Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485), der Hirntumor bei Kindern Foundation und den National Institutes of Health (NS042205) unterstützt.

1. Micro-Dissektion der tumortragenden Kleinhirn und Dissoziation von Tumorgewebe <ol><li> Retrieval von Tumorgewebe <ol><li> Kranke Mäuse mit Medulloblastom oft runted und Display Hydrocephalus und typische neurologische Symptome, einschließlich posterior Lähmung und Unfähigkeit zur Haltung wieder, wenn umgeworfen. Zum Abrufen von Tumorgewebe, euthanize Mäusen durch Kohlendioxid Einatmen. Es ist imporant nicht Genickbruch, eine Prozedur, die Druck erzeugt, um den hinteren Schädel und kann Tumorgewebe Integrität Kompromiss führen. </li><li> Enthauptung ist unmittelbar nach dem Tod mit einer Schere durchgeführt, das Entfernen von Haaren und Muskelgewebe so viel wie möglich für eine gute Visualisierung des Schädels. Reinigen Sie die Oberfläche des Schädels mit Kimwipe mit 95% Ethanol getränkt. </li><li> Verwenden einer feinen Schere, um eine Öffnung entlang der Mittellinie des Schädels geschnitten, und entfernen Schädel Gewebe mit feinen Pinzette, an welcher Stelle das ganze Gehirn einschließlich tumortragenden Kleinhirn ausgesetzt ist. </li><li> Während die cerebella von gesunden Erwachsenen gut definierten Hemisphären und Vermis-Display, sind die cerebella von Tumor-tragenden Mäusen oft vergrößert, amorph mit einer glatten Oberfläche und auffällige Blutgefäße. Mit sterilen Techniken, rufen Sie die Kleinhirntumor mit einer Pinzette und in eiskaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Mg 2 + und Ca 2 +. </li></ol> Hinweis: Alle Instrumente sind in 95% Ethanol und Dampf vor dem Gebrauch autoklaviert desinfiziert. </li><li> Die Dissoziation von Tumorgewebe <ol><li> Übertragen Sie die Tumorgewebe von PBS zu 50% Accutase (verdünnt in PBS), die etwa 4-mal das Volumen des Tumorgewebes ist, Hackfleisch das Gewebe mit einer feinen Schere für 3 Minuten bei Raumtemperatur, durch Inkubation bei 37 ° C für 4 Minuten , nach denen das Gewebe erfährt repetitive Pipettieren mit einer 1-mL Pipetman für weitere 3 Minuten. Diese Methode sollte Ausbeute eine Mischung aus Einzelzellen und kleine zelluläre Aggregate. </li><li> Verdünnen Sie die Zellsuspension 3-fach mit PBS und zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 1000xg die Zellen zu pelletieren. (Die oben beschriebenen Verfahren haben in &quot;Isolation, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Stammzellen&quot; beschrieben worden, JoVE in press) </li> Zellpellet in frisch zubereiteten neuralen Stammzellen Medium, bestehend aus Neurobasal Medium mit Glutamin, Penicillin-Streptomycin, N2, B27, menschlichen EGF (25 ng / mL) und basic FGF (25 ng / mL). Berechnen Sie die Zelldichte der Lösung und entsprechende weitere Verdünnungen mit zusätzlichen neuralen Stammzellen Medium, so dass man 4 ul-Lösung mit einer entsprechenden Anzahl von dissoziierten Tumorzellen, zB 5x10 5 Last, in einen sterilen Kegel-Spitze 10 &amp;mgr; l Spritze. Die genaue Zahl der Zellen geimpft werden sollten durch den Forscher nach bestimmten experimentellen Anforderungen bestimmt werden. Halten Sie die Zell-Lösung in einem Mini 200 ul Mikrozentrifugenröhrchen (PCR-Röhrchen) auf Eis. </ol></li></ol> 2. Narkoseverfahren für die Empfängermäuse Für den chirurgischen Eingriff, ist eine Desinfektion Bereich für Nager Operation für die Dauer des Verfahrens benötigt werden. Im Idealfall richten Sie eine lange Bank mit getrennten, aber benachbarten Gebieten für tierische Vorbereitung, OP-Feld und Tier Erholung. OP-Handschuhe, nicht Untersuchungshandschuhe sind für die Operation erforderlich. Aseptische Technik ist, indem behandschuhten Hände oberhalb der Taille gehalten und nur verwendet, um sterile Objekte aus einem trockenen und sterilen Oberfläche zu behandeln. <ol><li> Eine Mischung aus Ketamin (100 mg Ketamin pro 1 kg Maus Gewicht) und Xylazin (10 mg Xylazin pro 1 kg Maus Gewicht) ist für die Anästhesie verwendet. Verwalten Sie die Anästhetika intraperitoneal. </li><li> Es dauert in der Regel 3-5 Minuten für die Anästhesie ihre volle Wirkung zu nehmen. Bestimmen Sie, ob eine Maus vollständig betäubt von toe / Schwanz kneifen wird. Legen Sie eine kleine Menge Augensalbe auf die Augen der Maus. Bringen Sie die vollständig narkotisierten Maus zum OP-Feld, die ständige Überwachung, um sicherzustellen, dass die Maus ist in der Regel zu atmen. </li></ol> 3. Intrakranielle Pfropfung der Tumorzellen <ol><li> Shave der dorsalen hinteren Kopfbereich der Maus, mit einer Haarschneidemaschine, mit der hinteren Schädel über das Mittelhirn und Kleinhirn zu enthüllen. </li><li> Bewerben Betadine Lösung auf dem exponierten Kopfhaut mit einem Wattestäbchen, durch Abwischen mit einem Alkohol-Pad gefolgt. Wiederholen Sie diese beiden Sterilisationsschritte zweimal. </li><li> Machen Sie einen Viertel-Zoll-Schnitt in der hinteren Kopfhaut mit einem sterilisierten Skalpell. Bohren Sie ein 0,5 mm Bohrloch 2 mm nach rechts und 2 mm hinter der Lambda mit einer sterilen Dentalbohrers. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einen stereotaktischen Rahmen durch Einhaken seine Schneidezähne auf den Rahmen zu halten. Vorsichtig steigen und die Position der Kegel-Spitze 10 l-Spritze mit 4 ul Tumorzellen Lösung in das Bohrloch geladen. Sobald die Abschrägung der Nadel der Spritze unterhalb des Schädels Oberfläche, descend für weitere 3 mm und steigen dann für 0,5 mm. Langsam injizieren die gewünschte Menge von Tumorzellen, mit einem stetigen Kraft in einem 30 Sekunden Zeitfenster, in dem Kleinhirn des Empfängers. Lassen Sie die Nadel an ihrer Stelle nach Abschluss der Injektion für weitere zwei Minuten. Dann entfernen Sie die Nadel und Spritze. Clip die Wunde mit einem autoclip. </li><li> Halten Sie die Maus auf eine wärmende Decke nach der Operation zur Aufrechterhaltung ihrer Körpertemperatur. Mobilität und Atemmuster wird kontinuierlich beobachtet werden. Sobald Sie die Maustaste wieder aus der Narkose, setzen Sie ihn wieder in eine sterile Gehäusekäfig. Monitor täglich für Futter-und Wasseraufnahme, Verhalten, Pflege, und Rot-Färbung der Augen. Überprüfen Sie auf Anzeichen einer Infektion an der Inzisionsstelle. Entfernen Sie die autoclips am Tag 7 nach der Operation. Pflegen Sie die Maus für einen Durchschnitt von 2-6 Monaten und Opfer die Anzeige typischer Medulloblastom Symptome für weitere Studien. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Sekundäre Medulloblastome in Empfängermäuse entwickelt hoch ähnelten denen der primären Tumore. Die cerebella tragenden sekundären Tumoren waren oft vergrößert, amorph mit ektopischen Blutgefäße sichtbar, wenn sie als Ganzes-Halterungen angesehen. Immunhistochemische Analysen der sekundären Tumorgewebe ergab, dass die Tumorzellen stark proliferative sind, äußern starke SmoM2-YFP und Marker der Kleinhirn Granulat Neuron Vorstufen wie Math1 und Pax6. Wenn dissoziiert und kultiviert mit berichtete Methoden (&quot;Isolation, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Stammzellen&quot;, JoVE in press), die sekundäre Medulloblastom Tumorzellen rasch erweitert werden kann, zum Ausdruck mehrere Stammzell-Marker sind klonogenen und kann weiter zu initiieren Tumorbildung bei transplantierten in zusätzliche immunsupprimierten Empfängern. <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Typische ganzen-mount und Schnitte eines sekundären Medulloblastom Gewebe Ein typisches Beispiel für sekundäre Medulloblastom Gewebe entwickelt 26 Tage nach der Injektion von 5x10 5 primären Tumorzellen. Hämatoxylin Färbung zeigt den typischen zellulären Morphologie Medulloblastom, darunter hohe nukleare / Plasma-Relation und Kernpolymorphie. Diese sekundären Tumorzellen sind hoch proliferative wie Ki67 Ausdruck angegeben und sie auch kräftig ausdrücken membranöse SmoM2-YFP. <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Sekundäre Medulloblastom-Zellen können kultiviert und erweitert werden in vitro Mit dem Protokoll für die primäre Maustaste Medulloblastom-Zellen (&quot;Isolation, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Stammzellen&quot;, JoVE in press) beschrieben, können diese sekundären Medulloblastom-Zellen kultiviert und erweitert werden für mehrere Passagen. Das Bild zeigt den gleichen repräsentativen Tumorkoloniebildung bei 4 Tage und 14 Tage kultiviert. Die kultivierten Tumorzellen sind bipolar, mit wenig Zytoplasma und oft strahlen aus einem dichten Kern der zellulären insgesamt verlängert. Sie zeigen nicht das Wachstum Kontakt Hemmung. Die kleinen runden Zellen sind rote Blutkörperchen.

<ol>
	<li>Schuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+granule+neuron+precursor+identity+is+a+critical+determinant+of+progenitor+cell+competence+to+form+Shh-induced+medulloblastoma.">Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma.</a> Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).</li><li>Yang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells.">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li><li>Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+alters+the+fate+of+preneoplastic+cells+in+a+mouse+model+of+medulloblastoma.">N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma.</a> Genes Dev. 23, 157-170 (2009).</li><li>Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Atoh1+disrupts+Sonic+Hedgehog+signaling+in+the+developing+cerebellum+and+prevents+medulloblastoma.">Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma.</a> Science. 326, 1424-1427 (2009).</li><li>Salsano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+neurogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+NEUROG1+identifies+a+subgroup+of+medulloblastomas+not+expressing+ATOH1.">Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1.</a> Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).</li></ol>

Mehrere kritische Faktoren für eine erfolgreiche Medulloblastom Zelle Allotransplantaten, dass die Erträge sekundäre Tumorbildung sind wie folgt zu gewährleisten: Erstens, verwenden Sie nur 50% Accutase für Gewebedissoziation und nicht über-digest das Gewebe als verlängerte Enzymbehandlung führt zu einer signifikanten Reduktion der Lebensfähigkeit der Zellen. Nutzen Sie auch nur die 1 mL Größe Pipetman als kleinere Tipps auch erzeugen kann körperliche Schäden an der dissoziierten Zellen. Es ist schön, eine...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Neurobasal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hEGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>PHG0311</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>PHG0023</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>N2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17502048</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>B27(-RA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12587010</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>Accutase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1110501</td>
<td>50% </td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030081</td>
<td>2mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Stereotaxic instrument</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting </td>
<td>51730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foredom flexible shaft drill, hang-up style</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting </td>
<td>58650</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Large probe holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting </td>
<td>51633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;L syringe, 26 ga., bevel tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting </td>
<td>51105</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Drill bit .75mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51455-3</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intracranial orthotopic allografting of medulloblastoma cells in immunocompromised mice

Medulloblastom ist der häufigste pädiatrische Tumor des Nervensystems. Eine große Anzahl von Tierversuchen hat am Kleinhirn Granulat Neuron Vorstufen (CGNPs) als Zell-of-Origin für Medulloblastom 1-4 ausgerichtet. Allerdings deuten die vielfältigen klinischen Präsentationen Medulloblastom Subtypen bei menschlichen Patienten (knotige, desmoplastischen, klassische und große Zelle / anaplastischen), und die Tatsache, dass Medulloblastom in einer Untergruppe von menschlichen Patienten, die keine ektopische Expression von CGNP Marker 5 ist gefunden, dass die zellulären und molekularen Ursachen der Medulloblastom sind komplexer und weit davon entfernt, vollständig entschlüsselt. Daher ist es wichtig, festzustellen, ob es eine Alternative gibt Medulloblastom Tumorzelle-of-Origin auf dem Zelltyp-spezifische therapeutische Modalität entwickelt werden können basiert. Zu diesem Zweck wird intrakraniellen orthotopen Allotransplantaten von genetisch markierten Tumorzellen Arten durch nachträgliche Analysen der sekundären Entwicklung von Tumoren in Empfängern gefolgt ermöglichen die Bestimmung der zellulären Herkunft der Tumor-initiierende Zellen. Hier beschreiben wir die experimentelle Protokoll für intrakranielle orthotopen Allotransplantaten von Medulloblastom Zellen aus primären Tumorgewebe, und dieses Verfahren kann auch zur Transplantation von Zellen aus etablierten Zelllinien verwendet werden.

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Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Spaltung von Maus Medulloblastom Gewebe und anschließende allogene der Tumorzellen in immunsupprimierten Empfängermäuse um sekundäre Medulloblastom einzuleiten.

Intrakranielle orthotopen allogene von Medulloblastom Cells bei immungeschwächten Mäusen

Medulloblastoma is the most common pediatric tumor of the nervous system. A large body of animal studies has focused on cerebellar granule neuron ...

intracranial-orthotopic-allografting-medulloblastoma-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K Aufrufe.  Vanderbilt University. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Spaltung von Maus Medulloblastom Gewebe und anschließende allogene der Tumorzellen in immunsupprimierten Empfängermäuse um sekundäre Medulloblastom einzuleiten.

Serie: Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

Isolation, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

Forschung

Neurowissenschaften

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Intracranial Pharmacotherapy and Pain Assays in Rodents

Pain is a salient sensory experience with affective and cognitive dimensions. However, central mechanisms for pain remain poorly understood, hindering the development of effective therapeutics. Intracranial pharmacology presents an important tool for understanding the molecular and cellular mechanisms of pain in the brain, as well as for novel treatments. Here we present a protocol that integrates intracranial pharmacology with pain behavior testing. Specifically, we show how to infuse analgesic drugs into a select brain region, which may be responsible for pain modulation. Furthermore, to determine the effect of the candidate drug in the central nerve system, pain assays are performed after intracranial treatment. Our results demonstrate that intracranial administration of analgesic drugs in a targeted region can provide relief of pain in rodents. Thus, our protocol successfully demonstrates that intracranial pharmacology, combined with pain behavior testing, can be a powerful tool for the study of pain mechanisms in the brain.

Here we present a protocol to perform intracranial pharmacological experiments followed by pain behavior assays in rodents. This protocol allows researchers to deliver molecular and cellular targets in the brain, for pharmacologic agents in the treatment of pain.

Intrakranielle Pharmakotherapie und Schmerz-Assays bei Nagern

Pain is a salient sensory experience with affective and cognitive dimensions. However, central mechanisms for pain remain poorly understood, hindering the ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

Quantitative Messung von intrathecally Synthetisierten Proteinen bei Mäusen

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and traumatic brain injury (TBI). Zebrafish are an important neuroscience model due to their transparency during development and robust regenerative capabilities following neurotrauma. While various cognitive tests exist in zebrafish, most of the cognitive assessments that are rapid examine non-associative learning. At the same time, associative-learning assays often require multiple days or weeks. Here, we describe a rapid associative-learning test that utilizes an adverse stimulus (electric shock) and requires minimal preparation time. The shuttle box assay, presented here, is simple, ideal for novice investigators, and requires minimal equipment. We demonstrate that, following TBI, this shuttle box test reproducibly assesses cognitive deficit and recovery from young to old zebrafish. Additionally, the assay is adaptable to examine either immediate or delayed memory. We demonstrate that both a single TBI and repeated TBI events negatively affect learning and immediate memory but not delayed memory. We, therefore, conclude that the shuttle box assay reproducibly tracks the progression and recovery of cognitive impairment.

Learning and memory are potent metrics in studying either developmental, disease-dependent, or environmentally induced cognitive impairments. Most cognitive assessments require specialized equipment and extensive time commitments. However, the shuttle box assay is an associative learning tool that utilizes a conventional gel box for rapid and reliable assessment of adult zebrafish cognition.

Shuttle Box Assay als assoziatives Lernwerkzeug zur kognitiven Beurteilung in Lern- und Gedächtnisstudien mit erwachsenen Zebrafischen

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Intracranial Pressure Monitoring In Nontraumatic Intraventricular Hemorrhage Rodent Model

Survivors of intraventricular hemorrhage are often left with significant long-term memory impairment; thus, research utilizing intraventricular hemorrhage animal models is essential. In this study, we sought out ways to measure intracranial pressure, mean arterial pressure, and cerebral perfusion pressure during nontraumatic intraventricular hemorrhage in rats. The experimental design included three Sprague Dawley groups: sham, standard 200 &#181;l intraventricular hemorrhage, and vehicle control groups. By introducing an intraparenchymal fiberoptic pressure sensor, precise intracranial pressure measurements were obtained in all groups. Cerebral perfusion pressures were calculated with the knowledge of intracranial pressure and mean arterial pressure values. As expected, the intraventricular hemorrhage and vehicle control groups both experienced a rise in the intracranial pressure and subsequent decline in cerebral perfusion pressure during intraventricular injection of autologous blood and artificial cerebrospinal fluid, respectively. The addition of an intraparenchymal fiberoptic pressure sensor is beneficial in monitoring precise intracranial pressure changes.

Monitoring intracranial pressure in rodent&#160;models of nontraumatic intraventricular hemorrhage is not common in the current literature. Herein, we demonstrate a technique for measuring intracranial pressure, mean arterial pressure, and cerebral perfusion pressure during intraventricular hemorrhage in a rat&#160;animal model.

Intrakranielle Drucküberwachung im nichttraumatischen intraventrikulären Blutungsmodell

Survivors of intraventricular hemorrhage are often left with significant long-term memory impairment; thus, research utilizing intraventricular hemorrhage ...