1. Preparazione e Semina delle cellule su microdisegni <ol><li> Posto 2 CYTOOchips in 2 pozzi indipendente di una piastra ben 6 assicurando che si legge &quot;CYTOO&quot; nell&#39;angolo in basso a destra della CYTOOchip. Microdisegni possono essere marcate con Cy3 o Cy5 coloranti. CYTOOChips utilizzati per questo esperimento sono Cy3 fluorescente microdisegni. ATTENZIONE: Conservare i chip al buio. </li><li> Raccogliere le cellule HeLa (confluenti ~ 80%) da tripsinizzazione. Controllare al microscopio che le cellule siano dispersi dal trattamento tripsina. Raccogliere e centrifugare le cellule a 300g per 4 minuti, poi delicatamente risospendere il pellet cellulare. Contare le celle e diluire ad una concentrazione di 15.000 cellule / ml in terreni di coltura DMEM/F12 completato. </li><li> Dispensare 4 ml (60.000 cellule) in ciascun pozzetto contenente un CYTOOchip. ATTENZIONE: La piastra deve essere spostato il meno possibile per evitare di indurre i movimenti di rotazione nel mezzo come questo tenderà a concentrare le cellule al centro. </li><li> Lasciate che il sedimento cellule per 10 minuti sotto il cofano per poi passare alla cella incubatrice. Dopo 10-20 minuti, le cellule iniziano a aderire al microdisegni. Dopo 10 minuti, controllare regolarmente sotto il microscopio. </li><li> Non appena le cellule hanno attaccato, cambiare il medium delle cellule e lavare delicatamente la superficie del vetrino con la seguente procedura: </li><li> Mantenere la piastra piatta, leggermente aspirare il terreno con una pipetta dal lato del bene. ATTENZIONE: Non lasciare che il chip di fuori asciutto, questo significa che non è mai aspirare fuori tutto il liquido lasciando sufficiente a coprire il CYTOOchip in ogni momento. </li><li> Aggiungere 4 ml di PBS e aspirare di nuovo primo avvio al centro del chip per poi passare al lato del bene. Aspirare al largo della PBS come descritto senza esporre il chip per aria. Ripetere 3-4 volte. </li><li> Controllare al microscopio per le cellule galleggianti: <ul><li> Se un gran numero di cellule galleggianti rimangono, ripetere la procedura di lavaggio. </li><li> Se vedete cellule molto pochi, aspirare una parte dei PBS e sostituirlo con 2 ml di mezzo fresco. Aspirare e aggiungere 4 ml di terreno fresco due volte. </li></ul></li><li> Porre la piastra in un tessuto culturale incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 per un minimo di tre ore per permettere alle cellule di raggiungere la piena diffusione. NOTA: L&#39;utilizzo di questo metodo tra il 10-30% (2.000-6.500) microdisegni sarà occupata da un cellule singole o multiple. ATTENZIONE: Il tempo necessario per le cellule di aderire prima della fase di lavaggio e il tempo necessario per la piena diffusione delle celle microdisegni saranno specifici per ogni linea cellulare. </li></ol> 2. Blebbistatin Trattamento <ol><li> Sciogliere il blebbistatin in 100% DMSO per ottenere una soluzione stock di 17 mm. Diluire la soluzione stock ulteriormente a 5 mm con 100% di DMSO. Effettuare una diluizione finale nel terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di 5 micron di blebbistatin 0,1% DMSO. </li><li> Per le condizioni di controllo, preparare 4 mL di mezzo contenente 0,1% di DMSO solo. </li><li> Aspirare il multimediale su cellule e sostituirlo con il mezzo preparato per 4 mL condizioni di trattamento e di controllo. </li><li> Cellule incubare per 1 ora a 37 ° C. </li></ol> 3. Fissazione delle cellule e la colorazione di actina <ol><li> La preparazione della soluzione per il fissaggio delle cellule Vedere la sezione reagente per la preparazione del citoscheletro tampone (CB) e PFA 5%. CB è particolarmente indicato per l&#39;etichettatura di fluorescenza di filamenti di actina e microtubuli. <ul><li> Preparare 1xCB-saccarosio: aggiungere 1 g di saccarosio a 2 ml di CB. L&#39;inclusione di saccarosio aiuta a preservare le strutture cellulari interne. </li><li> Preparare 4% PFA-CB-saccarosio: Aggiungere 1 ml di 1xCB-saccarosio a 4 ml di caldo PFA 5%. ATTENZIONE: Questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per pochi giorni soltanto. </li></ul></li><li> PFA fissazione <ul><li> Usare pinze per prendere il CYTOOchip sul logo CYTOO e metterla (senza lavatrice) in un pozzo di un 6-pozzetti contenenti 2 ml del 4% PFA-CB-soluzione di saccarosio </li><li> Incubare 10 min a RT </li><li> Rimuovere PFA-CB-saccarosio e lavare una volta con PBS </li><li> Fare un secondo lavaggio con 2 ml di 100 mM NH 4 Cl per 10 minuti al fine di soddisfare la residua attività di reticolazione PFA NOTA: diapositive PFA fisso possono essere memorizzati in PBS per diversi giorni a 4 ° C prima della colorazione organello per l&#39;imaging a fluorescenza. </li></ul></li><li> Permeabilizzazione della membrana cellulare con Triton X-100 Permeabilizzazione delle cellule con detergente permette anticorpi o altre sonde per penetrare la membrana cellulare ed elimina alcuni della piscina citosolico di proteine ​​del citoscheletro che possono comunque ridurre il contrasto dei polimeri del citoscheletro che rende difficile analizzare la loro localizzazione. <ul><li> Rimuovere NH 4 Cl e aggiungere 2 mL / pozzetto del 0,1% Triton X-100-CB per 3 min a RT </li><li> Lavare due volte con 2 ml di PBS </li></ul></li><li> Actina colorazione Fluorescenti che falloidinah lega alla actina nativo viene utilizzato per colorare i filamenti di actina. <ul><li> Aggiungere 2 ml di coniugato FITC falloidina diluito 1:2000 in PBS con 1,5% di BSA </li><li> Incubare 1 ora a RT </li><li> Lavare una volta con 2 ml di PBS </li></ul></li><li> Nuclei colorazione <ul><li> Aggiungere 2 mL di Hoechst (macchia con 1μg / ml in PBS) </li><li> Incubare 3 minuti a RT </li><li> Lavare per 2 volte con 2 ml di PBS </li></ul></li><li> Montaggio di diapositive <ul><li> Raccogliete il CYTOOchips sul logo CYTOO e CYTOOchip montare su un vetrino da microscopio standard con 25-30 ml di Mowiol o qualsiasi altra soluzione di montaggio. </li></ul></li></ol> 4. Microscopio installazione e acquisizione automatica dell&#39;immagine Numerosi pacchetti software di imaging che esiste il controllo del microscopio per una rapida acquisizione delle immagini e la visualizzazione automatica. Questo esempio utilizza Metamorph software di imaging e di acquisizioni automatiche vengono eseguite su un microscopio Nikon Eclipse Ti dotato di una fotocamera CCD Hamamatsu e mercurio in fibra Intensilight illuminatore. Le immagini sono acquisite a 20x in tre lunghezze d&#39;onda corrispondenti al DAPI (nuclei), Cy-3 (microdisegni) e FITC-falloidina (actina). Il numero di microdisegni visualizzati per ogni campo varia a seconda della fotocamera e le impostazioni obiettivo. Microdisegni CYTOO sono posizionati a intervalli definiti l&#39;uno dall&#39;altro (100 o 130 micron) attraverso il chip facilitando l&#39;acquisizione. <ol><li> Seleziona 20x </li><li> Acquisizione aperto (Multidimensional nella barra dei menu: Applicazioni / multidimensionali Acquisizione) e impostare i vari parametri della sperimentazione: <ul><li> Numero di lunghezze d&#39;onda: 3 </li><li> Tipi di lunghezza d&#39;onda: DAPI, FITC, Cy3 </li><li> Impostare il tempo di esposizione per ogni lunghezza d&#39;onda per prima concentrandosi su un campo di cellule </li><li> Messa a fuoco automatica può essere eseguita su ogni lunghezza d&#39;onda </li><li> Scegliere dove salvare i dati </li></ul></li><li> Seleziona Cy3 lunghezza d&#39;onda e posizionare la fotocamera in modo che 12 microdisegni vengono visualizzati e centrato nel campo della fotocamera (4 colonne e 3 righe di modelli). </li><li> Creare un giornale in esecuzione di acquisizione multidimensionale. La procedura per la creazione di una rivista è descritto nella Figura 1. </li><li> Aprire la funzione di scansione stadio (nella barra dei menu: Dispositivi / Stage / Stage Scan). Per acquisire 24 immagini ciascuno contenente 12 microdisegni a ingrandimento 20x, immettere 6 colonne e 4 righe con -400 micron passo X dimensioni e 300 Y dimensioni micron passo. In Gazzetta SET per eseguire, caricare la MDA.JNL rivista. Poi premere Scansione per avviare l&#39;acquisizione automatica del blocco tutto nelle tre lunghezze d&#39;onda. NOTA: Le dimensioni X e Y passo qui indicati possono variare in base al numero di microdisegni presenti in un campo di macchina fotografica. A seconda del palco allestito, in direzione X e / o Y può richiedere valori negativi per il movimento nella direzione corretta. </li></ol> 5. Image Processing ed analisi automatizzata Molti pacchetti software di elaborazione delle immagini e analisi di esistere. Le procedure descritte di seguito l&#39;elaborazione delle immagini schema e fasi di analisi eseguite da 2 misura macro scritte per il programma ImageJ open source. Il CellRef prima macro crea una cella di riferimento, la seconda Ipotenusa rigidità misure / collasso della membrana cellulare. Entrambi sono disponibili su richiesta presso <a href="www.cytoo.com">www.cytoo.com</a> . <ol><li> Creare stack di immagine per tutti e tre i canali centrata su microdisegni (macro CellRef). L&#39;uso di cellule microdisegni evita di clustering e di aggregazione, semplificando notevolmente il primo passo per l&#39;elaborazione delle immagini è automatico che la localizzazione e la segmentazione delle singole cellule. Le immagini marcate micropattern sono usati per definire e delimitare le regioni centrata sul microdisegni. Queste regioni sono poi trasposti sul immagini acquisite in altri canali e tagliate. Corrispondenti immagini ritagliate vengono poi assemblati in pile per ogni lunghezza d&#39;onda. Un RGB-pila è anche creato dalla fusione dei tre canali (Figura 2). </li><li> Applicare singola cella di selezione del filtro (macro CellRef) Come indicato sopra, il 10-30% (2.000-6.500) del microdisegni sono occupati da una singola cellula o più celle, mentre le rimanenti microdisegni sono vuote. Per selezionare le immagini che mostrano microdisegni occupato da solo una singola cella, la macro rileva il numero di nuclei per immagine ed elimina da tutti (RGB e lunghezze d&#39;onda diverse) stack quelli contenenti più di un nucleo o senza nuclei (Figura 3). </li><li> Eliminare non normalizzati e le cellule che non sono pienamente teso la micropattern utilizzando zona di cut-off cella filtrante (macro CellRef) Per rimuovere divisione delle cellule che sono sfuggite al filtro nuclei, un altro filtro utilizzando il canale FITC per actina viene applicata. Area di cella viene calcolato e quelli di sotto di un certo cut off (aree di cellule circa 2 volte meno di area di cella interfase) vengono rimossi da tutti gli stack. L&#39;area busta cella è determinata dalle dimensioni del pattern. </li><li&gt; Allineare le immagini delle cellule (macro CellRef) Dai passaggi precedenti, le immagini contenenti singole cellule micropatterned sono stati selezionati. Anche se queste immagini sono centrati su microdisegni, non sono mai tutti perfettamente allineati gli uni agli altri. Per concludere l&#39;elaborazione delle immagini, un plugin ImageJ (MultiStackReg) viene applicata a riallineare tutte le immagini raccolte e tutti i canali in base alla posizione micropattern. Questa operazione genera pile allineate su singole immagini, che possono ora essere utilizzati per l&#39;analisi singola cella o la creazione di una cella di riferimento (Figura 4) </li><li> Costruire una cella di riferimento (macro CellRef) Cellule in crescita su microdisegni significa che tutte le cellule hanno forme simili. Questa normalizzazione permette un preciso allineamento e sovrapposizione delle immagini delle cellule molti. Riassumendo il segnale in ogni immagine sopra l&#39;intero stack permette di visualizzare e misurare un &quot;effetto media della droga&quot;. L&#39;immagine finale complessivo o cella di riferimento è uno strumento unico e utile per la rappresentazione e analisi di immagine e può essere ottenuto solo con le cellule micropatterned (Figura 4). In ImageJ, la cella di riferimento è costruito facendo una proiezione delle immagini filtrate e allineate da una pila (Immagine&gt; Pile&gt; Z-progetto). Diversi metodi di proiezione può essere applicato come l&#39;intensità media o massima, ma di solito una proiezione mediana viene scelta che elimina outlier principale della serie di immagini. Per facilitare l&#39;esame dei risultati, una LUT (Look Up Tables) convertire l&#39;immagine in un monocolore Mappa del frequenza viene applicata. </li><li> Misurazione e quantificazione dei parametri di interesse (Ipotenusa macro) In questo articolo video, L-microdisegni vengono utilizzati perché la forma organizza il citoscheletro di actina in una singola fibra di stress maggiori. Evidenziando actina in questo modo, l&#39;impatto blebbistatin sul citoscheletro può essere determinato in molti modi: misurando i cambiamenti nella curvatura della fibra di stress l&#39;actina, colorazione di intensità, lunghezza o spessore delle fibre di stress, cambiamenti nelle caratteristiche morfometriche dei filamenti di actina o forma ecc cellula Questi parametri possono essere misurati sia su immagini singola cella o nella cella di riferimento finale stesso. Qui, l&#39;impatto su 5 blebbistatin mM è stata caratterizzata da contando il numero di cellule crollato con un secondo ImageJ macro chiamata Ipotenusa (Figura 7). In breve, le immagini thresholded della L-micropattern sono usati per definire un ipotenusa teorico della forma triangolare cellulare. Successivamente, soglia di immagini colorate della actina viene effettuata allo scopo di approssimare la forma delle cellule reale. L&#39;area compresa tra l&#39;ipotenusa teorico del triangolo cellulare e la membrana cellulare reale concava viene misurata. Quando la cellula è crollato, una zona sotto l&#39;ipotenusa teorico appare. La percentuale di cellule crollato viene utilizzato per confrontare le condizioni di controllo e trattati. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Esempi di ciò che le cellule dovrebbe essere simile a microdisegni immediatamente e diverse ore dopo le fasi di lavaggio critici descritti in 1,6-1,8, sono mostrati in figura 5. Dopo 15 minuti a CYTOOchips, rotondo cellule HeLa sono osservati a distanze uguali indica che hanno aderito al microdisegni fibronectina (figura 5a). L&#39;adesione è completa quando le cellule rimangono immobilizzati nonostante agitando delicatamente il recipiente di coltura. Per ridurre al minimo il numero di microdisegni occupati da più celle, i chip vengono poi lavati con PBS per rimuovere le cellule galleggianti sulle aree cytophobic. Dopo diverse ore, le cellule che sono completamente stirato sul microdisegni sarà simile a quelli mostrati nella figura 5b. Tipico immagini singola cella ottenute dopo incubazione di cellule con blebbistatin, fissazione e colorazione di actina e dei nuclei sono presentati nella Figura 6. Dopo l&#39;acquisizione automatica di immagini multiple ed elaborazione delle immagini utilizzando il ImageJ CellRef macro, una mappa a colori frequenza è generata che ritrae l&#39;intensità di actina in media su tutte le immagini delle cellule (Figura 6c e 6f). Il confronto tra la cella di riferimento per le condizioni non trattati e trattati mostra il potenziale di questo approccio per l&#39;osservazione facile del fenotipo in fase di studio ed è particolarmente utile per esplorare gli effetti della droga cellulare. Un esempio di analisi dei possibili effetti di blebbistatin sulle cellule è presentato in figura 7. Il numero delle cellule è crollato (es. celle con un&#39;area vuota esistente sotto l&#39;ipotenusa teorico) rilevati in 50 cellule di controllo e 50 cellule trattate con 5 mM blebbistatin come rilevato dalla macro Ipotenusa ImageJ è mostrato. L&#39;aumento del numero delle cellule è crollato nella popolazione trattata blebbistatin riflette il rilassamento delle fibre di stress e quindi la tensione a livello della membrana a causa dell&#39;inibizione blebbistatin delle forze actinomyosin contrattili all&#39;interno della cellula. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Procedura per creare una nuova rivista con Metamorph. </p&gt; <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Diagramma di flusso della procedura automatica di elaborazione delle immagini. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Filtrare di singole cellule. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Costruire una cella di riferimento. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Semina cellulare. A) le cellule Hela aderito a microdisegni dopo la fase di lavaggio (ingrandimento 4x) B) le cellule HeLa dopo la piena diffusione sul microdisegni L (ingrandimento 10x). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Confronto delle cellule nonpatterned micropatterned e nel controllo della droga e le condizioni di trattamento. Cellule HeLa sono state seminate per 3 ore e trattati con 5 blebbistatin mM per 1 ora (pannello inferiore) oa sinistra non trattati (pannello superiore). Nel controllo delle cellule nonpatterned (a), actina assembla in fibre multiple che smontare impercettibilmente in seguito al trattamento con 5 blebbistatin mM (d). Su L-microdisegni, le cellule di controllo di adottare una forma triangolare (b) e sviluppare una fibra importante actina (fibra di stress) tra i 2 apici della L. Rispetto alle cellule nonpatterned (d), blebbistatin induce un importante cambiamento fenotipico su L-micropatterned cellule (e). Visualizzazione diretta degli effetti del farmaco e il confronto di controllo e alle condizioni trattate possono essere visualizzati rapidamente con la presentazione cella di riferimento costruito a partire da 20 celle. Simile a singole celle, una fibra di stress chiara e intensa è presente la cella di riferimento di controllo (c), mentre blebbistatin trattati collasso delle cellule e le fibre di stress principali scompare (f). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Esempio di un&#39;analisi degli effetti della blebbistatin sulle cellule utilizzando l&#39;ipotenusa macro. Mentre il 25% delle cellule di controllo erano crollati, questa aumentata di 3 volte al 75% nelle cellule mM 5 blebbistatin trattati che riflette la debole actinomyosin contrattile rete (n = 50 cellule).

<ol>
	<li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+guides+the+orientation+of+the+cell+division+axis.">The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis.</a> Nat Cell Biol. 7, 947-953 (2005).</li><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropy+of+cell+adhesive+microenvironment+governs+cell+internal+organization+and+orientation+of+polarity.">Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19771-19776 (2006).</li><li>Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nat Methods. , (2010).</li><li>Bischofs, I. B., Klein, F., Lehnert, D., Bastmeyer, M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+network+mechanics+and+active+contractility+determine+cell+and+tissue+shape.">Filamentous network mechanics and active contractility determine cell and tissue shape.</a> Biophys J. 95, 3488-3496 (2008).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li><li>Dupin, I., Camand, E., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+nucleus+and+centrosome+position+and+cell+polarity.">Classical cadherins control nucleus and centrosome position and cell polarity.</a> J Cell Biol. 185, 779-786 (2009).</li><li>Gomez, E. W., Chen, Q. K., Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+geometry+patterns+epithelial-mesenchymal+transition+via+intercellular+mechanotransduction.">Tissue geometry patterns epithelial-mesenchymal transition via intercellular mechanotransduction.</a> J Cell Biochem. 110, 44-51 (2010).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4872-4877 (2010).</li><li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li><li>Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics.">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 11594-11599 (2005).</li><li>Pouthas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+migrating+cells,+the+Golgi+complex+and+the+position+of+the+centrosome+depend+on+geometrical+constraints+of+the+substratum.">In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum.</a> J Cell Sci. 121, 2406-2414 (2008).</li><li>Thery, M., Jimenez-Dalmaroni, A., Racine, V., Bornens, M., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+study+of+mitotic+spindle+orientation.">Experimental and theoretical study of mitotic spindle orientation.</a> Nature. 447, 493-496 (2007).</li><li>Thery, M., Pepin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63, 341-355 (2006).</li></ol>

Tutti gli autori ad eccezione di Anne Béghin sono dipendenti di CYTOO SA, che produce reagenti e strumentazioni presenti in questo articolo.

Scelta del micropattern Mentre gli effetti su 5 blebbistatin mM sono appena rilevabili su supporti cultura standard, la quantificazione efficiente disponibile in microdisegni che concentrano la actina in una singola fibra di stress maggiori. Questo migliora la visualizzazione del citoscheletro di actina aiutare quantificazione precisa degli effetti blebbistatin sulla cellula. La scelta della forma micropattern è fondamentale nella progettazione del test ed è progettato in base alla variazione fenotipica da evidenziare in questo studio. Conclusioni Microdisegni facilitare la visualizzazione e la quantificazione degli effetti del farmaco, soprattutto a basse concentrazioni. La sostituzione del omogenea substrati planari con microdisegni adesivo per saggi cellulari migliora la precisione, la sensibilità e la qualità dei dati prodotti. Di conseguenza, un minor numero di celle sono necessari per l&#39;analisi al fine di ottenere robusti risultati statistici 3. Microdisegni adesivo offrire una reale opportunità per migliorare gli studi funzionali e ad esplorare i cambiamenti fenotipici a concentrazioni di farmaco inferiori in modo da evitare indurre effetti dei farmaci tossici o indiretta. Se le piattaforme di screening adeguati vengono utilizzati, microdisegni in grado di soddisfare le esigenze delle aziende farmaceutiche per il miglioramento genetico / farmaco applicazioni di screening. Alcuni esempi di pubblicazioni recenti che hanno sfruttato microdisegni per l&#39;analisi e la quantificazione fenomeno cellulari sono citati sotto 3-13.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Coltura cellulare </td></tr><tr><td colspan="2"> CYTOOchips 20x20 LM-FN </td><td> CYTOO </td><td> 10-114 </td><td> CYTOOchips sono disponibili per l&#39;adsorbimento della proteina di vostra scelta </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS 1x </td><td> Gibco </td><td> 14040-091 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Camera di conteggio (scivolo Kova) </td><td> Prolabo </td><td> 71.287,01 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMEM/F-12 + Glutamax-I </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> FBS (f tal siero bovino) </td><td> PAA </td><td> 31331-028 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Penicillina e Streptomicina </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 6 pozzi-plate </td><td> Dutscher </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> centrifuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> M65838 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Microscopio </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Droga, fissaggio e immunostaining </td></tr><tr><td colspan="2" > Citoscheletro Buffer 1X (CB) </td><td > Sigma </td><td > MES: M8250 KCl: I2636 MgCl: M2393 EGTA: E3889 </td><td > MES 10 mM pH 6.1, KCl 138mm, MgCl 3mm, 2mM EGTA </td></tr><tr><td colspan="2" > Saccarosio </td><td > Sigma </td><td > S2395 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 32% </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15714 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 5% </td><td></td><td></td><td> Miscelare 10 mL di PFA 32% con 54 ml di CB 1.185X </td></tr><tr><td colspan="2"> Triton-X100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PBS compresse </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 18912-014 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Bovin albumina sierica (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A7806 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phallodin-FITC </td><td> Sigma </td><td> P5282 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Hoescht </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Blebbistatin </td><td> Euromedex </td><td> BN0640 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> NH 4 Cl 0,1 M </td><td> Sigma </td><td> M11209 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Image Acquisition </td></tr><tr><td colspan="2"> Microscopio epifluorescente </td><td> Nikon</td><td> Ti Eclipse </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> CCD </td><td> TBC </td><td> TBC </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ImageJ Software </td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

improved visualization and quantitative analysis of drug effects using micropatterned cells

Fino ad oggi, la maggior parte HCA (Content Analysis Alta) studi sono effettuati con linee cellulari aderenti coltivate su un substrato omogeneo nel tessuto-coltura trattata micro-piatti. In queste condizioni, le cellule diffuse e dividere in tutte le direzioni con conseguente variabilità nella forma delle cellule, la morfologia e il comportamento. L&#39;alta cellula-cellula varianza della popolazione complessiva impedisce il successo di HCA, soprattutto per lo sviluppo di farmaci. La capacità di microdisegni di normalizzare la forma e la polarità interno di ogni singola cella fornisce una straordinaria opportunità per la soluzione di questo collo di bottiglia critico 1-2. Per facilitare l&#39;accesso e l&#39;utilizzo della tecnologia micropatterning, CYTOO ha sviluppato una gamma di pronto all&#39;uso microdisegni, disponibili in formati coprioggetto e pozzetti. In questo articolo video, forniamo protocolli dettagliati di tutte le procedure da semina cella microdisegni CYTOOchip, trattamento farmacologico, la fissazione e la colorazione di acquisizione automatica, elaborazione delle immagini automatizzata e l&#39;analisi dei dati finali. Con questo esempio, illustrare come microdisegni può facilitare saggi cellulari. Alterazioni del citoscheletro delle cellule sono difficili da quantificare in cellule in coltura su substrati omogenei, ma le cellule in coltura risultati microdisegni a un&#39;organizzazione riproducibile del reticolo di actina grazie al posizionamento sistematico di contatti adesione della cellula in ogni cellula. Tale normalizzazione dell&#39;architettura intracellulare consente la quantificazione di anche piccoli effetti sul citoscheletro di actina come dimostrato in questi set di protocolli con blebbistatin, un inibitore della actina-miosina interazione.

Watch this Scientific Journal Video about Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells at JoVE.com

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Microdisegni adesivo che normalizzano architettura cellulare può essere utilizzato per aumentare la sensibilità nella rilevazione degli effetti dei farmaci, migliorare la riproducibilità e semplificare l&#39;acquisizione automatica delle immagini e analisi. Tale tecnologia andrà a beneficio della droga / siRNA test di screening, eseguite su supporti convenzionali coltura cellulare e quindi soffrono di un eccessivo cellula-cellula variabilità.

Una migliore visualizzazione e analisi quantitativa degli effetti del farmaco utilizzando cellule Micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

improved-visualization-quantitative-analysis-drug-effects-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K Views.  Grenoble, France. Microdisegni adesivo che normalizzano architettura cellulare può essere utilizzato per aumentare la sensibilità nella rilevazione degli effetti dei farmaci, migliorare la riproducibilità e semplificare l'acquisizione automatica delle immagini e analisi. Tale tecnologia andrà a beneficio della droga / siRNA test di screening, eseguite su supporti convenzionali coltura cellulare e quindi soffrono di un eccessivo cellula-cellula variabilità.

Video: Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Superfici Micropatterned per studiare le interazioni acido ialuronico con le cellule tumorali

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Ricerca

Bioingegneria

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

Fabbricazione di idrogel Micropatterned per i sistemi Cultura neurali utilizzando Dynamic Fotolitografia proiezione Mask

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

Stretching celle micropatterned su una membrana PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: L&#39;ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Gene Transfection verso Celle sferoide su lastre micropatterned coltura per trapianto di cellule geneticamente modificati

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​Targeting

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Chiarificazione primaria del fluido di coltura cellulare raccolto da CHO utilizzando un separatore acustico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...