Die vorliegenden Studien sind von National Heart, Lung, and Blood Institute Stipendium R01-HL0921, R01-DK083385 und R01-HL098294 HK Eltzschig, die 1K08HL102267-01 bis T. Eckle und Stiftung für Anästhesie Bildung und Forschung Zuschüsse an T. unterstützt Eckle und HK Eltzschig und American Heart Association Grant T. Eckle und HK Eltzschig und eine Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Forschungsstipendium an M. Koeppen. Wir bedanken uns bei Shelley Eltzschig für das Kunstwerk.

Allgemeine Bemerkungen: Alle Arbeiten sind unter einer aufrechten Präpariermikroskop (Olympus, SZX10 mit Z-Axis Crank Post mit STU2 StandBoom Stand) durchgeführt werden und mit Hilfe eines chirurgischen Koagulator. Ventilation ist von entscheidender Bedeutung für das Verfahren und damit eine gewisse Zeit sollte bei der Auswahl des Ventilators und der Optimierung der Lüftungstechnik ausgegeben werden. Temperatur, Blutdruck und Anästhesie sollte stabil sein ganz. 1. Anästhesie, Intubation und Überwachung <ol><li> Verwenden Sie C57BL / 6 Mäusen, die mindestens 10 Wochen alt sind. Induce Narkose unter Verwendung von Natrium-Pentobarbital in einer Dosierung von 70 mg / kg Körpergewicht ip Pflege Anästhesie mit ca. 10 mg / kg / h Natrium-Pentobarbital. Seien Sie vorsichtig mit einer Überdosierung, da diese deutlich geringere könnte den Blutdruck. Re-Dosierung von Pentobarbital - auch nach Stunden-können zu schweren Anstieg der Plasmaspiegel führen. Basierend auf einer starken Beweise für Isofluran als kardioprotektive Verbindung empfehlen wir die Verwendung des &quot;inert&quot; und etablierte Pentobarbital in ein Modell für Myokardischämie 46-56. </li><li> Legen Mäusen auf eine Temperatur gesteuerte beheizte Tisch (RT, Effenberg, München, Deutschland) mit einer rektalen Sonde Thermometer an thermischer Rückführung Steuerung der Körpertemperatur bei 37 ° C zu halten </li><li> Nach Narkoseeinleitung sichere Mäuse in Rückenlage, mit den oberen und unteren Extremitäten an den Tisch mit einem Klebeband und eine Naht befestigt zu den Knöcheln. Machen Sie dasselbe für den Kopf durch die Zähne. Eine ausreichende einstweilige ist für eine erfolgreiche Intubation und gut kontrollierte Chirurgie wichtig. Vor der Operation, decken Sie die Maus mit Mineralöl, das Risiko der Maus Haare Allergien zu reduzieren. </li><li> Expose der Luftröhre operativ und führen Sie eine Intubation mit bluntpolyethylene Kanülen (Insyte 22g, Beckton Dickinson, USA). Sie müssen die Nadel stumpf in der Lage sein, sie als Mandrin verwenden. </li><li> Ziehen Sie die Zunge heraus mit einer Pinzette und dann vorsichtig in einem 15-Grad-Winkel zum Körper hin. Auch nach der Exposition der Luftröhre und mit Hilfe eines Mikroskops kann dafür eine Ausbildung. Seien Sie sich bewusst, dass eine kleine Beschädigung der Luftröhre kann die Unfähigkeit, das Tier während der Naht lüften führen. Also, wenn Sie stoßen Atemwegsprobleme überprüfen die Luftröhre für kleine Löcher. </li><li> Überprüfen Sie die korrekte Tubuslage durch direkte Visualisierung der Kanüle in der Luftröhre zuvor ausgesetzt über dem carina. </li><li> Verbinden Sie den Schlauch an ein Beatmungsgerät. Wir empfehlen einen Druck kontrollierte Lüftung Technik mit einem Servo 900 C von Siemens (DRE Veterinary, USA). Die Tiere werden dann belüftet mit inspiratorischen Spitzendruck von 10 mbar, Frequenz von 110 Atemzügen / min und einem positiven endexspiratorischen Druck von 3-5 mbar mit einer FiO 2 = 0,4 sein. Einstellungen Möglicherweise müssen einige Anpassungen, die am leichtesten, indem der Lunge beim offenen Thorax Chirurgie erreicht werden kann. Stellen Sie sicher, dass die Lunge nicht zusammengebrochen oder überfordert. Trotz der Tatsache, dass die Servo 900 C als Beatmungsgerät für Menschen gebaut ist, funktioniert die Verwendung in einem Druck gesteuerter Lüfter Einstellung für die Lüftung von Mäusen ausgezeichnet. </li><li> Führen Blutgasanalyse zur normalen Gasaustausch (Sauerstoff-Partialdruck, paO 2 von 115 ± 15 mmHg und Partialdruck von Kohlendioxid, paCO 2 von 38 ± 6 mmHg) nach 4 bis 6 Stunden Ablüftzeit mit dem i-STAT bestätigen System (Abbott, USA). </li><li> Überwachen der Herzfrequenz mit einem EKG (zB Hewlett Packard, Böblingen, Deutschland). Stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz nicht unter 450 sinken. Wenn die Maus entwickelt bradicardia überprüfen Sie die Temperatur und die Narkose-Dosis / Konzentration. Xylacin / Ketamin Anästhesie induziert eine herz von 250 / min und wird daher nicht empfohlen. </li><li> Tragen Sie eine geeignete Flüssigkeit ersetzt werden. Eine Infusion mit Kochsalzlösung 0,1 ml / Stunde über einen arteriellen und venösen Katheter vor dem Einsetzen der Ischämie durchgeführt werden soll. Auch könnte eine Kochsalzlösung Bolus von 500 ul gegeben ip vor der Operation sein. Thorakotomie kann zu einer Senkung des Blutdrucks und kann zusätzliche Kochsalzlösung boli erfordern. Nach Ischämie, könnte eine Infusionsrate von bis zu 1 ml / h notwendig sein, einen mittleren arteriellen Blutdruck über 60 mmHg zu halten und eine ausreichende Reperfusion entscheidend für Infarkt Färbung mit TTC garantieren. </li><li> Legen Sie eine Halsschlagader (PE10, Tip OD (mm / &quot;), Tapered&gt; 0,024 mm/.011&quot;) für die kontinuierliche Aufzeichnung des Blutdrucks. Die Halsschlagader wird über stumpfe Präparation der paratracheal Muskeln ausgesetzt werden. Nach weiteren Exposition und sorgfältiger Vermeidung jeglicher Traumatisierung des Gewebes (insbesondere des Nervus vagus), wird ein Katheter in das Gefäß mit zwei Nähten und einer kleinen Klemme gesteckt. Befestigen Sie den Arm an den Körper, bevor Sie sezieren die Arterie zu starten. Dies legt ein längeres Stück der Arterie. Knot ganz am Ende des proximalen Teils der Halsschlagader. Bringen Sie eine größere Klammer an das Ende des Fadens zuerhalten Spannung. Stellen Sie ein weiteres Naht um die Arterie und sezieren die Arterie, die sehr distalen Ende. Hier legen einer kleinen Klemme. Verwenden Sie Mikro-Schere, eine kleine diagonale Öffnung in der Arterie geschnitten. Halten Sie die Öffnung mit einer feinen Pinzette (Dumont, WPI) und vorher die richtige Größe Katheter mit den Händen / Pinzette. Machen Sie einen Knoten mit dem zweiten Faden und sichern die Arterie. Lösen Sie die Klemme und vorab den Katheter weiter. Sichern Sie den Katheter mit mehreren Knoten und Band. </li></ol> 2. Technik der Okklusion <ol><li> Präparieren Sie die Haut und setzen den linken Thoraxwand mit einem stumpfen Dissektionstechnik. </li><li> Schneiden Sie die Muskeln Brustmuskeln Majors und Jugendlichen in der Thoraxwand mit einem Brenneisen aussetzen. Durch Ziehen des Pectoralis major, fällt die Lunge, wodurch eine Zange aus dem HF-Gerät kann eingesetzt werden, und, 1-3 mm oberhalb der Lunge, eine horizontale Linie über den Rippen koaguliert werden sollte. </li><li> Durch die Verwendung einer stumpfen Schere, schneiden Sie die Thoraxwand. Geändert Sicherheitsnadeln, wo der Fang Platte entfernt und ist das stumpfe Ende gebogen ist, werden dann zu halten, den Brustkorb zu öffnen. </li><li> Zur Erleichterung der endgültigen Platzierung der Naht, gerinnen und schneiden Sie die Thoraxwand entlang der Membran in Richtung der unteren linken Seite des Brustkorbs. </li><li> Expose das Herz durch Sezieren des Perikards. Um zu vermeiden, Zwerchfell-Bewegungen und den Abbau des Nervus phrenicus. </li><li> Mit einem kleinen nassen Wattestäbchen mit einer Zange und drehen Sie das Herz auf der rechten Seite. Identifizieren Sie die linke Koronararterie (LCA) und stellen Sie sicher, dass die Lungen nicht zu aufgeblasen. Optimieren Sie die Öffnung des Thorax, um einen sicheren Halt des Herzens haben bei der Platzierung der Naht. Wenn der Blutdruck zu niedrig ist die Identifizierung könnte kompliziert werden. Zusätzliche Boli von Kochsalzlösung verbessern könnte Identifizierung der LCA. Die LCA ist eine leuchtend rote Schiff überquert das Herz horizontal (im Gegensatz zu den wiederkehrenden Venen). Manchmal ist die LCA am besten ohne ein Mikroskop gesehen. Verwenden Sie nicht zu viel Licht. Dies kann zu Reflexionen machen Visualisierung unmöglich zu trennen. </li><li> Sobald das LCA visuell identifiziert wird, statt einer 8,0 Nylonfaden (Prolene, Ethicon, Notiefies, USA) um die LCA. Für die Zwecke der intermittierenden LCA Okklusion, haben wir eine chronische Modell der Kardiomyopathie 42 unter Verwendung einer hängenden Gewichts-System. </li><li> Thema der Naht durch ein kleines Stück Plastik (PE-10-Schlauch) mit stumpfen Kanten und befestigen Sie zwei kleine Gewichte (1g, z. B. die Verwendung Eppendorf-Röhrchen mit Wasser gefüllt) an jedem Ende. Mit dem frei hängenden Gewichte über eine Stange, sollte der LCA sofort verschlossen werden. Darüber hinaus, wenn das Gewicht entlastet wird, ist LCA Okklusion auf einmal beendet. Erfolgreiche LCA Okklusion sollte durch eine sofortige Farbänderung des Schiffes von hellrot bis dunkel violett, Veränderung der Farbe des Herzmuskels durch das Schiff (von hellrot bis weiß) und das Vorhandensein von ST-Erhebungen im EKG geliefert bestätigt werden. Während der Reperfusion, die Änderungen der Farbe sofort verschwinden. Halten Sie das Herz nass mit einem 37 ° C, Kochsalzlösung getränkt, ein Stück Watte in (siehe auch Abbildung 1). </li><li> Wählen Sie Ihre Ischämiezeit nach Ihrem primären Interesse. In der Tat, für Studien über kardioprotektive Wirkung von IP, wäre es ideal, eine Ischämie zu Zeit mit einem in Infarktgrößen von ca. 30 bis 40% der AAR verbundenen verwenden. So wäre es möglich, Änderungen in beide Richtungen, z. B. kleinere Infarktgrößen mit Herz-IP oder größer Infarktgrößen mit einem experimentellen therapeutischen oder ein bestimmtes Gen Löschung zu demonstrieren. Darüber hinaus Mäuse mit einer Infarktgröße von weniger als 50% in der Regel überleben den Versuch, während Infarkt Größen von 60 bis 80% häufig nicht überlebt haben und die Tiere sterben, bevor der Reperfusion Zeit abgeschlossen ist. Mit unserem Modell 10 Minuten einer Myokardischämie durch 2 Stunden Reperfusion führen zu einer Infarktgröße von 3,5 ± 1,3%, gefolgt von der AAR. Im Gegensatz dazu eine Ischämie von 60 Minuten ergibt eine mittlere Infarktgröße von 42 ± 5,2% der AAR (p &lt;0,01) 39. So betrachten wir eine 60 Minuten der Ischämie als ideal, um Änderungen in beide Richtungen zu studieren. Dennoch müssen Sie eventuell die Ischämiezeit in Gen gezielt Mäuse einrichtet mit einem sever Phänotyp. </li><li> Wählen Sie die richtige Reperfusion Zeit. Die Reperfusion Zeit ist von entscheidender Bedeutung für die TTC-Färbung. Die farblosen Farbstoff ist ein Backstein-rot gefärbten Niederschlag durch Dehydrogenasen in der Gegenwart des Co-Enzym NADH reduziert. Absterbenden Zellen verlieren ihre Fähigkeit, NADH und sind daher als blasse Bereiche innerhalb der rot gefärbten vitales Myokard abgegrenzt bleiben. Infarktgröße Abgrenzung von TTC setzt voraus, dass NADH wurde vollständig von den nekrotischen Bereich gewaschen. Allerdings, wenn Reperfusion nicht lang genug ist, kann die Infarktgröße Abgrenzung von TTC-Färbung in einer Unterschätzung der tatsächlichen Infarktgröße 43 Resultat. In unseren Händen, nach einer Ischämiezeit von 60 min, die Infarktgröße Messung von 11,5 ± 4,5% gestiegen nach 30 Minuten auf 42,2 ± 5,1%nach 120 Minuten. Kein weiterer Anstieg der Infarktgröße konnte mit mehr Reperfusion Zeiten (240 Minuten) 39 nachgewiesen werden. So haben wir eine 2-stündige Reperfusion Zeitraum, scheint auch im Rahmen der kardialen Enzyme determination.If man bedenkt, Ischämie Vorkonditionierung angemessenen empfehlen, empfehlen wir 4 Zyklen von IP (5 min Ischämie, 5 min Reperfusion), gefolgt von einer Ischämiezeit von 60 min und einer Reperfusion von 2 Stunden. Unter diesen Bedingungen war IP mit einem 3,2-fachen Reduktion der Infarktgröße von 42,2 ± 5,1% auf 13,3 ± 3,3% der AAR 39 zugeordnet. Aufgrund der hängenden Gewichts-System könnten verschiedene Vorkonditionierung Regimenter leicht angewendet werden. </li></ol> 3. Bestimmung der Fläche At Risk (AAR) und Myokardinfarkt Größe Nach der Induktion eines Myokardinfarktes (mit oder ohne IP), ist der Bereich von der LCA (gefährdete Gebiet, AAR) und die Größe des Infarktes selbst bestimmt mit einer Maltechnik wird durchblutet. Anschließend wird Infarkt dann als Prozentsatz des Myokardinfarkts im Vergleich zu den AAR berechnet werden. Um dies zu tun, ist eine zuvor beschriebene Doppel-Maltechnik mit blauen und Triphenyltetrazoliumchlorid Evans (TTC) 44 verwendet. <ol><li> Bestimmen Sie die AAR durch retrograde Injektion von 1% blauen Farbstoff Evans in die Aorta während der LCA ist verschlossen. Alternativ, wenn ein Katheter in carotis Ort ist, verwenden Sie diese Route für Evans-Blau-Injektion. Evans-Blau färbt alle Herzmuskelgewebe blau, mit Ausnahme der AAR. Es ist entscheidend für diesen Schritt, um Luftblasen im Katheter zu vermeiden, wie sie in das Herz-Kreislauf injiziert würde und verhindern, dass Evans-Blau-Färbung. Vor der Evans-Blau-Färbung möchten Sie vielleicht Blut für Herz-Enzym-Messungen zu sammeln. Darüber hinaus ist die Entfernung von Blut durch die Injektion von 5 ml Kochsalzlösung über einen Aorten-oder carotis Katheter empfohlen. </li><li> Excise Herzen und waschen in eiskaltem 0,9% iger Kochsalzlösung </li><li> Embed in 2% Agarose. Verwenden Sie kein heißes Agarose seit dieser erfolgreichen Färbung verhindern. </li><li> Nach 30 Minuten bei +4 ° C (oder 15 Minuten -20 ° C), schneiden das Herz in Scheiben von 1 mm unter Verwendung einer Herz-Matrix oder Mikrotom. Wenn Sie das Herz in den Gefrierschrank Platz zu vermeiden trocken Einfrieren, die nicht gefärbt Herzen führen wird. </li><li> Inkubieren Sie die Schnitte mit 1% TTC bei 37 ° C für 10 min mit einer 15 ml blaue Kappe in einem Wasserbad. Dies ermöglicht dem Infarktareal als eine weiße Fläche abgegrenzt werden, während lebensfähiges Gewebe Flecken rot. </li><li> Fixieren Sie die bunten Scheiben mit 10% fomaldehyde über Nacht. Dadurch ist die Infarktareal besser kontrastiert die Verbesserung der Qualität der Bilder. </li><li> Die Fläche at-Risk (AAR) und der Infarktgröße mittels Planimetrie mit der NIH-Software-Image 1,0 45. </li><li> Berechnen Sie den Prozentsatz der Infarktareal aus dem Bereich gefährdet. </li></ol> 4. Cardiac Enzyme Measurement Aufgrund von Einschränkungen mit TTC-Färbung verbunden, empfehlen wir als zusätzliche Anzeige für Herzinfarkt Schwere der Bestimmung von kardialem Troponin I (cTnI) im Serum von Mäusen. Das Blut wird aus der Pfortader und Serum cTnI Werte erhalten werden dann mit einer schnellen quantitative cTnI-Assay (Life Diagnostics, Inc., West Chester, PA, USA) bestimmt. 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2526/2526fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. (A) Modell der kardialen IP mit einem hängenden Gewicht System der koronaren Okklusion. Diese Technik erfordert nicht einen Knoten für Koronarokklusion. (B, C) Chirurgische Setup. (D) Bild von einer Maus Herz mit der linken Koronararterie (LCA, Pfeile) nach Okklusion. Visuelle Überprüfung der LCA ist notwendig für die Ligation und ischämische Präkonditionierung in Mäusen. Der 8,0 Nylonfaden ist rund um die LCA 1-2 mm unterhalb der linken Ohrmuschel platziert. Die Naht wird durch einen kleinen Plastikschlauch (*) eingefädelt. Das Ende jeder Naht mit einem kleinen Gewicht (1g) angebracht ist und die Naht wird über Stangen auf beiden Seiten platziert. (E) Bestimmung der AAR nach LCA Okklusion und retrograde Injektion von blauem Farbstoff Evans in die Aorta. Die AAR ungefärbt bleibt, während der Rest des Herzmuskels ist blau. Nach der Inkubation von AAR Gewebe mit TTC, das Infarktareal gebeizt weiß, während lebensfähiges Gewebe rot gefärbt.

Die vorliegende Studie beschreibt eine neue Technik, bei der IP in einer intakten Mausmodell mit einem hängenden Gewicht und damit die Vermeidung einer koronaren Okklusion durch einen Knoten. In der Tat zeigt diese Studie sehr gut reproduzierbare Infarktgrößen und Herz-Schutz von IP und minimiert so die Variabilität mit Knoten-basierte Koronarokklusion Modelle verbunden. Die Ermittler, die ein Studium Kardioprotektion von IP in Mäusen überlegen können von diesem Modell profitieren.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sodium Pentobarbital (Fatal Plus)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td>
<td>V.P.L. 9372</td>
<td>4mg/mL in saline</td>
</tr>
<tr>
<td>TTC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>17779 Fluka</td>
<td>1.5 % in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Evans Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E2129</td>
<td>10g in 1 L PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Insyte 22 G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickinson</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture, silk 4.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>517698</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture, Prolene 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon, USA</td>
<td>M8739</td>
<td>reusable</td>
</tr>
<tr>
<td>Heart Matrix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zivic Instruments</td>
<td># HSMS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Siemens 900 C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DRE Veterinary, USA</td>
<td># 336</td>
<td>refurbished</td>
</tr>
<tr>
<td>dissecting microscope (SZX10 )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>n/a</td>
<td>consider generous working distance</td>
</tr>
<tr>
<td>Heating Table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rt, Effenberger, Germany</td>
<td>n/a</td>
<td>only and single provider</td>
</tr>
<tr>
<td>Blood pressure device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cyber Sense, Inc</td>
<td>BPM02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I STAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abbott</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

use of a hanging weight system for coronary artery occlusion in mice

Murine Studien zur akuten Verletzungen sind ein Gebiet intensiver Untersuchung, als Knockout-Mäusen für verschiedene Gene immer sind zunehmend 1-38. Kardioprotektion durch ischämische Präkonditionierung (IP) ist ein Gebiet intensiver Untersuchungen. Zur weiteren Aufklärung der molekularen Basis, ist der Einsatz von Knockout-Maus-Studien besonders wichtig, 7, 14, 30, 39. Trotz der Tatsache, dass frühere Studien haben bereits erfolgreich kardialen Ischämie und Reperfusion in Mäusen durchgeführt, ist dieses Modell technisch sehr anspruchsvoll. Insbesondere ist die visuelle Identifizierung der Koronararterie, die Platzierung der Naht um das Schiff und koronaren Okklusion durch Abbinden des Gefäßes mit einem unterstützten Knoten technisch schwierig. Darüber hinaus fügt Neueröffnung der Knoten für den intermittierenden Reperfusion der Koronararterien bei IP ohne chirurgischen Traumas zusätzliche Herausforderung. Darüber hinaus kann, wenn der Knoten nicht nach unten stark genug ist, unbeabsichtigte Reperfusion durch mangelhafte Verschluss der Koronararterien gebunden Einfluss auf die Ergebnisse. In der Tat kann dies leicht durch die Bewegung des schlagenden Herzens auftreten. Basierend auf mögliche Probleme bei der Verwendung einer verknoteten koronaren Verschluss-System verbunden sind, haben wir einen zuvor veröffentlichten Modell der chronischen Kardiomyopathie auf ein hängendes Gewicht für intermittierende Okklusion während IP 39 zu. In der Tat kann der Okklusion somit ohne die koronare durch einen Knoten verschließen erreicht werden. Darüber hinaus kann der Reperfusion des Schiffes leicht durch die Unterstützung der hängenden Gewichte, die in einem abgelegenen Lokalisierung von Herzgewebe erreicht werden. Wir testeten dieses System systematisch, einschließlich Variation der Ischämie und Reperfusion Zeiten Vorkonditionierung Regimenter, die Körpertemperatur und genetischen Hintergründen 39. Neben Färbung Infarkt, testeten wir Troponin I (cTnI) als Marker für Myokardinfarkt in diesem Modell. In der Tat, die Plasmaspiegel von cTnI mit Infarktgrößen (R2 = 0,8) korreliert. Schließlich konnten wir in mehreren Studien zeigen, dass diese Technik sehr gut reproduzierbare Infarktgrößen Ausbeuten bei murine IP und Myokardinfarkt 6, 8, 30, 40, 41. Daher kann diese Technik hilfreich sein für Forscher, die molekularen Mechanismen in Kardioprotektion von IP mit einem genetischen Ansatz in Mäusen mit gezielter Gendeletion beteiligt zu verfolgen. Weitere Studien über Herz-IP mit Hilfe transgener Mäuse können dieses Verfahren.

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Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

Ein Mausmodell für Myokardischämie und ischämische Präkonditionierung ist ein wichtiges Instrument Studie kardioprotektive Mechanismen<em&gt; In vivo</em&gt;. Hier berichten wir über eine einfach anwendbare<em&gt; In situ</em&gt; Modell für kardiale IP mit einem hängenden Gewicht für Okklusion.

Die Verwendung eines Hanging Weight System für Okklusion in Mäuse

Murine studies of acute injury are an area of intense investigation, as knockout mice for different genes are becoming increasingly available 1-38. ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

21.5K Aufrufe.  University of Colorado Denver. Ein Mausmodell für Myokardischämie und ischämische Präkonditionierung ist ein wichtiges Instrument Studie kardioprotektive Mechanismen In vivo. Hier berichten wir über eine einfach anwendbare In situ Modell für kardiale IP mit einem hängenden Gewicht für Okklusion.

Serie: Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Modeling Stroke in Mice - Middle Zerebralarterie mit dem Filament-Modell

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Forschung

Medizin

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

Die Verwendung eines Hanging-weight-System für Isolated Nierenarterie Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and can result in liver failure which has a high mortality rate1-2. Therefore murine studies of hepatic ischemia have become an important field of research by providing the opportunity to utilize pharmacological and genetic studies3-9. Specifically, conditional mice with tissue specific deletion of a gene (cre, flox system) provide insights into the role of proteins in particular tissues10-13 . Because of the technical difficulty associated with manually clamping the portal triad in mice, we performed a systematic evaluation using a hanging-weight system for portal triad occlusion which has been previously described3. By using a hanging-weight system we place a suture around the left branch of the portal triad without causing any damage to the hepatic lobes, since also the finest clamps available can cause hepatic tissue damage because of the close location of liver tissue to the vessels. Furthermore, the right branch of the hepatic triad is still perfused thus no intestinal congestion occurs with this technique as blood flow to the right hepatic lobes is preserved. Furthermore, the portal triad is only manipulated once throughout the entire surgical procedure. As a result, procedures like pre-conditioning, with short times of ischemia and reperfusion, can be easily performed. Systematic evaluation of this model by performing different ischemia and reperfusion times revealed a close correlation of hepatic ischemia time with liver damage as measured by alanine (ALT) and aspartate (AST) aminotransferase serum levels3,9. Taken together, these studies confirm highly reproducible liver injury when using the hanging-weight system for hepatic ischemia and intermittent reperfusion. Thus, this technique might be useful for other investigators interested in liver ischemia studies in mice. Therefore the video clip provides a detailed step-by-step description of this technique.

We established a novel murine model of a hanging weight system for portal triad occlusion. This technique may be useful for future investigations of ischemia in murine hepatic models.

Die Verwendung eines Hanging-Gewicht-System für Leberischämie in Mäuse

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Geändert Technik für Coronary Artery Ligation in Mäuse

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Optimierte System for Cerebral Perfusion Überwachung im Rat Stroke Modell Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Halsschlagader Infusionen für pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Analyse von Taxanen in Mäusen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure.
Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload. Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion. In contrast, the infarct area at 24 hr after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.
Besides the model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery, the technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented in detail.

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

Permanent Ligation des linken vorderen absteigenden Koronararterie bei Mäusen: Ein Modell der Post-Myokardinfarkt Umbau und Herzinsuffizienz

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Ultraschall Basierend Beurteilung der koronaren Herzfluss und koronare Flussreserve Mit der Drucküberlastung Modell an der Maus

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Surgical Approach for Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion Induced Stroke in Mice

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ischemic in origin and occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA). Currently the only Food and Drug Administration (FDA) approved drug for the treatment of this devastating disease is tissue plasminogen activator (tPA). However, tPA has a small therapeutic window for administration (3 - 6 hr), and is only effective in 4% of the patients who actually receive it. Current research focuses on understanding the pathophysiology of stroke in order to find potential therapeutic targets. Thus, reliable models are crucial, and the MCA occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) is deemed to be the most clinically relevant surgical model of ischemic stroke, and is fairly non-invasive and easily reproducible. Typically the MCAo model is used with rodents, especially with mice due to all the genetic variations available for this species. Here we describe (and present in the video) how to successfully perform the MCAo model (with reperfusion) in mice to generate reliable and reproducible data.

In order to understand the pathophysiology of stroke, it is important to use reliable models. This paper will describe one of the most frequently used stroke models in mice, termed the middle cerebral artery occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) with reperfusion.

Chirurgische Ansatz für Arteria cerebri media Occlusion und Reperfusion fokaler zerebraler Ischämie bei Mäusen

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ...

Identifying Coronary Artery Calcification on Non-gated Computed Tomography Scans

Coronary artery calcification (CAC) provides an objective measure of coronary artery disease and can readily be identified on non-gated computed tomography (CT) scans with a high correlation with gated cardiac CT scans. This standardized protocol takes a step-wise approach to not only optimizing an image for the identification of calcification but also to distinguishing CAC from other common causes of calcification in the cardiac silhouette. Recognition of CAC on non-gated CT scans helps to identify a very powerful prognostic factor that can influence therapeutic interventions or downstream diagnostic testing without requiring a gated cardiac scan. These non-gated CT scans are often acquired as part of the routine care of the patient, and this data is readily available without another dose of&#160;ionizing radiation. This protocol allows for the precise and accurate extraction of this data for the purposes of retrospective data analysis in clinical research studies, but also in the clinical evaluation and management of patients.

Here, we present a protocol to reliably and systematically identify coronary artery calcification (CAC) on non-gated computed tomography (CT) scans of the chest or abdomen. CAC provides an objective measure of coronary artery disease for both research and clinical purposes.