1. Beispiel Fixierung und Einbettung Harz <ol><li> Proben von frischem Gewebe und Zellen für mindestens 2 Stunden in 2% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphat-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4. Die Größe der Stichprobe sollte nicht mehr als 0,150 mm in der Dicke eine ausreichende Penetration oder Fixativ zu ermöglichen, und sollte nicht in das Update für länger als 12 Stunden verlassen werden. </li><li> Legen Sie die Proben in 20ml Glasszintillationsröhrchen und spülen sie dreimal, jeweils 5 Minuten, in 0,1 M Cacodylatpuffer. </li><li> Stain mit 1,5% (w / v) Kaliumhexacyanoferrat und 1% (w / v) Osmiumtetroxid in 0,1 M Cacodylatpuffer (0,1 M, pH 7,4) für 30 Minuten. </li><li> Stain mit 1,0% (w / v) Osmiumtetroxid in 0,1 M Cacodylatpuffer für 30 Minuten. </li><li> Spülen Sie einmal mit doppelt destilliertem Wasser für 3 Minuten. </li><li> Stain mit 1% (w / v) Uranylacetat in doppelt destilliertem Wasser für 30 Minuten. </li><li> Spülen Sie Abschnitte für 5 Minuten in doppelt destilliertem Wasser, und dann entwässern in abgestuften Alkoholreihe, 2 Minuten jeder Änderung (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%). </li><li> 70%, 90%, 95% und dann 100%: Embed in steigenden Konzentrationen von Durcupan Harz mit Ethanol vermischt, jeweils 30 Minuten ändern, beginnend bei 50% Durcupan in Ethanol, dann gefolgt. </li><li> Ersetzen Sie mit frischen Durcupan und agitieren 4 Stunden langsam. </li><li> Legen Abschnitte, mit hölzernen Zahnstochern, auf Glas Mikroskope Dias beschichtet mit Schimmel Trennmittel, und in 65 ° C im Ofen für 24 Stunden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Probe für die FIB / SEM <ol start="11"><li> Trennen Sie die Harzschicht, mit den Proben aus zwischen den beiden Glas-Objektträger und gründlich waschen, um jede Form Trennmittel zu entfernen. </li><li> Mit Hilfe eines Durchlicht-Mikroskop mit Low-Power-Ziele oder Binokular mit Durchlicht, um die Region von Interesse innerhalb der Schicht von Harz zu identifizieren. </li><li> Schneiden Sie ein kleines (3 mm x 3 mm) Platz rund um die Region von Interesse mit einer Rasierklinge und kleben diese an die Spitze der leeren Harzblock mit Acryl-Klebstoff (Abbildung 1). 5 Minuten warten, bis der Kleber aushärten, und fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt. </li><li> Klemmen Sie den Block in die Halterung des ulramicrotome und anhand der beigefügten Stereomikroskop, um die Region von Interesse mit einer Rasierklinge schneiden, bis nur noch eine kleine Pyramide des Materials bleibt. </li><li> Weitere trim den Block, mit einem Glas Messer in den Ultramikrotom fixiert, so dass die Region von Interesse präzise in Bezug werden die Abmessungen des Blocks der Oberfläche (Abb. 1). Cut eine Kante des Blocks, in die Region von Interesse in der Nähe, so dass ein senkrecht Schritt durch die Probe geschnitten wird (Abb. 1 und 2). Dieser Schritt bildet die Bildgebung Gesicht (Abbildung 2). </li><li> Entfernen Sie den Block aus dem Ultramikrotom und fotografieren die Region von Interesse innerhalb des Blocks mit einem Durchlicht-Mikroskop. </li><li> Schneiden Sie die getrimmt Block entfernt von der restlichen Harz Stummel. Dies wird durch einen Juwelier sah getan und sichergestellt, dass nur ein kleiner Block im Inneren des FIB / SEM platziert wird. Die Gesamthöhe dieses Blocks sollte nicht mehr als 5 mm. </li><li> Kleben Sie den Baustein, um ein Aluminium-Stub mit Kohlepaste sicherzustellen, dass die Seite abgebildet werden auf der äußersten Kante (Abbildung 1) ist. </li><li> Nachdem der Leim getrocknet ist, Fell der Block mit einer dünnen Schicht aus Gold (&gt; 20 nm; Cressington Vakuumverdampfung System). </li></ol> 3. Imaging in der FIB / SEM <ol start="20"><li> Bei einer niedrigen Vergrößerung, und mit Sekundär-Elektronen-Bildgebung (5 kV, 0,5 NAMP), orientieren den Block, so dass der gewählten Region von Interesse und die Seite des Blocks zu werden abgebildet wird mit Blick auf den Operator (Abbildung 2 c, d). </li><li> Richten Sie den Block, so dass das Gesicht abgebildet zu sein liegt parallel zum Fräsen Strahl. Dies bedeutet, dass Elektronenstrahl wird auf 54 ° zu diesem Gesicht (Abbildung 2 b) orientiert. </li><li> Mit Hilfe eines Ionenstrahls Strom von 13 bis 27 NAMPS bei 30 kV entfernen ein schmales Band von Harz von der Vorderseite der Region, die abgebildet werden. </li><li> Wechseln Sie zu rückgestreuten Imaging-Modus, um die gefrästen Gesicht, das die Region von Interesse überlagert zu sehen. </li><li> Mit der Lichtmikroskopie Referenzbild (aufgenommen am Schritt 16) und das Bild der gefrästen Fläche finden die genaue Region auf dem Block gefräst und abgebildet werden (Abbildung 2). </li><li> Kaution eine Schutzschicht (etwa 1 Mikrometer dick) von Kohlenstoff (oder Metall), mit der Gas-Einspritzsystem des Mikroskops auf die Oberfläche des Blocks, oberhalb der region of interest (Abbildung 2). </li><li> Mit einem Strom von 700 picoAmps, fein Mühle der Region des Blocks, in dem die endgültige aufgenommen werden sollen. </li><li> Lassen Sie das Fräsen Strahl vollständig Mühle das Bild ins Gesicht, bis kein Fräsen Artefakte auf dem Gesicht zu sehen ist. Eine komplette Mühle des Gesichts wird durch Beobachtung von Veränderungen in jedem folgenden Bild über das gesamte Sichtfeld geprüft. Unzureichende Fräsen können auch als weiße Streifen oder &quot;Vorhänge&quot; erscheinen Vertica gesehenlly in das Bild. </li><li> Lassen Sie das Mikroskop für mindestens 2 Stunden für eine thermische Veränderungen zu zerstreuen. Dies reduziert das Risiko, dass der Block Gesicht wird während der Bildgebung Drift, was falsch ausgerichtete Bilder. </li><li> Wählen Sie das Mikroskop-Parameter für die Abbildung des Gesichts seriell. Stellen Sie sicher, dass der Elektronenstrahl eine Spannung, die niedrig genug, um nur Bild einer sehr flachen Tiefe des Materials in den Block Gesicht hat. Dies sollte auch viel flacher als die Dicke des Gesichts entfernt werden. Typische Parameter für die Bildgebung sind Spannungen zwischen 1,2 bis 2,0 kV mit Pixel-Größen zwischen 4 bis 20 nm auf. Die Pixelverweilzeit muss rund 10 μsecs, so dass die Gesamtzeit für die Mühle im Gesicht und am Erwerb eines Bildes unter 2 Minuten eingehalten wird (Abbildung 3) gehalten werden. </li></ol> 4. Schlüssel zum Erfolg Schritt 1) Sicherstellen, dass die Proben nicht dicker als 150 Mikrometer. Dies ermöglicht es ausreichende Durchdringung der verschiedenen Flecken und Harz in das Material. Dies kann durch Schneiden der Proben mit einem Vibratom unmittelbar nach der Fixierung erreicht werden. Diese Dicke ist geeignet für Hirngewebe. Andere Gewebe müssen getestet werden, um ausreichende Fixierung und Färbung zu gewährleisten. Schritt 3) Die Proben müssen frei in der Lösung verteilt werden, und nicht verklumpt in einem Teil der Flasche, während dieser sekundären Fixativ wird eingeführt. Dies gewährleistet maximale Durchdringung der Probe und zur Verringerung der Stichprobe ist verzerrt während dieser Fixierung Prozess. Dies wird durch vorsichtiges Schwenken der Proben innerhalb der Ampulle unmittelbar nach der Lösung gegeben, erreicht ist. Step 15) sicher, dass die Region von Interesse befindet sich unmittelbar unterhalb befindet (&lt;30 Mikrometer) der Oberfläche des Blocks. Dadurch wird die Menge an Fräsen durch den Ionenstrahl zu reduzieren während der Bildaufnahme Phase. Step 22) Die Scan-Zeit des Ionenstrahls muss adequte um sicherzustellen, dass die gesamte Imaging-Gesicht komplett gefräst. Unzureichende Fräsen wird als weiße Streifen oder &quot;Vorhänge&quot; erscheinen vertikal in der Bildgebung Gesicht gezeigt. Schritt 26) Der letzte gefräst Gesicht muss größer sein als das Gesicht, das abgebildet wird. Dies liegt daran, das gemahlene Harz aus dem Block und redeposits auf den Block Fläche in unmittelbarer Nähe ausgeworfen wird. Diese Wiederablagerung kann auf die bildgebende Sichtfeld eingreifen, und wird durch Fräsen einer viel größeren Fläche als abgebildet wird vermieden. Für ein bildgebendes Fenster, 20 Mikrometer breit ist, wird das gemahlene Block Gesicht größer als 30 Mikrometer breit. Step 29) Es ist wichtig, dass der Elektronenstrahl-Parameter, so dass das Bild durch Elektronen, die nur aus den ersten wenigen Nanometern des Blocks der Oberfläche entstehen generiert wird. Dies ist ein acheved durch die Minimierung der Spannung auf unter 2 kV und sicherzustellen, dass keine Elektronen zu weit eindringen. Dies wird auch durch Verwendung einer Netzspannung auf den Detektor, so dass nur die Elektronen mit den höchsten Energien, um das endgültige Bild beitragen geholfen. Typischerweise wird ein Raster Spannung von 1,3 kV für ein Imaging-Spannung von 1,5 kV verwendet. 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Vorbereitung des Harzes zu blockieren. A) Resin Frontalschnitt (80 Mikrometer dick) durch einen Erwachsenen Rattenhirn in einer steromicroscope angesehen eingebettet. Das Bild zeigt deutlich die verschiedenen Hirnregionen, die aus dem Abschnitt (b) mit einem Skalpell geschnitten werden können. Hier wird eine 1 mm ² aus der Rinde entfernt und (c) auf eine leere Harzblock stecken. D) Das Harz Block wird dann mit einem Glas Messer in einem Ultramikrotom montiert getrimmt, und sobald der Block wurde reduziert, um nur verlassen Region of Interest (e), ist ein Schritt senkrecht zur Vorderseite des eingebetteten Materials geschnitten. f) Das gesamte getrimmt Region wird dann aus dem Rest der Harz geschnitten und montiert auf einem Aluminium-Stub bereit für Metallbeschichtung und Bildgebung in der Rasterelektronenmikroskop. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Vorbereiten der Block Gesicht für FIB / SEM Bildgebung. A) und b) zeigen Darstellungen des Blocks und die Kante, gemahlen, um die Imaging-Gesicht (angegeben mit dem schwarzen Doppelpfeil) zu erstellen. Die Position des Ionenstrahls (weiß) ist parallel zur Bildgebung Gesicht gezeigt, und der Elektronenstrahl (grau) wird gezeigt, trifft das Gesicht bei 54 °, um den Ionenstrahl. C) zeigt eine Ansicht des Blocks mit dem Elektronenstrahl getroffen und mit der sekundären Elektronen abgebildet. Entlang dieser Seite des Blocks eine dunklere Region (angedeutet durch gestrichelte weiße Box) zeigt einen Teil des Gesichts, die etwa hat gefräst (dargestellt mit Doppel-Kopfed schwarzer Pfeil), um die zugrunde liegende Stichprobe. d) Wenn dieser Region abgebildet wird nur mit der rückgestreuten Elektronen die eingebetteten Gewebe zu sehen ist. Hier ist die volle Breite des eingebetteten Gewebeschnitte mit einem Doppelpfeil weißen Pfeil gekennzeichnet. Maßstabsbalken in c) ist 100 Mikron. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Imaging die ein Volumen von Hirngewebe mit isotropen Voxeln. A) Reversed Gegensatz rückgestreuten Bild des Blocks Gesicht zeigt die Ultrastruktur in einem Bereich von Gehirn der Ratte. Alle Membranen sind ebenso wie große makromolekularen Strukturen. B) Insgesamt 1600 Bilder auf 5 nm Abstand, was zu einer Bildstapel mit isotropen Voxeln. C) Dieser Stapel in einer Ebene mit der gleichen Auflösung abgebildet werden kann, wurden gesammelt. Dieses Bild zeigt einzelne synaptische Verbindung, die in der xy-Ebene und der yz-Ebene abgebildet wird.

<ol>
	<li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope:+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue.">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li><li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy.">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li></ol>

Die Technik der FIB / SEM arbeitet optimal, wenn die Region von Interesse ist nicht allzu groß. Die Obergrenze für eine bebilderte Band richtet sich nach dem Ionenstrahl und der Bereich, dass es konsequent Mühle immer wieder über viele Stunden. So weit dies mit Flächen von rund 60 x 60 Mikrometer getan worden, aber Bildgebung dieser gesamte Bereich ist nicht mit einem geeigneten Bildauflösung möglich, vor allem auf den Faktor Zeit in das Sammeln solcher ein großes Bild. Als ein Beispiel, wohnen ein 4 kx 4 k Bild mit einem Pixel auf 10 Mikrosekunden wäre 2 Minuten und 40 Sekunden zu erwerben nehmen, und für ein Sehfeld von 60 Mikron diese würde nur eine Pixelgröße von 15 nm auf. Zur Darstellung der Ultrastruktur von Zellen und Geweben, ist eine kleinere Pixelgröße besser geeignet, in der Regel zwischen 4 und 10 nm / Pixel. Für eine Fläche von 60 x 60 Mikrometer würde das Bild in 10 Stunden erworben werden, auch wenn das Mikroskop hatte diese Fähigkeit. Aus diesen Gründen ist das Mikroskop ein ideales Werkzeug für Bildvolumina in der Größenordnung von 10 x 10 x 10 Mikrometer, oder bedeutenden Regionen der ganzen Zellen. Dies kann leicht in einem Zeitraum von 48 Stunden an Proben, die mit diesem Verfahren gut kontrastiert durchgeführt werden. Bisher ist die Protokoll wurde vor allem mit Hirngewebe, sowie verschiedene Arten von kultivierten Säugetierzellen Einhaltung Deckgläser verwendet. Allerdings kann die Fixierung und Färbung mit vielen anderen Arten von biologischem Material, einschließlich Pflanzenmaterial gleichermaßen gut kontrastiert Bildstapeln produzieren verwendet werden. Deshalb ist die wesentliche Vorteil dieser Technik ist ihre Fähigkeit, Bild Bände mit isotropen Voxeln. Bild Stapel dieser Art erlauben Analysen der 3D-Volumen mit Bildern auf jeder Ebene in die Liste aufgenommen. Der Vorteil davon ist, den Betrachter zu Bildmerkmale in die Bildserie aus jeder Richtung und bieten eine größere Detailgenauigkeit (Abbildung 3) zu ermöglichen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Sekundenkleber </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Präpariermikroskop: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, Deutschland </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan Harz </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schweiz </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM-Mikroskop (Zeiss, NVision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glass Histologie Dias </td><td> Menzel-Gläser, Deutschland </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> Glass Messermacher: Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, Deutschland </td><td></td></tr><tr><td> Glasszintillationsröhrchen (20ml) </td><td> EMS, USA </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyd </td><td> EMS, USA </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> Juwelier sah </td><td> EMS, USA </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Mould Trennmittel </td><td> Glorex, Schweiz </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> Osmiumtetroxid </td><td> EMS, USA </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> EMS, USA </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> Phosphate Salze für Phosphat-Puffer </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schweiz </td><td> 71642 und 71496 </td></tr><tr><td> Natriumcacodylat </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schweiz </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> Sputter Coater mit Gold-Ziel </td><td> Cressington, USA </td><td></td></tr><tr><td> Tris-Base (TBS) </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schweiz </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramikrotom: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, Deutschland </td><td></td></tr><tr><td> Uranylacetat </td><td> EMS, USA </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue

Dieses Protokoll beschreibt, wie biologische Proben, wie Hirngewebe kann in drei Dimensionen mit dem fokussierten Ionenstrahl / Rasterelektronenmikroskop (FIB / SEM) abgebildet werden. Die Proben werden mit Aldehyden, Heavy-Metal-gebeizt mit Osmiumtetroxid und Uranylacetat fixiert. Sie werden dann entwässert mit Alkohol und infiltriert mit Harz, die anschließend gehärtet wird. Mit einem Lichtmikroskop und Ultramikrotom mit Glas Messer, ist ein kleiner Block mit der Region Interesse in der Nähe der Oberfläche. Der Block wird dann in dem FIB / SEM gelegt, und der Ionenstrahl auf rund Mühle eine vertikale Fläche entlang einer Seite des Blocks verwendet, in der Nähe dieser Region. Mit rückgestreuten Elektronen zur Abbildung der zugrunde liegenden Strukturen, ist eine kleinere Fläche dann mit einem feineren Ionenstrahl gefräst und die Oberfläche geprüft stärker an den genauen Bereich des Gesichts, die abgebildet und gefräst werden zu bestimmen. Die Parameter des Mikroskops werden dann so eingestellt, dass das Gesicht immer wieder wird gemahlen und abgebildet, so dass seriellen Bilder über ein Volumen des Blocks gesammelt werden. Das Bild Stack enthält typischerweise isotrope Voxel mit den Abmessungen so klein ein 4 nm in jede Richtung. Diese Bildqualität in jeder Bildebene ermöglicht dem Anwender, Ultrastruktur der Zelle bei jedem Betrachtungswinkel innerhalb der Bildstapel zu analysieren.

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Dieses Protokoll beschreibt, wie Harz eingebettet Hirngewebe vorbereitet und in den drei Dimensionen in den fokussierten Ionenstrahl abgebildet werden, Rasterelektronenmikroskop.

Fokussierten Ionenstrahl-Fräs-und Rasterelektronenmikroskopie des Hirngewebes

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.8K Aufrufe.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne. Dieses Protokoll beschreibt, wie Harz eingebettet Hirngewebe vorbereitet und in den drei Dimensionen in den fokussierten Ionenstrahl abgebildet werden, Rasterelektronenmikroskop.

Serie: Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Forschung

Neurowissenschaften

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Doppelläufige und Concentric Mikroelektroden zur Messung der extrazellulären Ionensignale im Hirngewebe

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Charakterisieren Multiskalige Mechanische Eigenschaften von Gehirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Schlag Einrückungen und Rheometrie

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Analyse Mitochondrien von Hirnzellen Verwenden der seriellen Block Gesicht Rasterelektronenmikroskopie

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Machen, Prüfung und Verwendung von Kalium-Ionen selektive Mikroelektroden im erwachsenen Gehirn Gewebe Scheiben

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zur Untersuchung dendritischer Stacheln

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...