Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Overstreet Foundation unterstützt.

1. Elemente, die Be Prepared bevor Sie fortfahren to Cell Plating Need: <ol><li> Entsprechende Volumen der kompletten NSC Medium wird hergestellt, indem NeuroCult NSC Basal Medium und NeuroCult NSC Proliferation Supplements bei einem 9:1-Verhältnis, bzw. vorbereitet. </li><li> Ein Aliquot NeuroCult NCFC Serum-freiem Medium ohne Zytokine ist aufgetaut. </li><li> Das Medium wird in einem 37 ° C Wasserbad erwärmt. </li><li> Stammlösungen von epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF) in einer Konzentration von 10 ug / ml und Heparin bei 0,2% voraus sind vorbereitet. </li><li> Je nach Experiment Größe, sind mehrere 35-mm-Gewebe-Kulturschalen auf den Teller der Zellen und einer 150-200cm Kunststoff-Petrischale ist auch nötig, um die doppelte 35mm Gerichte halten und eine dritte 35-mm-Schale für Wasser benötigt. </li></ol> 2. Cell Preparation: Abhängig von Ihrem Experiment, können die Zellen von einem erwachsenen und embryonalen Quelle (primäre dissoziierten Gewebe oder dissoziiert Neurosphären) hergestellt werden. Dissect Gewebe von Erwachsenen / embryonalen Maus des zentralen Nervensystems (ZNS) oder distanzieren Erwachsene / embryonaler-derived Neurosphären nach wie vor 1,2 und dann beschrieben: <ol><li> Die einzigen Zellsuspension durch ein 40-um-size-Sieb-Filter geleitet wird, um so zu entfernen, nicht getrennten Klumpen. </li><li> 10 &amp;mgr; l der Zellsuspension mit 90μl des Trypanblau auf eine Zellzahl führen gemischt. Hinweis: Andere geeignete Zelle Verdünnungen können auch verwendet werden. </li><li> Bei der Verwendung von primären embryonalen oder adulten abgeleitete neurale Zellen, verdünnte die Zellsuspension auf eine Konzentration von 6,5 x 10 5 Zellen / ml in kompletten NSC Medium. Bei der Verwendung von Zellen aus dissoziierten Neurosphären aus adulten oder embryonalen neuronalen Zellen abgeleitet, verdünnte die Zellsuspension auf eine Konzentration von 2,2 x 10 5 Zellen / ml in kompletten NSC Medium. </li></ol> 3. Plating Cells in Halbfeste N-EUFA Medium: <ol><li> Das entsprechende Volumen aus den folgenden Komponenten in Ordnung ist gemischt, je nach Anzahl der Wiederholungen. Hier mischen wir den Betrag für zwei Bedarf repliziert oder doppelte Gerichte. Weitere Zahlen der Wiederholungen, siehe Tabelle 1. <ul><li> 1,7 ml NeuroCult NCFC Serum-freiem Medium ohne Zytokine </li><li> 330 ul der NeuroCult NSC Proliferation Supplements </li><li> 6,6 ul des EGF (10μg/mL) </li><li> 32 ul von Penicillin / Streptomycin </li><li> 3,3 ul der b-FGF (10μg/mL) nur erforderlich, wenn die Kultivierung von Zellen aus adulten neuralen Zellen. </li><li> 3,3 ul von Heparin (0,2%) nur erforderlich, wenn die Kultivierung von Zellen aus adulten neuralen Zellen. </li><li> 25 &amp;mgr; l der Zellsuspension (von 2,2 x 10 5 Zellen / ml Zellen aus dissoziierten Neurosphären oder 6,5 x 10 5 Zellen / ml primären Zellen aus dissoziierten ZNS-Gewebe). Hinweis: Die endgültige Anzahl der Zellen überzogen sollte etwa 2500 Zellen pro 35 mm Kulturschale werden für Neurosphäre abgeleiteten Zellen und 7500 Zellen pro 35 mm Kulturschale für Primärzellen. In einigen Fällen hat die letzte Zelle Plattierungsdichte auf, indem Sie eine Zelle Titration eingestellt werden. 150 Kolonien - Für statistische Analysen sollten die Gesamtzahl der Kolonien nach 21 Tagen der Kultur erkannt im Bereich von mindestens 50 sein. </li></ul></li><li> Das Medium mit den Zellen ist sanft und dann 1,3 ml kaltem Collagen-Lösung zur Zellsuspension übertragen und auch durch vorsichtiges Pipettieren gemischt, um zu vermeiden Einführung von Luftblasen gemischt. </li><li> Die gemischte Lösung wird in die Mitte eines jeden 35mm Kulturschale (~ 1,5 ml / Schale) verzichtet und die Gerichte sind kippte vorsichtig mit kreisenden Bewegungen, damit die Mischung gleichmäßig verteilt über die Oberfläche der Schale. . </li><li> Die doppelte 35 mm Kulturschalen werden in eine 100 mm Petrischale gelegt. Der Deckel des neuen 35 mm Schale wird entfernt und die offene Schale ist auch in der gleichen 100 mm Petrischale. Sterilem Wasser ist zu dieser offenen 35 mm Schale zugegeben, um eine optimale Luftfeuchtigkeit während der Inkubationszeit zu halten. Platz Bioassay-Platten (245 mm) verwendet werden, wenn mehr replizieren 35 mm Gerichte eingerichtet wurden. Auch hier sind 2 oder 3 offen 35 mm Schalen mit sterilem Wasser. </li><li> Die Platten sind in einen Inkubator gesetzt bei 37 übertragen ° C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit. Das Kollagen gerinnt durch steigende Temperatur und Gelbildung wird innerhalb etwa einer Stunde auftreten. Die Kulturen sind während dieser Zeit nicht gestört werden. </li><li> Kultivierte Zellen werden für 21 Tage (Unterschiede in Koloniegröße deutlich nach 21 Tagen zu unterscheiden) inkubiert. </li></ol> 4. Vorbereitung Replenishment Medium und Fütterung der Kultur: Als N-EUFA Kulturen über einen längeren Zeitraum (21 Tage) bebrütet werden, sollten Kulturen mit den entsprechenden vollständigen NeuroCult zugeführt werden Nachschub Medium frisch zubereitet wie folgt: <ul><li> 4,5 ml NeuroCult NSC Basal Medium mit 0,5 m gemischtL von NeuroCult NSC Proliferation Supplements und dann die Wachstumsfaktoren wird angefügt: </li><li> 250 ul 10μg/mL EGF (bis zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml EGF zu geben) </li><li> 125 ul 10μg/mL b-FGF (bis zu einer Endkonzentration von 0.25μg/mL b-FGF geben) nur erforderlich, wenn die Kultivierung von Zellen aus adulten neuralen Zellen. </li><li> 125 ul 0,2% Heparin, nur erforderlich, wenn die Kultivierung von Zellen aus adulten neuralen Zellen. </li><li> 60 ul der entsprechenden vollständigen NeuroCult Replenishment Medium (für embryonale oder adulte Zellen) in der Mitte jedes NCFC Assay Schüssel einmal alle 7 Tage während der gesamten NCFC Assay Kultur Inkubation (21 Tage) aufgenommen. </li></ul> 5. Scoring N-CFC-Assay Derived Kolonien und Berechnung der Häufigkeit der Bona-fide-NSCs und neuronale Vorläuferzellen: <ul><li> Jede 35 mm Kulturschale befindet sich auf einem gerasterten Scoring Schale mit dem Rastermaß von 2,0 mm x 2,0 mm gelegt und dann beide Gerichte werden auf dem Mikroskoptisch platziert. </li><li> Mit Low-Power-(2.5x - 5x) Objektiv, jedes Gericht wird gescannt und die Kolonien sind aufgrund ihrer Größe erzielt. </li><li> Die Kolonien sind in zwei große Kategorien eingeteilt: <ol><li> Weniger als 2 mm Durchmesser </li><li> ≥ 2 mm Durchmesser </li></ol></li></ul> 6. Repräsentative Ergebnisse: Wie in Neurosphäre Test starten Zellen in N-CFC-Assay vernickelt sich zu vermehren und bilden kleine Kolonien von Zellen innerhalb von 3 bis 7 Tage nach dem Ausplattieren (Abbildung 1). In zwei Wochen kann Kolonien unterschiedlicher Größe unterschieden werden. Während die Mehrheit der Kolonien wachsen zu stoppen nach 14 Tagen neigen, weiterhin einige Kolonien an Größe zunehmen. Am Tag 21, Kolonien in einer der vier Kategorien eingeteilt werden: 1) weniger als 0,5 mm Durchmesser, 2) von 0,5 bis 1 mm Durchmesser, 3) 1 bis 2 mm Durchmesser und 4) ≥ 2mm im Durchmesser. Praktisch werden die Kolonien kleiner als 2 mm Durchmesser bezeichnet als Stammvater abgeleitet (Abbildung 2) und Kolonien ≥ 2mm im Durchmesser sind, bezeichnet als NSC abgeleitet (Abbildung 3). Die Anzahl der Kolonien ≥ 2mm im Durchmesser pro insgesamt Zellen ausplattiert, stellt die Häufigkeit der tatsächlichen bona fide neurale Stammzellen mit langfristiger Selbst-Erneuerung und Multi-Potential-Funktionen. Die gesamte Neurosphäre bilden Frequenz in einer bestimmten Zellpopulation nach 7-8 Tag in einem parallel NSA Experiment wurde geschätzt, ähnlich zu sein, die gesamte Kolonie bildende Frequenz der gleichen Zellpopulation nach 21 Tagen in einem N-EUFA Experiment. Die N-EUFA bietet jedoch eine weniger restriktive Bedingungen, so dass jede Zelle kann ihre volle proliferative Potenzial zu zeigen. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> 2 Wiederholungen </td><td> 3 Wiederholungen </td><td> 4 Wiederholungen </td></tr><tr><td> NeuroCult NCFC Serum-freiem Medium ohne Zytokine </td><td> 1700 </td><td> 2550 </td><td> 3400 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Proliferation Supplements </td><td> 330 </td><td> 495 </td><td> 660 </td></tr><tr><td> EGF (10 ug / mL) </td><td> 6,6 </td><td> 9,9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> bFGF (10 ug / mL), nur für erwachsene Zellen </td><td> 3,3 </td><td> 4,95 </td><td> 6,6 </td></tr><tr><td> Heparin-Lösung (0,2%), nur für erwachsene Zellen </td><td> 3,3 </td><td> 4,95 </td><td> 6,6 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin (1:100) </td><td> 32 </td><td> 48 </td><td> 64 </td></tr><tr><td> Cells unter: 2,2 x 10 5 kultivierten Zellen / ml oder 6,5 x 10 5 primären Zellen / ml </td><td> 25 </td><td> 37,5 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Kollagenlösung </td><td> 1300 </td><td> 1950 </td><td> 2600 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Komponenten einer kompletten N-CFC-Assay Kultur. <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Representative Kolonien in N-EUFA Kultur der Gang sind E14-Maus NSCs 7 Tage nach dem Ausplattieren. Die Kolonien zeigt möglicherweise unterschiedlicher Morphologie und Größe. Original-Vergrößerung; 4x <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Representative Vorläuferzellen abgeleitet Kolonien unterschiedlicher Größe in N-EUFA Kultur der Gang sind E14-Maus NSCs 21 Tage nach dem Ausplattieren. Wie gezeigt, haben die Kolonien unterschiedlicher Morphologie, aber alle sind weniger 2 mm groß. Original-Vergrößerung; 4x <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Representative bona fide Stammzellen abgeleitete Kolonie in N-EUFA Kultur der Gang sind E14-Maus NSCs 21 Tage nach dem Ausplattieren. Aus embryonalen Stammzellen Kolonien zeigt möglicherweise unterschiedliche Morphologie (siehedas video), aber alle sind ≥ 2mm im Durchmesser. Original-Vergrößerung; 4x

<ol>
	<li>Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony+Forming+Cell+Assay.">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. , (2008).</li><li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain.">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li><li>Louis, S. A., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+and+Neural+Colony-Forming+Cell+Assays.">Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays.</a> Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).</li></ol>

Einer der Autoren, Sharon A. Louis, ist mit StemCell Technologies Inc, einem Hersteller von einigen Reagenzien in dieser Studie verwendeten angeschlossen.

Obwohl Neurosphäre Assay 3,1,2 ist die häufigste Methode, um zu isolieren und zu erweitern neuralen Stammzellen aus einer Vielzahl von Quellen wie adulten und embryonalen ZNS-Gewebe, kann es nicht genau messen die NSC-Frequenz in einer gemischten Population von neuronalen Vorläuferzellen (Stammzellen und Vorläuferzellen), da es keine 0.59 Beziehung zwischen der Anzahl der Neurosphären und die Anzahl der bona fide Stammzellen Zellen 4. Um diese Einschränkung ist die ursprüngliche NSA worden, um damit die neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, um ihr volles Verbreitung Kapazität für 3 Wochen 5-7 wachsen angepasst. Im Gegensatz zu den flüssigen NSA, in der N-EUFA die Kolonien sind eigentlich klonal abgeleitet, wie die halbfeste Kollagenmatrix verhindert die Migration der einzelnen Zellen ausplattiert und Aggregation von Kolonien. Für konsistente Ergebnisse mit diesem Test empfehlen wir: <ol><li> Stellen Sie sicher, eine einzige Zellsuspension in der ursprünglichen Zellsuspension. Fahren Sie mit dem einzigen Zellsuspension durch ein 40-um-size-Sieb-Filter, so dass nicht-dissoziierten Klumpen zu entfernen. </li><li> Halten Sie die Kollagen-Lösung auf Eis oder in den +4 ° C Kühlschrank. Kollagen ist das letzte Element, um die Mischung der Zellsuspension hinzugefügt werden, da es durch Erhöhung der Temperatur erstarrt. </li><li> Vergessen Sie nicht, die Kultur-Feeds jede Woche. Hinzufügen der Nachschub-Medium mit Wachstumsfaktor (s) einmal alle 7 Tage wird es Zellen weiter zu wuchern über den erweiterten Kultur Periode. </li><li> Die letzte Zelle Plattierungsdichte haben Zellen aus primären oder kultivierten neuronalen Zellen abgeleitet wurden so optimiert, dass die Gesamtzahl der Kolonien nach 21 Tagen der Kultur in der festgestellt NCFC-A liegt im Bereich von mindestens 50 bis 200 Kolonien. Dieser Bereich ermöglicht die Erkennung der seltenen NSC abgeleitet Kolonien&gt; 2mm im Durchmesser in Proben, während die Bereitstellung einer ausreichenden Zahl von Kolonien für statistische Auswertungen. Je nach Ausgangsmaterial Zelle Quelle, deutlich weniger (&lt;50) und eine höhere Anzahl von Kolonien (&gt; 250) sind manchmal erhalten. Zu wenige Kolonien in den Kolonien&gt; 2mm im Durchmesser unterhalb Erfassungsebenen führen, während zu viele Kolonien in Überbelegung anddepletion Wachstumsmedium Komponenten und somit eine ungenaue Koloniezählung führen wird. Deshalb Zelle Plattierungsdichte müssen entsprechend angepasst werden (zB Erhöhung oder Verringerung der Gesamtzahl der Zellen vernickelt) </li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NeuroCult NSC Basal Medium</td>
<td>Medium</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>05700</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NeuroCult NSC Proliferation Supplements</td>
<td>Medium supplement</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>05701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NeuroCult NCFC medium</td>
<td>Medium</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>05720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.05% 	trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>25300-062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soybean trypsin inhibitor </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer </td>
<td>Sieve</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T25 flask</td>
<td>Culture ware</td>
<td>Nalge Nunc international</td>
<td>136196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T80 flask</td>
<td>Culture ware</td>
<td>Nalge Nunc international</td>
<td>178905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen</td>
<td>Reagent </td>
<td>STEMCELL</td>
<td>04902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Growth factor</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>2028-EG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>b-FGF</td>
<td>Growth factor</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>3139-FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>Growth factor</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4784</td>
<td>Reconstituted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml tubes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm culture dishes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>27100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gridded scoring dishes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>27500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells

Die Neurosphäre Assay (NSA) ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zu isolieren, zu erweitern und auch die Berechnung der Häufigkeit von neuralen Stammzellen (NSCs). Darüber hinaus hat diese serumfreien System auch eingesetzt worden, um Stammzellen zu erweitern und festzustellen, deren Häufigkeit aus einer Vielzahl von Tumoren und normalem Gewebe. Es wurde vor kurzem, dass eine Eins-zu-eins-Beziehung nicht zwischen Neurosphäre Bildung und NSCs bestehen gezeigt. Dies deutet darauf hin, dass die NSA, wie sie derzeit angewendet wird, die Häufigkeit der NSCs überschätzt in einer gemischten Population von neuronalen Vorläuferzellen sowohl aus der embryonalen und adulten Gehirn von Säugetieren isoliert. Dieses Video zeigt praktisch eine neue Basis von Kollagen halbfeste Assay, der Neural-Kolonie-bildenden-Zell-Assay (N-EUFA), die die Fähigkeit, stammen aus Vorläuferzellen unterscheiden auf der Grundlage ihrer langfristigen proliferative Potential hat, und stellt somit ein Verfahren aufzuzählen NSC Frequenz. In der N-EUFA werden die Kolonien ≥ 2 mm im Durchmesser von Zellen, die alle funktionalen Kriterien eines NSC treffen abgeleitet, während Kolonien &lt;2mm aus Vorläuferzellen abgeleitet werden. Die N-EUFA Verfahren kann für Zellen, die aus unterschiedlichen Quellen, einschließlich Primär-und kultivierten adulten oder embryonalen Maus-ZNS-Zellen hergestellt werden. Hier verwenden wir Zellen aus Passage vorbereiteten Neurosphären aus embryonalen Tag 14 Mäuse Gehirn erzeugt werden, um N-EUFA durchzuführen. Die Kulturen werden mit Proliferationsmedium alle sieben Tage für drei Wochen wieder aufgefüllt, damit der plattierten Zellen, um ihre volle proliferative Potential aufweisen und dann die Frequenz der neuronalen Vorläuferzellen und bona fide neuralen Stammzellen ist jeweils durch Zählen der Anzahl der Kolonien, die &lt;2mm berechnet und diejenigen, die ≥ 2mm sind in Bezug auf die Anzahl der Zellen, die ursprünglich vergoldet waren.

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Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Dieses Video-Protokoll zeigt, wie zu diskriminieren und aufzählen bona fide neurale Stammzellen in einer gemischten Population von neuralen Vorläuferzellen über die neuronalen Kolonie-bildenden-Zell-Assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

neural-colony-forming-cell-assay-an-assay-to-discriminate-bona-fide

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.0K Aufrufe.  University of Florida. Dieses Video-Protokoll zeigt, wie zu diskriminieren und aufzählen bona fide neurale Stammzellen in einer gemischten Population von neuralen Vorläuferzellen über die neuronalen Kolonie-bildenden-Zell-Assay.

Serie: Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Forschung

Neurowissenschaften

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...