El presente estudio son apoyados por National Heart, Lung, and Blood Institute Grant R01-HL0921, R01-R01-DK083385 y HL098294 a HK Eltzschig, el 1K08HL102267-01 a T. Eckle, y la Fundación para la Educación Anestesia y becas de investigación de T. Eckle y HK Eltzschig, y la American Heart Association Grant T. Eckle y Eltzschig HK y Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) beca de investigación de M. Koeppen. Damos las gracias a Shelley Eltzschig de la obra de arte.

Observaciones generales: Todas las operaciones deberán realizarse bajo un microscopio de disección en posición vertical (Olympus, SZX10 con Post manivela del eje Z con soporte StandBoom STU2) y utilizando un coagulador quirúrgico. La ventilación es crítica para el procedimiento y por lo tanto, una cierta cantidad de tiempo debe ser dedicado a la elección del ventilador y la optimización de la técnica de ventilación. La temperatura, la presión arterial y la anestesia debe ser estable a lo largo. 1. Anestesia, intubación y monitoreo <ol><li> Use ratones C57BL / 6 que son al menos 10 semanas de edad. Inducir la anestesia con pentobarbital sódico a una dosis de 70 mg / kg peso corporal ip mantener la anestesia con aproximadamente 10 mg / kg / h de sodio pentobarbital. Tenga cuidado con la sobredosis ya que esto podría reducir significativamente la presión arterial. Volver a la dosis de pentobarbital - incluso después de horas-puede conducir a un aumento severo en los niveles plasmáticos. Sobre la base de pruebas sólidas en relación con el isoflurano compuesto cardioprotectora se recomienda el uso del &quot;inertes&quot; y así estableció el pentobarbital en un modelo de isquemia miocárdica 46-56. </li><li> Ratones a cabo sobre una mesa se calienta a temperatura controlada (RT, Effenberg, Munich, Alemania) con una sonda del termómetro rectal conectado a un controlador de retroalimentación térmica para mantener la temperatura corporal a 37 º C. </li><li> Después de los ratones inducción de la anestesia segura en posición supina, con las extremidades superiores e inferiores unido a la mesa con una cinta y una sutura sujeta a los tobillos. Haga lo mismo con la cabeza con los dientes. Una restricción suficiente es importante para una intubación exitosa y cirugía bien controlados. Antes de la cirugía, la cubierta del ratón con aceite mineral para reducir el riesgo de alergia del ratón de pelo. </li><li> Exponer la tráquea mediante cirugía y realizar una intubación traqueal mediante cánulas bluntpolyethylene (Insyte 22g, Beckton Dickinson, EE.UU.). Usted tendrá que mitigar la aguja para poder usarlo como un estilete. </li><li> Tirar de la lengua con un par de pinzas y presionar suavemente en un ángulo de 15 grados hacia el cuerpo. Incluso después de la exposición de la tráquea y el uso de un microscopio, lo que podría requerir algún tipo de formación. Tenga en cuenta que un pequeño daño de la tráquea podría conducir a la incapacidad para ventilar el animal a lo largo de la sutura. Por lo tanto, si tiene problemas de vías respiratorias comprobar la tráquea para agujeros pequeños. </li><li> Confirmar la colocación correcta del tubo mediante la visualización directa de la cánula en la tráquea anteriormente expuesto encima de la carina. </li><li> Conecte el tubo a un ventilador. Se recomienda una técnica de ventilación con presión controlada mediante el uso de un Servo 900 C de Siemens (DRE Veterinaria, EE.UU.). Animales será ventilado con presión inspiratoria máxima de 10 mbar, la frecuencia de 110 respiraciones / min y una presión espiratoria final positiva de 5.3 mbar con una FiO 2 = 0,4. Configuración puede ser que necesite algunos ajustes que se pueden lograr más fácilmente mediante la comprobación de los pulmones durante la cirugía de tórax abierto. Asegúrese de que los pulmones no se contraen o extendido. A pesar del hecho de que el Servo 900 C es construido como ventilador para los seres humanos, su uso en un entorno de presión del ventilador controlado excelentes trabajos para la ventilación de los ratones. </li><li> Realizar un análisis de gases en sangre para confirmar el intercambio de gases normales (presión parcial de oxígeno, la PaO 2 de 115 ± 15 mmHg y la presión parcial de dióxido de carbono, la PaCO 2 de 38 ± 6 mmHg) después de 4 a 6 horas de tiempo de ventilación con el i-STAT sistema (Abbott, EE.UU.). </li><li> Monitor de ritmo cardíaco con un electrocardiograma (por ejemplo, Hewlett Packard, Böblingen, Alemania). Asegúrese de que la frecuencia cardiaca no baja por debajo de 450. Si el ratón desarrolla bradicardia comprobar la temperatura y la dosis de anestesia / concentración. Xylacin / ketamina induce anestesia el corazón del corazón de 250 / min y por lo tanto no se recomienda. </li><li> Aplicar una adecuada reposición de líquidos. Una infusión de solución salina normal 0,1 ml / hora a través de un catéter arterial o venosa debe realizarse antes del inicio de la isquemia. Además, un bolo de solución salina de 500 l se podría dar ip antes de la cirugía. Thoractomy puede inducir una caída de la presión arterial y puede requerir bolos de solución salina adicional. Después de la isquemia, una velocidad de infusión de hasta 1 ml / hora podría ser necesario para mantener una presión arterial media por encima de 60 mmHg y para garantizar una reperfusión crítica suficiente para la tinción del infarto utilizando TTC. </li><li> Lugar de la arteria carótida (PE10, Consejo OD (mm / &quot;), rebajados&gt; 0.024 mm/.011&quot;) para el registro continuo de la presión arterial. La arteria carótida se expone a través de una disección roma de los músculos paratraqueales. Después de la exposición y evitar más cuidadosa de cualquier trauma tisular (en particular del nervio vago), se inserta un catéter en el vaso con dos puntos de sutura y una pequeña abrazadera. Fije el brazo al cuerpo antes de comenzar la disección de la arteria. Esto expondrá una pieza más de la arteria. Nudo al final de la parte proximal de la arteria carótida. Coloque una pinza más grande hasta el final de la suturaobtener la muestra. En otro lugar de sutura alrededor de la arteria y la disección de la arteria hasta el final distal. Aquí, el lugar una pequeña abrazadera. Use las tijeras micro a un pequeño corte diagonal en la arteria. Mantener la apertura con una pinza fina (Dumont, IPM) y el catéter de tamaño adecuado con las manos / pinzas. Hacer un nudo con su segunda sutura y seguro de la arteria. Afloje la abrazadera y el catéter más. Asegure el catéter con varios nudos y cinta adhesiva. </li></ol> 2. La técnica de oclusión de la arteria coronaria <ol><li> Disección de la piel y exponer la pared del tórax izquierdo utilizando una técnica de disección roma. </li><li> Corte de las aletas pectorales músculos mayores y menores para exponer la pared del tórax con un cauterio. Al tirar del pectoral mayor, el de pulmón disminuye, con lo que una pinza de la unidad electroquirúrgica se puede insertar, y, de 1-3 mm por encima del de pulmón, una línea horizontal cruzando la rompe debe ser coagulada. </li><li> Mediante el uso de una tijera embotada, corte la pared del tórax. Modificar los pernos de seguridad, donde se extrae la placa de captura y el extremo romo se inclinó, se utilizan para mantener el tórax abierto. </li><li> Para facilitar la colocación final de la sutura, coagular y cortar la pared del tórax a lo largo del diafragma hacia la parte inferior izquierda del tórax. </li><li> Exponer el corazón mediante la disección del pericardio. Para evitar los movimientos del diafragma quitar y cortar el nervio frénico. </li><li> Utilice un palillo de algodón humedecido con una pinza y volver el corazón hacia el lado derecho. Identificar la arteria coronaria izquierda (LCA) y asegúrese de que los pulmones no están demasiado inflados. Optimizar la apertura del tórax para tener un agarre seguro del corazón al colocar la sutura. Si la presión arterial es demasiado baja, la identificación podría ser complicado. Bolos adicionales de solución salina puede mejorar la identificación de la LCA. El LCA es un recipiente de color rojo brillante cruzar el centro horizontal (a diferencia de las venas regresan). A veces, el ACV es mejor ver sin un microscopio. No utilice demasiada luz. Esto puede llevar a romper reflexiones haciendo imposible la visualización. </li><li> Una vez que el LCA se identifica visualmente, coloque una sutura de nylon 8,0 (Prolene, Ethicon, Notiefies, EE.UU.), alrededor de la LCA. A los efectos de la oclusión intermitente LCA, hemos adoptado un modelo de crónica de miocardiopatía 42 mediante un sistema de peso que cuelga. </li><li> Hilo de la sutura a través de un pequeño trozo de tubo de plástico (PE-10 tubos) con bordes romos y adjuntar dos pequeñas pesas (1 g, por ejemplo, utilizar tubos Eppendorf lleno de agua) a cada extremo. Con los pesos que cuelgan libremente sobre una barra, el ACV debe ser inmediatamente obstruida. Además, cuando el peso se alivia, LCA oclusión se termina a la vez. El éxito de la oclusión del ACV deben ser confirmados por un cambio de color inmediata del buque de la luz roja de color violeta oscuro, el cambio de color del miocardio proporcionados por la nave (de color rojo brillante y blanco) y la presencia de elevación del ST en el ECG. Durante la reperfusión, los cambios de color al instante desaparecen. Mantener el corazón en húmedo con un 37 ° C, solución salina pieza empapado, de algodón absorbente, a través de (véase también la figura 1). </li><li> Elija su tiempo de isquemia, según su principal interés. De hecho, para los estudios de los efectos cardioprotectores de la IP, lo ideal sería utilizar un tiempo de isquemia asociada con un infarto en tamaños de 30 a 40% de la AAR. Por lo tanto, sería posible demostrar los cambios en ambas direcciones, por ejemplo, de menor tamaño del infarto cardíaco o con IP de mayor tamaño del infarto con una terapia experimental o una deleción del gen específico. Además, los ratones con el tamaño del infarto de menos de 50% suele sobrevivir el experimento, mientras que el tamaño del infarto de 60 a 80% son a menudo no sobrevivieron y los animales mueren antes de la hora de reperfusión se ha completado. Utilizando nuestro modelo de 10 minutos de isquemia miocárdica seguido de 2 horas de reperfusión en el resultado de un tamaño del infarto de 3,5 ± 1,3% de la AAR. Por el contrario, un tiempo de isquemia de 60 minutos los resultados en un tamaño del infarto media de 42 ± 5,2% de la AAR (p &lt;0,01) 39. Por lo tanto, consideramos que una de 60 minutos de isquemia como ideal para estudiar los cambios en ambas direcciones. Sin embargo, es posible que tengas que ajustar el tiempo de isquemia en los ratones de genes específicos con un fenotipo cortar. </li><li> Elija el tiempo de reperfusión derecha. El tiempo de reperfusión es de vital importancia para la tinción de TTC. El tinte incoloro se reduce a un precipitado de color rojo ladrillo de color por deshidrogenasas en la presencia de la coenzima NADH. Muerte de las células pierden su capacidad de retener el NADH y, por tanto, se delinean en áreas pálidas en el miocardio viable teñidas de rojo. Delimitación tamaño del infarto por TTC requiere que el NADH se ha lavado por completo de la zona necrótica. Sin embargo, si la reperfusión no es lo suficientemente largo, la delimitación del tamaño del infarto por tinción con TTC puede resultar en una subestimación del tamaño del infarto actual 43. En nuestras manos, después de un tiempo de isquemia de 60 minutos, la medición del tamaño del infarto aumentó de 11,5 ± 4,5% después de 30 minutos a 42,2 ± 5,1%después de 120 minutos. No hay aumento en el tamaño del infarto podría ser detectada con más tiempo de reperfusión (240 minutos) 39. Por lo tanto, se recomienda un período de 2 horas de reperfusión, que parece también razonable en el contexto de determination.If enzimas cardíacas se tiene en cuenta la isquemia pre-acondicionamiento, recomendamos 4 ciclos de IP (5 min de isquemia, 5 min de reperfusión), seguido por un tiempo de isquemia de 60 min y un tiempo de 2 horas de reperfusión. En estas condiciones, IP se asoció con una reducción de 3,2 veces del tamaño del infarto del 42,2 ± 5,1% a 13,3 ± 3,3% de la AAR 39. Sin embargo, debido al sistema de peso que cuelga, diferentes regimientos preacondicionamiento podría aplicarse fácilmente. </li></ol> 3. Determinación de la zona de riesgo (AAR) y el tamaño del infarto de miocardio Después de la inducción de un infarto de miocardio (con o sin IP), la zona es perfundida por la ACI (zona de riesgo, AAR) y el tamaño del infarto en sí se determinará mediante una técnica de tinción. Posteriormente, el infarto luego se calculará como porcentaje de infarto de miocardio en comparación con el AAR. Para ello, una técnica descrita anteriormente doble tinción con cloruro de azul y trifeniltetrazolio Evan (TTC) se utiliza 44. <ol><li> Determinar el AAR por inyección retrógrada de Evans colorante azul al 1% en la aorta, mientras que el LCA se ocluye. Por otra parte, si un catéter carótida en su lugar, utilizar esta ruta para Evans inyección azul. Azul de Evans se mancha todo azul tejido miocárdico, con excepción de la AAR. Es de suma importancia para este paso para evitar burbujas de aire dentro del catéter, ya que se inyecta en la circulación coronaria y prevenir las manchas azul de Evans. Antes de la tinción de azul de Evans es posible que desee tomar muestras de sangre para la medición de enzimas cardíacas. Además, la extracción de sangre mediante la inyección de 5 ml de solución salina a través de un catéter o la aorta carótida se recomienda. </li><li> Los impuestos especiales del corazón y de lavado en frío de hielo solución salina al 0,9% </li><li> Insertar en agarosa al 2%. No utilice calor de agarosa ya que esto evitar que se manchen con éxito. </li><li> Después de 30 minutos a 4 ° C (o 15 minutos -20 ° C), cortar el corazón en rodajas de 1 mm utilizando una matriz de corazón o de microtomo. Si usted pone el corazón en el congelador evitar la congelación en seco, que implicará el corazón manchado. </li><li> Incubar las rebanadas con un 1% TTC a 37 ° C durante 10 minutos usando una gorra azul de 15 ml en un baño de agua. Esto permitirá que el área infartada a delimitar como una zona blanca, mientras que las manchas de tejido viable rojo. </li><li> Fijar los cortes teñidos con un 10% fomol durante la noche. De esta manera, el área del infarto es mejor contraste para mejorar la calidad de las imágenes. </li><li> Determinar el área en riesgo (AAR) y el tamaño del infarto mediante planimetría con el NIH software Image 1.0 45. </li><li> Calcular el porcentaje de infarto de miocardio de la zona de riesgo. </li></ol> 4. La medición de enzimas cardíacas Debido a las limitaciones asociadas con la tinción de TTC se recomienda la lectura como adicional de la gravedad del infarto de miocardio a la determinación de la troponina I (cTnI) los niveles en el suero de los ratones. La sangre se extrae de la vena porta y los niveles séricos de cTnI se determinan con un ensayo cuantitativo rápido cTnI (Life Diagnostics, Inc., West Chester, PA, EE.UU.). 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2526/2526fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) Modelo de IP cardíaco utilizando un sistema de suspensión-el peso de la oclusión coronaria. Esta técnica no requiere de un nudo de la oclusión coronaria. (B, C) instalación quirúrgica. (D) de la imagen de un corazón murino con la arteria coronaria izquierda (LCA, flechas) después de la oclusión. La identificación visual de la LCA es necesario para la ligadura y el precondicionamiento isquémico en los ratones. Una sutura de nylon 8,0 se coloca alrededor del LCA 1-2 mm por debajo de la aurícula izquierda. La sutura se pasa a través de un pequeño tubo de plástico (*). El final de cada sutura se conecta a un pequeño peso (1 g) y la sutura se coloca sobre las barras de ambos lados. (E) Determinación de la AAR después de LCA oclusión y la inyección retrógrada del colorante azul de Evans en la aorta. El RPA no se tiñe, mientras que el resto del miocardio es de color azul. Después de la incubación del tejido IAA con TTC, el área blanca manchada infarto, mientras que el rojo viable tejido teñido.

El presente estudio describe una nueva técnica de realización de IP en un modelo murino intacta mediante un sistema de suspensión de peso y así evitar oclusión de la arteria coronaria por un nudo. De hecho, este estudio demuestra tamaño del infarto altamente reproducible y protección cardíaca a través de IP, lo que reduce la variabilidad asociada con un nudo modelos basados ​​en la oclusión coronaria. Los investigadores que consideran que el estudio de la cardioprotección por IP en ratones se pueden beneficiar de este modelo.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sodium Pentobarbital (Fatal Plus)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td>
<td>V.P.L. 9372</td>
<td>4mg/mL in saline</td>
</tr>
<tr>
<td>TTC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>17779 Fluka</td>
<td>1.5 % in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Evans Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E2129</td>
<td>10g in 1 L PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Insyte 22 G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickinson</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture, silk 4.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>517698</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture, Prolene 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon, USA</td>
<td>M8739</td>
<td>reusable</td>
</tr>
<tr>
<td>Heart Matrix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zivic Instruments</td>
<td># HSMS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Siemens 900 C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DRE Veterinary, USA</td>
<td># 336</td>
<td>refurbished</td>
</tr>
<tr>
<td>dissecting microscope (SZX10 )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>n/a</td>
<td>consider generous working distance</td>
</tr>
<tr>
<td>Heating Table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rt, Effenberger, Germany</td>
<td>n/a</td>
<td>only and single provider</td>
</tr>
<tr>
<td>Blood pressure device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cyber Sense, Inc</td>
<td>BPM02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I STAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abbott</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

use of a hanging weight system for coronary artery occlusion in mice

Estudios murino de lesión aguda son un área de intensa investigación, como los ratones knockout de genes diferentes se están volviendo cada vez más disponibles 1-38. Cardioprotección por precondicionamiento isquémico (PI) sigue siendo un área de intensa investigación. Para aclarar aún más su base molecular, el uso de estudios con ratones knock-out es particularmente importante 7, 14, 30, 39. A pesar de que estudios anteriores ya han realizado con éxito la isquemia cardiaca y reperfusión en ratones, este modelo es técnicamente muy difícil. En particular, la identificación visual de la arteria coronaria, la colocación de la sutura alrededor del vaso y la oclusión coronaria ate el vaso con un nudo de apoyo es técnicamente difícil. Además, la reapertura del nudo de la reperfusión intermitente de la arteria coronaria durante el período de sin causar trauma quirúrgico añade desafío adicional. Por otra parte, si el nudo no está atado fuerte reperfusión suficiente, inadvertida debido a la oclusión de la coronaria imperfecta puede afectar los resultados. De hecho, esto puede ocurrir debido al movimiento de los latidos del corazón. Sobre la base de los problemas potenciales asociados con el uso de un sistema de nudos oclusión coronaria, hemos adoptado un modelo publicado previamente de miocardiopatía crónica sobre la base de un sistema de peso que cuelga de la oclusión intermitente la arteria coronaria durante el período de 39. De hecho, la oclusión de la arteria coronaria por lo tanto se puede lograr sin necesidad de ocluir la arteria coronaria por un nudo. Por otra parte, la reperfusión del vaso se puede conseguir fácilmente mediante el apoyo a los pesos colgantes que se encuentran en una localización remota de los tejidos cardíacos. Hemos probado este sistema de forma sistemática, incluida la variación de los tiempos de isquemia y reperfusión, los regimientos de preacondicionamiento, la temperatura del cuerpo y las bases genéticas 39. Además de la tinción de infarto, hemos probado la troponina I (cTnI) como un marcador de infarto de miocardio en este modelo. De hecho, los niveles plasmáticos de cTnI correlaciona con un tamaño de infarto (R2 = 0,8). Finalmente, se pudo mostrar en varios estudios que esta técnica produce tamaños infarto altamente reproducible durante el período de murino y el infarto de miocardio 6, 8, 30, 40, 41. Por lo tanto, esta técnica puede ser útil para los investigadores que persiguen los mecanismos moleculares involucrados en la cardioprotección por IP a través de una aproximación genética en ratones con deleción del gen objetivo. Otros estudios sobre IP cardíaca utilizando ratones transgénicos puede considerar esta técnica.

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Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

Un modelo murino de isquemia miocárdica y el precondicionamiento isquémico es una herramienta importante para estudiar los mecanismos cardioprotectores<em&gt; In vivo</em&gt;. En este sentido, un informe de fácil aplicación<em&gt; In situ</em&gt; Modelo de IP cardíaco utilizando un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria coronaria.

El uso de un sistema de peso que cuelga de la oclusión coronaria en ratones

Murine studies of acute injury are an area of intense investigation, as knockout mice for different genes are becoming increasingly available 1-38. ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

21.5K vistas.  University of Colorado Denver. Un modelo murino de isquemia miocárdica y el precondicionamiento isquémico es una herramienta importante para estudiar los mecanismos cardioprotectores In vivo. En este sentido, un informe de fácil aplicación In situ Modelo de IP cardíaco utilizando un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria coronaria.

Video: Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones - Oclusión arteria cerebral media con el modelo de filamento

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Investigación

Medicina

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

El uso de un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria renal aislada

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and can result in liver failure which has a high mortality rate1-2. Therefore murine studies of hepatic ischemia have become an important field of research by providing the opportunity to utilize pharmacological and genetic studies3-9. Specifically, conditional mice with tissue specific deletion of a gene (cre, flox system) provide insights into the role of proteins in particular tissues10-13 . Because of the technical difficulty associated with manually clamping the portal triad in mice, we performed a systematic evaluation using a hanging-weight system for portal triad occlusion which has been previously described3. By using a hanging-weight system we place a suture around the left branch of the portal triad without causing any damage to the hepatic lobes, since also the finest clamps available can cause hepatic tissue damage because of the close location of liver tissue to the vessels. Furthermore, the right branch of the hepatic triad is still perfused thus no intestinal congestion occurs with this technique as blood flow to the right hepatic lobes is preserved. Furthermore, the portal triad is only manipulated once throughout the entire surgical procedure. As a result, procedures like pre-conditioning, with short times of ischemia and reperfusion, can be easily performed. Systematic evaluation of this model by performing different ischemia and reperfusion times revealed a close correlation of hepatic ischemia time with liver damage as measured by alanine (ALT) and aspartate (AST) aminotransferase serum levels3,9. Taken together, these studies confirm highly reproducible liver injury when using the hanging-weight system for hepatic ischemia and intermittent reperfusion. Thus, this technique might be useful for other investigators interested in liver ischemia studies in mice. Therefore the video clip provides a detailed step-by-step description of this technique.

We established a novel murine model of a hanging weight system for portal triad occlusion. This technique may be useful for future investigations of ischemia in murine hepatic models.

El uso de un sistema de suspensión de peso para la isquemia del hígado en ratones

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Técnica modificada para la ligadura de la arteria coronaria en ratones

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral en el modelo de rata de Carrera intraluminal oclusión arteria cerebral media

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusiones de la arteria carótida para farmacocinéticas y farmacodinámicas Análisis de taxanos en ratones

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure.
Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload. Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion. In contrast, the infarct area at 24 hr after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.
Besides the model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery, the technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented in detail.

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

La ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior en ratones: un modelo de remodelación post infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Evaluación Ultrasonido base de la arteria coronaria de flujo y la reserva coronaria Utilizando la sobrecarga Modelo Presión en ratones

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Surgical Approach for Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion Induced Stroke in Mice

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ischemic in origin and occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA). Currently the only Food and Drug Administration (FDA) approved drug for the treatment of this devastating disease is tissue plasminogen activator (tPA). However, tPA has a small therapeutic window for administration (3 - 6 hr), and is only effective in 4% of the patients who actually receive it. Current research focuses on understanding the pathophysiology of stroke in order to find potential therapeutic targets. Thus, reliable models are crucial, and the MCA occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) is deemed to be the most clinically relevant surgical model of ischemic stroke, and is fairly non-invasive and easily reproducible. Typically the MCAo model is used with rodents, especially with mice due to all the genetic variations available for this species. Here we describe (and present in the video) how to successfully perform the MCAo model (with reperfusion) in mice to generate reliable and reproducible data.

In order to understand the pathophysiology of stroke, it is important to use reliable models. This paper will describe one of the most frequently used stroke models in mice, termed the middle cerebral artery occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) with reperfusion.

Técnica quirúrgica para la oclusión de la arteria cerebral media y la reperfusión del movimiento inducidos en ratones

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ...

Identifying Coronary Artery Calcification on Non-gated Computed Tomography Scans

Coronary artery calcification (CAC) provides an objective measure of coronary artery disease and can readily be identified on non-gated computed tomography (CT) scans with a high correlation with gated cardiac CT scans. This standardized protocol takes a step-wise approach to not only optimizing an image for the identification of calcification but also to distinguishing CAC from other common causes of calcification in the cardiac silhouette. Recognition of CAC on non-gated CT scans helps to identify a very powerful prognostic factor that can influence therapeutic interventions or downstream diagnostic testing without requiring a gated cardiac scan. These non-gated CT scans are often acquired as part of the routine care of the patient, and this data is readily available without another dose of&#160;ionizing radiation. This protocol allows for the precise and accurate extraction of this data for the purposes of retrospective data analysis in clinical research studies, but also in the clinical evaluation and management of patients.

Here, we present a protocol to reliably and systematically identify coronary artery calcification (CAC) on non-gated computed tomography (CT) scans of the chest or abdomen. CAC provides an objective measure of coronary artery disease for both research and clinical purposes.