Os estudos atuais são suportados pelo National Heart, Lung, and Blood Institute Grant R01-HL0921, R01-R01-DK083385 e HL098294 para HK Eltzschig, o 1K08HL102267-01 a T. Eckle e Fundação para a Educação Anestesia e Bolsas de Investigação para T. Eckle e HK Eltzschig, e da American Heart Association para Grant T. Eckle e Eltzschig HK e uma bolsa de pesquisa Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) para M. Koeppen. Agradecemos a Shelley Eltzschig para a obra de arte.

Observações gerais: Todas as operações devem ser realizadas em um microscópio de dissecação vertical (Olympus, SZX10 com Z-Axis Mensagem Crank com STU2 Fique StandBoom) e usando um coagulador cirúrgico. Ventilação é fundamental para o processo e, portanto, uma certa quantidade de tempo deve ser gasto na escolha do ventilador e otimizando a técnica de ventilação. Temperatura, pressão arterial e anestesia deve ser estável por toda parte. 1. Intubação anestesia e monitoramento <ol><li> Use camundongos C57BL / 6 que são pelo menos 10 semanas de idade. Induzir a anestesia com pentobarbital sódico na dose de um ip 70 mg / kg peso corporal manter a anestesia com aproximadamente 10 mg / kg / h de sódio pentobarbital. Seja cauteloso com overdose uma vez que este pode reduzir significativamente a pressão arterial. Re-dose de pentobarbital - mesmo depois de horas-pode levar a um aumento severo dos níveis plasmáticos. Com base em fortes evidências sobre isoflurano como composto cardioprotetor recomendamos o uso do &quot;inerte&quot; e bem estabelecidos pentobarbital em um modelo de isquemia miocárdica 46-56. </li><li> Camundongos colocar em uma mesa aquecida com temperatura controlada (RT, Effenberg, Munique, Alemanha) com uma sonda termômetro retal ligado ao controlador de retorno térmico para manter a temperatura corporal a 37 ° C. </li><li> Depois de ratos indução anestésica segura em posição supina, com as extremidades superiores e inferiores em anexo a tabela com uma fita e uma sutura presa aos tornozelos. Faça o mesmo para a cabeça, usando os dentes. A restrição suficiente é importante para uma intubação e cirurgia bem sucedida bem controlada. Antes da cirurgia, cobrir o mouse com óleo mineral para reduzir o risco de alergia cabelo mouse. </li><li> Expor a traquéia cirurgicamente e realizar uma intubação traqueal utilizando cânulas bluntpolyethylene (INSYTE 22g, Beckton Dickinson, EUA). Você terá que blunt a agulha para ser capaz de usá-lo como um estilete. </li><li> Puxe a língua para fora usando um par de fórceps e empurre delicadamente em um ângulo de 15 graus em direção ao corpo. Mesmo após a exposição da traquéia e usando um microscópio, isto pode exigir algum treinamento. Estar ciente de que um dano pequeno da traquéia pode levar à incapacidade de ventilar o animal ao longo da sutura. Assim, se você encontrar problemas das vias aéreas verificar a traquéia de pequenos buracos. </li><li> Confirmar o posicionamento correto através da visualização direta da cânula dentro da traquéia anteriormente expostos acima da carina. </li><li> Ligue o tubo a um ventilador. Recomendamos uma pressão técnica de ventilação controlada usando um C 900 Servo da Siemens (DRE Veterinária, EUA). Animais serão então ventilado com pressão inspiratória de pico de 10 mbar, frequência de 110 respirações / min e uma pressão positiva expiratória final de 3-5 mbar com uma FiO 2 = 0,4. Configurações pode precisar de alguns ajustes que podem ser alcançados mais facilmente, verificando os pulmões durante a cirurgia do tórax aberto. Certifique-se que os pulmões não são recolhidos ou overextended. Apesar do fato de que o C 900 Servo é construído como ventilador para os seres humanos, a sua utilização em um ambiente de ventilação pressão controlada excelentes trabalhos para a ventilação de camundongos. </li><li> Realizar a análise de gás de sangue para confirmar a troca gasosa normal (pressão parcial de oxigênio, PaO 2 de 115 ± 15 mmHg e pressão parcial de dióxido de carbono, paCO 2 de 38 ± 6 mmHg) após 4 a 6 horas de tempo de ventilação usando o i-STAT sistema (Abbott, EUA). </li><li> Monitor de freqüência cardíaca com ECG (por exemplo, Hewlett Packard, Böblingen, Alemanha). Certifique-se que a freqüência cardíaca não cai abaixo de 450. Se o rato se desenvolve bradicardia verificação da temperatura e da dose do anestésico / concentração. Xylacin / cetamina induz anestesia um coração coração de 250 / min e não é recomendada. </li><li> Aplique uma reposição de líquidos adequada. Uma infusão com solução salina 0,1 ml / hora através de um cateter arterial ou venosa deve ser realizada antes do início da isquemia. Além disso, uma solução salina em bolus de 500 mL pode ser dado ip antes da cirurgia. Thoractomy pode induzir uma queda na pressão sanguínea e pode exigir boli solução salina. Após a isquemia, uma taxa de perfusão até 1 ml / hora pode ser necessário para manter uma pressão arterial média acima de 60 mmHg e garantir uma reperfusão crítica suficiente para a coloração de infarto utilizando TTC. </li><li> Coloque uma artéria carótida (PI10, Tip OD (mm / &quot;), cônicos&gt; 0,024 mm/.011&quot;) para a gravação contínua da pressão arterial. A artéria carótida serão expostos por meio de dissecção romba da musculatura paratraqueal. Após a exposição ainda mais cuidado e evitar de qualquer trauma tecidual (particular do nervo vago), um cateter é inserido dentro do vaso usando duas suturas e uma pinça pequena. Fixe o braço para o corpo antes de começar a dissecção da artéria. Isto irá expor um pedaço mais longo da artéria. Knot terminar a muito da parte proximal da artéria carótida. Anexar um maior aperto para o final da sutura paraobter tensão. Coloque outro sutura ao redor da artéria e dissecar a artéria até o fim distal. Aqui, colocar uma braçadeira de pequeno porte. Use uma tesoura para cortar micro de uma pequena abertura na diagonal dentro da artéria. Segure a abertura com uma pinça fina (Dumont, WPI) e avançar o cateter de tamanho apropriado com as mãos / fórceps. Faça um nó com o seu segundo e segura de sutura da artéria. Solte a braçadeira e avançar o cateter ainda mais. Fixe o cateter com vários nós e fita. </li></ol> 2. Técnica de oclusão da artéria coronária <ol><li> Dissecar a pele e expor a parede do tórax esquerdo, utilizando uma técnica de dissecção romba. </li><li> Corte dos músculos peitorais maiores e menores para expor a parede do tórax com um cautério. Ao puxar o peitoral maior, o de pulmão cai, assim, uma pinça a partir da unidade eletrocirúrgica podem ser inseridos, e, 1-3 mm acima do pulmão, uma linha horizontal cruzando os rasgos devem ser coagulado. </li><li> Usando uma tesoura embotado, corte a parede do tórax. Alfinetes de segurança modificado, onde a placa de captura é removida ea extremidade sem corte é dobrado, são então utilizados para manter o tórax aberto. </li><li> Para facilitar a colocação final da sutura, coagular e cortar a parede do tórax ao longo do diafragma para o lado inferior esquerdo do tórax. </li><li> Exposição do coração através da dissecção do pericárdio. Para evitar movimentos do diafragma remover e cortar o nervo frênico. </li><li> Use uma vara pequena de algodão molhado com uma pinça e converterá o coração para o lado direito. Identificar a artéria coronária esquerda (LCA) e certifique-se que os pulmões não estão muito inflacionados. Otimizar a abertura do tórax para ter uma fixação segura do coração quando colocar a sutura. Se a pressão arterial está muito baixa a identificação pode ser complicada. Boli adicionais de solução salina pode melhorar a identificação do LCA. A LCA é um vaso vermelho brilhante cruzando o coração na horizontal (em contraste com as veias de retorno). Às vezes, o LCA é mais vistos sem um microscópio. Não use também muita luz. Isso pode levar a reflexões sever tornando impossível a visualização. </li><li> Uma vez que o LCA é visualmente identificado, coloque um fio de náilon 8.0 (Prolene, Ethicon, Notiefies, EUA) em torno da LCA. Para efeitos de oclusão intermitente LCA, adotamos um modelo de cardiomiopatia crônica 42 usando um sistema de peso pendurado. </li><li> Passe o fio através de um pequeno pedaço de tubo de plástico (PE-10 tubos) com bordas sem corte e anexar dois pequenos pesos (1g, por exemplo, utilização de tubos Eppendorf cheio de água) em cada extremidade. Com os pesos livremente pairando sobre uma haste, a LCA deve ser imediatamente ocluído. Além disso, quando o peso é aliviado, LCA oclusão é terminada de uma vez. Sucesso LCA oclusão deve ser confirmado por uma mudança de cor imediata do navio da luz vermelho ao violeta escuro, mudança de coloração do miocárdio fornecido pelo navio (de vermelho para branco) ea presença de ST-elevações da ECG. Durante a reperfusão, as mudanças de cor desaparecer instantaneamente. Manter o coração molhado com a 37 ° C, salina peça, embebido de algodão absorvente todo (ver também Figura 1). </li><li> Escolheu o seu tempo de isquemia de acordo com seu interesse primário. Na verdade, para estudos dos efeitos cardioprotetores da IP, o ideal seria usar um tempo de isquemia associada a um infarto em tamanhos de aproximadamente 30 a 40% da AAR. Assim, seria possível demonstrar alterações em ambas as direções, tamanhos menores, com infarto, por exemplo IP cardíaca ou infarto tamanhos maiores com uma terapêutica experimental ou uma deleção do gene específico. Além disso, camundongos com um tamanho do infarto de menos de 50% normalmente sobreviver à experiência, ao passo que infarto tamanhos de 60 a 80% não são muitas vezes sobreviveram e os animais morrem antes do tempo de reperfusão é completa. Usando o nosso modelo de 10 minutos de isquemia do miocárdio seguido de 2 horas de reperfusão resulta em um tamanho do infarto de 3,5 ± 1,3% da AAR. Em contraste, um tempo de isquemia de 60 minutos resulta em um tamanho do infarto média de 42 ± 5,2% da AAR (p &lt;0,01) 39. Assim, consideramos a 60 minutos de isquemia como ideal para estudar mudanças em ambas as direções. No entanto, você pode ter que ajustar o tempo de isquemia em ratos gene-alvo com um fenótipo sever. </li><li> Escolheu o momento certo de reperfusão. O tempo de reperfusão é extremamente importante para a coloração TTC. O corante incolor é reduzida a um precipitado vermelho-tijolo-colorido por desidrogenases na presença do NADH co-enzima. Células que morrem perdem a capacidade de reter NADH e, portanto, são delineadas como áreas pálidas no miocárdio viável manchada de vermelho. Infarto delineamento tamanho por TTC exige que NADH foi lavada completamente da área de necrose. No entanto, se reperfusão não é suficientemente longo, delimitação do tamanho do infarto pela coloração TTC pode resultar em uma subestimação do tamanho do infarto real 43. Em nossas mãos, depois de um tempo de isquemia de 60 min, a medição do tamanho do infarto aumentou de 11,5 ± 4,5% depois de 30 minutos para 42,2 ± 5,1%após 120 minutos. Nenhum aumento no tamanho do infarto pode ser detectada com maior tempo de reperfusão (240 minutos) 39. Assim, recomendamos um período de duas horas de reperfusão que parece também razoável no contexto de determination.If enzimas cardíacas você considera isquemia pré-condicionamento, recomendamos 4 ciclos de IP (5 min de isquemia, reperfusão 5 min), seguido de um tempo de isquemia de 60 min e um tempo de 2 horas de reperfusão. Sob essas condições, IP foi associado com uma redução de 3,2 vezes do tamanho do infarto de 42,2 ± 5,1% para 13,3 ± 3,3% da AAR 39. No entanto, devido ao sistema de peso enforcamento, diferentes regimentos de pré-condicionamento poderia ser facilmente aplicada. </li></ol> 3. Determinação da Área At Risk (AAR) e tamanho do infarto Após a indução de um infarto do miocárdio (com ou sem IP), a área é perfundido pela LCA (área de risco, AAR) e do tamanho do infarto em si será determinada utilizando uma técnica de coloração. Posteriormente, infarto será então calculada como porcentagem de infarto do miocárdio em comparação com o AAR. Para fazer isso, uma técnica de coloração descrito anteriormente dupla com cloreto de azul e trifeniltetrazólio Evan (TTC) é usada 44. <ol><li> Determinar a AAR pela injeção retrógrada de 1% de corante azul de Evan para a aorta, enquanto o LCA é ocluído. Alternativamente, se um cateter carotis está no lugar, use esta rota para Evans injeção de azul. Azul de Evans vai manchar todo azul do tecido do miocárdio, exceto a AAR. É fundamental para esta etapa para evitar bolhas de ar dentro do cateter, como seriam injetados na circulação coronariana e evitar manchas azul de Evan. Antes da coloração azul Evans você pode querer coletar sangue para dosagem de enzimas cardíacas. Além disso, a remoção de sangue através da injeção de 5 ml de soro fisiológico através de um cateter aórtica ou carotis é recomendado. </li><li> O coração do consumo e lave em soro fisiológico gelado a 0,9% </li><li> Incorporar em agarose 2%. Não use agarose quente desde que isso vai impedir a coloração bem sucedida. </li><li> Após 30 minutos a 4 ° C (ou 15 minutos -20 ° C), corte o coração em fatias de 1 mm usando uma matriz de coração ou micrótomo. Se você colocar o coração no freezer evitar o congelamento seco, que vai levar à não corações manchados. </li><li> Incubar as fatias com TTC 1% a 37 ° C por 10 min usando a 15 ml tampa azul em banho-maria. Isso permitirá que a área infartada a ser demarcada como área branca, enquanto que as manchas vermelhas tecido viável. </li><li> Fixar as fatias corados com fomaldehyde 10% durante a noite. Ao fazer isso, a área infartada é melhor contraste melhoria da qualidade de imagens. </li><li> Determinar a área de risco (AAR) e do tamanho do infarto por meio de planimetria usando o software NIH Imagem 1,0 45. </li><li> Calcular o percentual de infarto do miocárdio a partir da área em risco. </li></ol> 4. Medição de enzimas cardíacas Devido a limitações associadas a coloração TTC recomendamos leitura como adicional para a gravidade do infarto do miocárdio a determinação de troponina cardíaca I (cTnI) níveis no soro de camundongos. O sangue será obtido a partir da veia portal e os níveis séricos cTnI são, então, determinada com um ensaio de cTnI quantitativa rápida (Life Diagnostics, Inc., West Chester, PA, EUA). 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2526/2526fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) Modelo de IP cardíaca utilizando um sistema de suspensão de peso de oclusão coronária. Esta técnica não exige um nó para a oclusão coronária. (B, C) de instalação cirúrgica. (D) Imagem de um coração de camundongos com a artéria coronária esquerda (LCA, setas) após a oclusão. Identificação visual do LCA é necessário para ligadura e pré-condicionamento isquêmico em ratos. Uma sutura de nylon 8.0 é colocado ao redor do 1-2 mm LCA debaixo da orelha esquerda. A sutura é enfiada através de um pequeno tubo de plástico (*). O final de cada sutura é anexado a um pequeno peso (1g) ea sutura é colocada sobre as hastes dos dois lados. (E) Determinação da AAR LCA após oclusão e injeção retrógrada de corante azul de Evan para a aorta. A AAR permanece imaculada, enquanto o resto do miocárdio é azul. Após a incubação da AAR tecido com TTC, a área de infarto branco manchado, enquanto o vermelho manchado viável tecido.

Não há conflitos de interesse declarados.

O presente estudo descreve uma nova técnica de realizar IP em um modelo murino intacta usando um sistema de suspensão de peso e evitando assim a oclusão da artéria coronária por um nó. De fato, este estudo demonstra tamanhos infarto altamente reprodutível e proteção cardíaca por IP, minimizando assim a variabilidade associada com nó modelos baseados em oclusão coronária. Investigadores que consideram estudar cardioproteção por IP em camundongos podem beneficiar deste modelo.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sodium Pentobarbital (Fatal Plus)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td>
<td>V.P.L. 9372</td>
<td>4mg/mL in saline</td>
</tr>
<tr>
<td>TTC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>17779 Fluka</td>
<td>1.5 % in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Evans Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E2129</td>
<td>10g in 1 L PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Insyte 22 G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickinson</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture, silk 4.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>517698</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture, Prolene 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon, USA</td>
<td>M8739</td>
<td>reusable</td>
</tr>
<tr>
<td>Heart Matrix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zivic Instruments</td>
<td># HSMS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Siemens 900 C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DRE Veterinary, USA</td>
<td># 336</td>
<td>refurbished</td>
</tr>
<tr>
<td>dissecting microscope (SZX10 )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>n/a</td>
<td>consider generous working distance</td>
</tr>
<tr>
<td>Heating Table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rt, Effenberger, Germany</td>
<td>n/a</td>
<td>only and single provider</td>
</tr>
<tr>
<td>Blood pressure device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cyber Sense, Inc</td>
<td>BPM02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I STAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abbott</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

use of a hanging weight system for coronary artery occlusion in mice

Estudos murino de lesão aguda são uma área de intensa investigação, como camundongos knockout para os genes diferentes estão se tornando cada vez mais disponíveis 1-38. Cardioproteção por pré-condicionamento isquêmico (PI) continua sendo uma área de intensa investigação. Para melhor elucidar a sua base molecular, o uso de estudos com ratos knockout é particularmente importante 7, 14, 30, 39. Apesar do fato de que estudos anteriores já realizados com sucesso isquemia cardíaca e reperfusão em ratos, este modelo é tecnicamente muito difícil. Particularmente, a identificação visual da artéria coronária, a colocação da sutura ao redor do navio e oclusão coronária por amarrar a embarcação com um nó suportado é tecnicamente difícil. Além disso, re-abertura do nó de reperfusão intermitente da artéria coronária durante IP sem causar trauma cirúrgico acrescenta desafio adicional. Além disso, se o nó não está amarrado forte reperfusão, o suficiente acidental devido a oclusão imperfeita da coronária podem afetar os resultados. Na verdade, isso pode facilmente ocorrer devido ao movimento do batimento cardíaco. Com base em potenciais problemas associados ao uso de um sistema de oclusão coronária atado, adotamos um modelo previamente publicados de cardiomiopatia crônica baseada em um sistema de peso pendurado por oclusão da artéria coronária intermitente durante 39 IP. Na verdade, a oclusão da artéria coronária pode assim ser alcançado sem a necessidade de ocluir a coronária por um nó. Além disso, a reperfusão do vaso pode ser facilmente conseguida através do apoio dos pesos que são pendurados em uma localização remota a partir de tecidos cardíacos. Nós testamos este sistema de forma sistemática, incluindo variação de isquemia e reperfusão vezes, regimentos pré-condicionamento, a temperatura do corpo e base genética 39. Além de infarto coloração, testamos troponina I (cTnI) como um marcador de infarto do miocárdio neste modelo. Na verdade, os níveis plasmáticos de cTnI correlacionados com tamanhos de infarto (R2 = 0,8). Finalmente, nós poderíamos mostrar em vários estudos que esta técnica produz tamanhos infarto altamente reprodutível durante IP murino e infarto do miocárdio 6, 8, 30, 40, 41. Portanto, essa técnica pode ser útil para pesquisadores que buscam mecanismos moleculares envolvidos na cardioproteção por IP usando uma abordagem genética em camundongos com deleção do gene alvo. Mais estudos sobre IP cardíaca utilizando camundongos transgênicos podem considerar esta técnica.

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Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

Um modelo murino de isquemia miocárdica e pré-condicionamento isquêmico é uma importante ferramenta de estudo de mecanismos cardioprotetores<em&gt; In vivo</em&gt;. Aqui, nós relatamos uma aplicáveis ​​fácil<em&gt; In situ</em&gt; Modelo para IP cardíaca utilizando um sistema de suspensão de peso para a oclusão da artéria coronária.

Uso de um Sistema de Peso de suspensão para oclusão da artéria coronária em ratos

Murine studies of acute injury are an area of intense investigation, as knockout mice for different genes are becoming increasingly available 1-38. ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

21.5K visualizações.  University of Colorado Denver. Um modelo murino de isquemia miocárdica e pré-condicionamento isquêmico é uma importante ferramenta de estudo de mecanismos cardioprotetores In vivo. Aqui, nós relatamos uma aplicáveis ​​fácil In situ Modelo para IP cardíaca utilizando um sistema de suspensão de peso para a oclusão da artéria coronária.

Vídeo: Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Curso de modelagem em Ratos - Oclusão da Artéria Cerebral Média com o modelo de Filamento

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Medicina

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

Uso de um sistema de suspensão de peso para oclusão da artéria renal isolada

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and can result in liver failure which has a high mortality rate1-2. Therefore murine studies of hepatic ischemia have become an important field of research by providing the opportunity to utilize pharmacological and genetic studies3-9. Specifically, conditional mice with tissue specific deletion of a gene (cre, flox system) provide insights into the role of proteins in particular tissues10-13 . Because of the technical difficulty associated with manually clamping the portal triad in mice, we performed a systematic evaluation using a hanging-weight system for portal triad occlusion which has been previously described3. By using a hanging-weight system we place a suture around the left branch of the portal triad without causing any damage to the hepatic lobes, since also the finest clamps available can cause hepatic tissue damage because of the close location of liver tissue to the vessels. Furthermore, the right branch of the hepatic triad is still perfused thus no intestinal congestion occurs with this technique as blood flow to the right hepatic lobes is preserved. Furthermore, the portal triad is only manipulated once throughout the entire surgical procedure. As a result, procedures like pre-conditioning, with short times of ischemia and reperfusion, can be easily performed. Systematic evaluation of this model by performing different ischemia and reperfusion times revealed a close correlation of hepatic ischemia time with liver damage as measured by alanine (ALT) and aspartate (AST) aminotransferase serum levels3,9. Taken together, these studies confirm highly reproducible liver injury when using the hanging-weight system for hepatic ischemia and intermittent reperfusion. Thus, this technique might be useful for other investigators interested in liver ischemia studies in mice. Therefore the video clip provides a detailed step-by-step description of this technique.

We established a novel murine model of a hanging weight system for portal triad occlusion. This technique may be useful for future investigations of ischemia in murine hepatic models.

A utilização de uma suspensão do sistema de peso para isquemia hepática em ratos

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Técnica modificada para ligação da artéria coronária em ratos

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure.
Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload. Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion. In contrast, the infarct area at 24 hr after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.
Besides the model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery, the technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented in detail.

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

A ligação permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda em Ratos: Um Modelo de Remodelação pós-infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Avaliação ultra-som base de Artéria Coronária Flow e Fluxo Coronariano Reserve Usando o modelo de sobrecarga de pressão no Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Surgical Approach for Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion Induced Stroke in Mice

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ischemic in origin and occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA). Currently the only Food and Drug Administration (FDA) approved drug for the treatment of this devastating disease is tissue plasminogen activator (tPA). However, tPA has a small therapeutic window for administration (3 - 6 hr), and is only effective in 4% of the patients who actually receive it. Current research focuses on understanding the pathophysiology of stroke in order to find potential therapeutic targets. Thus, reliable models are crucial, and the MCA occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) is deemed to be the most clinically relevant surgical model of ischemic stroke, and is fairly non-invasive and easily reproducible. Typically the MCAo model is used with rodents, especially with mice due to all the genetic variations available for this species. Here we describe (and present in the video) how to successfully perform the MCAo model (with reperfusion) in mice to generate reliable and reproducible data.

In order to understand the pathophysiology of stroke, it is important to use reliable models. This paper will describe one of the most frequently used stroke models in mice, termed the middle cerebral artery occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) with reperfusion.

Abordagem cirúrgica para oclusão da artéria cerebral média e reperfusão induzida por acidente vascular cerebral em ratos

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers utilize a syringe pump to directly administer volatile anesthetics into a gas stream. Unlike a traditional vaporizer, it can be used at very low flow rates, making it ideal for use on mice and rats. 
The equipment's capability to use low flow rates could result in a substantial cost savings due to the reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal scavenging filters1. A lower flow rate means less waste of anesthetic gas and likely reduces the risk of anesthetic exposure to laboratory personnel. Thus, the high levels of precision and safety associated with direct injection vaporizers, along with a reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal filters are beneficial for research requiring small animal anesthesia. 
The goal of this protocol is to demonstrate the use of a syringe-driven direct injection vaporizer as part of a digital, low-flow anesthesia system. The direct injection vaporizer is capable of accurately delivering anesthesia at very low flow rates compared to a traditional vaporizer, making it a promising alternative for controlled gas anesthetic delivery to rodents.

Here, we present a protocol to more safely and efficiently administer anesthetic gas to mice using a digital, low flow anesthesia system utilizing a syringe-driven direct injection vaporizer.

O uso de um baixo fluxo Sistema de Anestesia Digital para camundongos e ratos

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

Identifying Coronary Artery Calcification on Non-gated Computed Tomography Scans

Coronary artery calcification (CAC) provides an objective measure of coronary artery disease and can readily be identified on non-gated computed tomography (CT) scans with a high correlation with gated cardiac CT scans. This standardized protocol takes a step-wise approach to not only optimizing an image for the identification of calcification but also to distinguishing CAC from other common causes of calcification in the cardiac silhouette. Recognition of CAC on non-gated CT scans helps to identify a very powerful prognostic factor that can influence therapeutic interventions or downstream diagnostic testing without requiring a gated cardiac scan. These non-gated CT scans are often acquired as part of the routine care of the patient, and this data is readily available without another dose of&#160;ionizing radiation. This protocol allows for the precise and accurate extraction of this data for the purposes of retrospective data analysis in clinical research studies, but also in the clinical evaluation and management of patients.

Here, we present a protocol to reliably and systematically identify coronary artery calcification (CAC) on non-gated computed tomography (CT) scans of the chest or abdomen. CAC provides an objective measure of coronary artery disease for both research and clinical purposes.