ​​para definir uma hipotenusa teóricas da forma de triângulo celular. Em seguida, limiarização das imagens manchadas de actina é realizada, a fim de aproximar a forma da célula real. A área entre a hipotenusa do triângulo teórico celular e da membrana da célula real côncavo é, então, medido. Quando a célula entrou em colapso, uma área sob a hipotenusa teórica aparece. A porcentagem de células colapso é usado para comparar o controle e tratados condições. </li></ol> 6. Resultados representante Exemplos do que deve ser semelhante a células em micropadrões imediatamente e várias horas após as etapas de lavagem críticas descritas nos 1,6-1,8, são mostrados na Figura 5. Depois de 15 min em CYTOOchips, células redondas HeLa são observados a distâncias iguais, indicando que eles aderiram ao micropadrões fibronectina (Figura 5a). Adesão é completa quando as células permanecem imobilizados apesar agitação suave do recipiente de cultura. Para minimizar o número de micropadrões ocupada por várias células, os chips são então lavados com PBS para remover as células flutuando sobre as áreas cytophobic. Depois de várias horas, as células que são totalmente esticada sobre a micropadrões vai olhar como os mostrados na Figura 5b. Imagens típicas única célula obtida após incubação de células com fixação blebbistatin, e coloração de actina e núcleos são apresentados na Figura 6. Após a aquisição automatizada de várias imagens e processamento de imagens usando o ImageJ CellRef macro, um mapa de freqüência com código de cores é gerado, que retrata a intensidade da actina, calculados sobre todas as imagens de células (Figura 6c e 6f). A comparação da Célula de Referência para as condições não tratadas e tratadas mostra o potencial dessa abordagem para fácil observação do fenótipo em estudo e é especialmente útil para explorar os efeitos da droga celular. Um exemplo de uma possível análise do efeito da blebbistatin nas células é apresentado na Figura 7. O número de células fechada (ou seja, células com uma área em branco existentes sob a hipotenusa teórica) detectados em 50 células controle e 50 células tratadas com 5 mM blebbistatin detectado pelo macro Hypotenuse ImageJ é mostrado. O aumento do número de células colapso na população blebbistatin tratados reflete o relaxamento das fibras de estresse e, portanto, a tensão na membrana devido à inibição das forças blebbistatin actinomyosin contrátil dentro da célula. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Procedimento para criar uma nova revista com Metamorph. </p&gt; <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura Fluxograma 2. Automática do procedimento de processamento de imagem. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Filtering para fora das células individuais. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. A construção de uma célula de referência. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Semeadura Cell. A) células Hela adere a micropadrões após a etapa de lavagem (ampliação 4x) B) células HeLa após a completa divulgação sobre micropadrões L (10x). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Comparação de células nonpatterned e micropatterned no controle e condições de drogas tratados. Células HeLa foram semeadas durante 3 horas e tratados com 5 blebbistatin M para uma hora (painel inferior) ou não tratada (superior do painel). Em células controle nonpatterned (a), actina monta em fibras múltiplas que desmontar imperceptível sobre o tratamento com 5 blebbistatin mM (d). Em L-micropadrões, células controle adotar uma forma triangular (b) e desenvolver uma fibra de actina major (fibras de stress) entre os dois ápices da L. Comparado com células nonpatterned (d), blebbistatin induz uma grande mudança fenotípica em L-micropatterned células (e). Visualização direta dos efeitos de drogas ea comparação de controle e condições tratadas podem ser visualizadas rapidamente com a apresentação célula de referência construída a partir de 20 células. Semelhantes às células individuais, uma fibra estresse clara e intensa está presente na célula de referência de controle (c), enquanto blebbistatin células tratadas com o colapso ea fibra de estresse desaparece (f). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Exemplo de uma análise dos efeitos da blebbistatin sobre as células usando a hipotenusa macro. Enquanto 25% das células controle foram desabou, esta aumentou 3 vezes e 75% na 5 células M blebbistatin tratados refletindo o enfraquecimento actinomyosin contrátil rede (n = 50 células).

<ol>
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Todos os autores, exceto Anne Béghin são funcionários da CYTOO SA, que produz reagentes e instrumentação apresentado neste artigo.

Escolha de micropattern Embora os efeitos de 5 mM blebbistatin são pouco detectáveis ​​em suportes de cultura padrão, quantificação eficiente disponível no micropadrões que concentram actina em uma fibra única grande estresse. Isso melhora a visualização do citoesqueleto de actina auxiliando a quantificação precisa dos efeitos blebbistatin na célula. A escolha da forma micropattern é fundamental na concepção do ensaio e é projetado de acordo com a variação fenotípica a ser destacado no estudo. Conclusões Micropadrões facilitar a visualização e quantificação dos efeitos da droga, especialmente em baixas concentrações. A substituição de substratos homogêneos planar com micropadrões adesivo para celular baseado em ensaios melhora a precisão, sensibilidade e qualidade dos dados produzidos. Em conseqüência, menos células são necessários para análise a fim de alcançar os resultados estatísticos robustos 3. Micropadrões adesivo oferecer uma oportunidade real para melhorar a estudos funcionais e explorando alterações fenotípicas em concentrações mais baixas de drogas, a fim de evitar induzir efeitos tóxicos de drogas ou indireta. Se plataformas de triagem adequada são usados, micropadrões pode atender às demandas das empresas farmacêuticas para melhorar aplicações gene / drogas triagem. Alguns exemplos adicionais de publicações recentes que têm explorado micropadrões para analisar e quantificar fenômeno celulares são citados abaixo 3-13.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Cultura de células </td></tr><tr><td colspan="2"> CYTOOchips 20x20 LM-FN </td><td> CYTOO </td><td> 10-114 </td><td> CYTOOchips estão disponíveis para a adsorção da proteína da sua escolha </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS 1x </td><td> Gibco </td><td> 14040-091 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Câmara de contagem (slide Kova) </td><td> Prolabo </td><td> 71.287,01 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMEM/F-12 + Glutamax-I </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> FBS (f tal soro bovino) </td><td> PAA </td><td> 31331-028 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Penicilina e estreptomicina </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 6 poços-placa </td><td> Dutscher </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> centrifugador </td><td> Fisher Scientific </td><td> M65838 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Microscópio </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Drogas fixação e imunomarcação </td></tr><tr><td colspan="2" > Citoesqueleto tampão 1X (CB) </td><td > Sigma </td><td > MES: M8250 KCl: I2636 MgCl: M2393 EGTA: E3889 </td><td > 10 mM MES pH 6,1, KCl 138mm, MgCl 3mm, 2mM EGTA </td></tr><tr><td colspan="2" > Sacarose </td><td > Sigma </td><td > S2395 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 32% </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 15714 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 5% </td><td></td><td></td><td> Misturar 10 mL de PFA 32% com 54 mL de CB 1.185X </td></tr><tr><td colspan="2"> Triton-X100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Comprimidos PBS </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 18912-014 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Bovin albumina sérica (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A7806 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phallodin-FITC </td><td> Sigma </td><td> P5282 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Hoescht </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Blebbistatin </td><td> Euromedex </td><td> BN0640 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> NH 4 Cl 0,1 M </td><td> Sigma </td><td> M11209 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Aquisição de imagem </td></tr><tr><td colspan="2"> Microscópio de epifluorescência </td><td> Nikon</td><td> Eclipse Ti </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> CCD Camera </td><td> TBC </td><td> TBC </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Software ImageJ </td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

improved visualization and quantitative analysis of drug effects using micropatterned cells

Até à data, a maioria dos HCA (análise de conteúdo de alta) são realizados estudos com linhagens de células aderentes cultivadas em um substrato homogêneo em cultura de tecidos tratados com micro-placas. Sob essas condições, as células se difundir e dividir em todas as direções, resultando em uma variabilidade inerente na forma celular, morfologia e comportamento. A variância célula a célula-alta da população em geral impede o sucesso do HCA, especialmente para o desenvolvimento de drogas. A capacidade de micropadrões para normalizar a forma ea polaridade interna de cada célula individual proporciona uma tremenda oportunidade para resolver esse gargalo crítico 1-2. Para facilitar o acesso e uso da tecnologia micropatterning, CYTOO desenvolveu uma gama de pronto para usar micropadrões, disponível nos formatos lamela e micropoços. Neste artigo de vídeo, nós fornecemos protocolos detalhados de todos os procedimentos de semeadura de células em CYTOOchip micropadrões, tratamento da toxicodependência, fixação e coloração de aquisição automatizada, o processamento automático de imagem e análise de dados final. Com este exemplo, nós ilustrar como micropadrões pode facilitar baseada em células ensaios. Alterações do citoesqueleto das células são difíceis de quantificar em células cultivadas em substratos homogêneos, mas a cultura de células em micropadrões resulta em uma organização reprodutível de actina da malha devido ao posicionamento sistemático dos contatos de adesão celular em cada célula. Essa normalização da arquitetura intracelular permite a quantificação do mesmo pequenos efeitos sobre o citoesqueleto de actina como demonstrado nestes conjunto de protocolos usando blebbistatin, um inibidor da interação actina e miosina.

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Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Micropadrões adesivo que normalize arquitetura celular pode ser usado para aumentar a sensibilidade na detecção de efeitos de drogas, melhorar a reprodutibilidade e simplificar a aquisição de imagem e análise automatizada. Essa tecnologia irá beneficiar os ensaios de drogas / siRNA triagem, realizada em apoia a cultura convencional de células e, conseqüentemente, sofrendo de variabilidade célula a célula-excessiva.

Visualização melhorada e Análise Quantitativa dos Efeitos de Drogas Usando Células micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K visualizações.  Grenoble, France. Micropadrões adesivo que normalize arquitetura celular pode ser usado para aumentar a sensibilidade na detecção de efeitos de drogas, melhorar a reprodutibilidade e simplificar a aquisição de imagem e análise automatizada. Essa tecnologia irá beneficiar os ensaios de drogas / siRNA triagem, realizada em apoia a cultura convencional de células e, conseqüentemente, sofrendo de variabilidade célula a célula-excessiva.

Vídeo: Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Superfícies micropatterned para estudar as interações ácido hialurônico com células de câncer

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Bioengenharia

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

Fabricação de hidrogéis micropatterned para Sistemas de Cultura Neural usando fotolitografia Projeção Dinâmica Máscara

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

Alongamento Células micropatterned num PDMS Membrana

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

A transfecção Gene direção Células Spheroid em placas micropadronadas Cultura para Transplante de Células geneticamente modificados

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-Targeting proteína pequena molécula Rastreio de drogas

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Esclarecimento Primário do Fluido de Cultura Celular Colhida cho usando um separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...