Das humane Retinoblastom ist die häufigste Form von intraokularem Krebs im Kindesalter. Klinische Proben sind schwer zu erhalten und Mäusemodelle können das Retinoblastom nicht bilden. Daher ist die In-vitro-Retinoblastom-Generierung unerlässlich für die Beobachtung der Genese, Proliferation und des Wachstums von Retinoblastomen sowie für die Entwicklung neuartiger Therapeutika.
Die Effizienz dieses Protokolls kann etwa 100% erreichen, obwohl die Dauer der Retinoblastom-Generierung von Tag 45 bis Tag 120 variiert. Zur Aufrechterhaltung des Retinoblastoms one oder RB one knockout humaner embryonaler Stammzellen kultivierte das Gen H neun Zellen in einer mit Wachstumsfaktor beschichteten Platte mit reduzierter Basalmembranmatrix und wechselt das Medium täglich. Um die Zellen zu passieren, inkubieren Sie sie im EDTA-Puffer für 3,5 Minuten bei 37 Grad Celsius oder fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Kulturieren Sie die Zellen, bis sie 80% Konfluenz erreichen. Um die Differenzierung der Netzhautzellen einzuleiten, entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit einem Milliliter DPBS ab. Als nächstes erhöhen Sie die Zellkolonien, indem Sie einen Milliliter Dispase-Puffer hinzufügen und fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Beobachten Sie die Zellkolonien unter dem Mikroskop. Sobald die Ränder der Kolonien auszurollen beginnen, saugen Sie den Dispase-Puffer ab und spülen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit einem Milliliter DPBS ab. Dann einen Milliliter Medium in den Brunnen geben und mit einer 10-Mikroliter-Standardpipettenspitze die Kolonien in Stücke schneiden.
Verwenden Sie einen Zellschaber, um die verbleibenden Zellen im Medium abzukratzen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Nach der Zentrifugation lassen Sie etwa 50 Mikroliter des Überstandes, um die Zellen im Medium zu dispergieren.
Dann 250 Mikroliter wachstumsfaktorreduzierte Basalmembranmatrix hinzufügen und durch sanftes Rühren mischen. Nach dem Mischen das 15-Milliliter-Röhrchen mit den suspendierten Zellen in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator geben. Nach einer 20-minütigen Inkubation sollten die Zellen und die mit dem Wachstumsfaktor reduzierte Basalmembranmatrix ein verfestigtes Gel bilden.
Als nächstes fügen Sie einen Milliliter Medium eins zum 15-Milliliter-Röhrchen hinzu. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette das verfestigte Gel zwei- bis dreimal pipettieren, um den Klumpen zu dispergieren. Dann fügen Sie weitere neun Milliliter Medium hinzu und überführen die Zellsuspension in eine 10 Zentimeter große Zellkulturschale.
Inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Dies gilt als Tag Null. Am ersten Tag untersuchen Sie die Zellen mit einem Mikroskop.
Im Durchschnitt werden drei bis vier Zysten in einem Stück Gel beobachtet. Am fünften Tag wechseln Sie das Medium, indem Sie den Überstand in ein 15-Milliliter-Röhrchen sammeln, so dass sich die Zysten am Boden absetzen und den Überstand durch einen frischen mittleren ersetzen können. Dispergieren Sie die Zysten in der Röhre in zwei 10-Zentimeter-Schalen und sorgen Sie für mindestens 300 Zysten in jeder Schale.
Am siebten Tag breiten sich die meisten Zysten, die an der Schale befestigt sind, aus und bilden adhärente Kolonien. Wechseln Sie am 10. Tag das Medium durch ein frisches Medium und stellen Sie sicher, dass alle Zysten an der Schale haften. Beobachten Sie die Zellen vom 13. bis 17. Tag unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich die Zellen ausbreiten.
Am Tag 15, nachdem die Zellen einmal mit einem Milliliter DPBS gespült wurden, fügen Sie einen Milliliter Dispase-Lösung hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Nach fünf Minuten den Dispase-Puffer entfernen und die Kulturen vorsichtig mit einem Milliliter DPBS abspülen. Dann fügen Sie 10 Milliliter Medium zwei zu jeder 10-Zentimeter-Schale hinzu und inkubieren Sie in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator.
Nach 24 Stunden lösen sich adhärente Kulturen spontan ab und sammeln sich zu retinalen Organoiden. Drei Tage nach der Ablösung die Zellen aus der Zellkulturschale in einem 15-Milliliter-Röhrchen sammeln. Wenn sich die Organoide absetzen, entfernen Sie den Überstand aus der Röhre und übertragen Sie die Organoide für die folgenden vier Tage in eine neue nicht haftende Petrischale mit 10 Milliliter Medium zwei.
Ändern Sie eine Woche nach der Ablösung das Medium auf Medium drei und kultivieren Sie ab diesem Tag die Organoide in Medium drei. Am 27. Tag der retinalen Organoidkultur ist die Architektur der optischen Vesikel offensichtlich, und etwa 90% der Organoide zeigen diese Struktur. Der erste Nachweis des Retinoblastoms erfolgt am Tag 45 und wird am Tag 50 tastbar.
Wenn es bis zum 90. Tag wächst, werden die optischen Vesikelstrukturen hauptsächlich vom Retinoblastom umhüllt. Das Retinoblastom kann nun isoliert und als Zelllinie weiter kultiviert werden. Am Tag 105 sind mehr als 80% der retinalen Organoide vollständig vom Retinoblastom umhüllt.
Diese Organoide exprimieren den Proliferationsmarker Ki67 und den Onkogenmarker SYK im Vergleich zu den H-neun abgeleiteten retinalen Organoiden hoch, was auf eine Tumorgenese hinweist. Darüber hinaus zeigt die hohe Expression des Zapfenvorläufermarkers ARR3 und des Photorezeptor-Vorläufermarkers CRX in den Retinoblastom-Organoiden, dass sie von Zapfenvorläuferzellen stammen. Minderwertige und überlegene Ergebnisse während der drei morphologischen Stadien der Retinoblastombildung werden hier dargestellt.
Differenzierte und undifferenzierte humane embryonale Stammzellen können anhand ihrer Morphologie leicht unterschieden werden. Die undifferenzierten Zellen werden für die Bildung von Retinoblastomen ausgewählt. Am fünften Tag sollte die erzeugte Kugel eher hohl als fest sein.
Das Retinoblastom leitet sich von den retinalen Organoiden ab, die eine optische Vesikelarchitektur aufweisen. Aus den unteren Organoiden wird kein Retinoblastom erzeugt. Während des Verfahrens sollten alle Spitzen abgekühlt und die Basalmembranmatrix bei vier Grad geschmolzen werden, bevor sie in das Rohr gegeben wird.
Dies ist ein wichtiger Schritt für dieses Differenzierungsprotokoll.
