Diese Arbeit wurde vom NIH EY 012031 (ET-A), eine Auszeichnung von der FM Kirby Foundation (ET-A), Forschung zur Erblindung, Inc. (MAZ), The New Jersey Lions Eye Research Foundation (MAZ) Prevent unterstützt, The Eye Institute of New Jersey (MAZ), die Joseph J. und Marguerite DiSepio Retina Research Fund (MAZ) und die Janice Mitchell Vassar und Ashby Mitchell Fellowship (AMK).

1. Einen maßgeschneiderten stehen für Zellkultur-Einsätzen Die Basis eines 5 ml Pipettenspitze (ISC BioExpress, # P-3250 bis 19) hat einen Innendurchmesser von 13 mm, das entspricht genau dem Boden Größe (12,6 mm, Außendurchmesser) einer 10 mm (Innendurchmesser) NUNC Zelle Kultur einzufügen (8 um, Polycarbonat-Membran, Thermal, # 137443). Um den Stand, wurde die Pipette nahe der Basis geschnitten, um einen 6 mm langen Hohlzylinder erzeugt. Dann wurden Stücke aus der Seite des Zylinders entfernt mit einer Flamme erwärmt Klinge bis 3 Beine (4 mm in der Höhe) unter einem Ring (2 mm Höhe), die die Höhe der Einsätze um etwa 5 mm angehoben erstellen. 2. Herstellung von sterilen Filterpapier für den Anbau und die Kultur der Schweine Netzhaut Whatman 4M Filterpapier (Kat. Nr. 1004) wurde in eine runde Form (6,3 mm im Durchmesser) mit einem kleinen, dreieckigen Griff, der für die Bewegung der Filterpapier in einem Glasrohr zur Sterilisation oder wenn die Netzhaut angebracht wurde verwendet wurde geschnitten (wie gezeigt, in dem Video). 3. Vorbereitung der Netzhaut Explantate Eyes aus 5 - bis 9-Monate alten, 150-230 lbs, waren amerikanische Yorkshire Schweine aus einem örtlichen Schlachthof innerhalb von drei Stunden Enukleation (Transport auf Eis) gewonnen. Nach der Ankunft, die Augen von fremden Gewebe gereinigt wurden, tauchte in betadine Lösung (10% Povidon-Iod, der Purdue Frederique Company, Stamford, CT) und zweimal in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM mit 1g / l Glucose, L-Glutamin, und Natriumpyruvat, CellGro-mediatech Inc., Manasse, VA) mit 2,5 g / ml Amphotericin B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) ergänzt. Das vordere Segment wurde entfernt, so dass die neuronalen Netzhaut. Six-mm Trepan Klingen (Storz Ophthalmic-Bausch und Lomb, Manchester, MO) wurden verwendet, um äquatorialen, voller Dicke hinteren Segment Explantate abgeschnitten. Die Netzhaut wurde anschließend durch leichtes Anlegen ein Stück trockenes steriles Filterpapier auf die Ganglienzellschicht, Abheben der neuralen Netzhaut, und indem das Filterpapier mit angeschlossenem Netzhaut auf die Kultur legen, Photorezeptoren nach oben abgezogen. Der Einsatz wurde dann in Kulturmedium gebracht, so dass Sie sicher, dass zur Deckung der Netzhaut, in einer 12-well Kulturschale (Fisher). Mehrere Explantate wurden routinemäßig und erhielt kultivierte aus einem einzigen Auge. 4. Gewebekultur Die Retina wurde in Minimum Essential Eagle-Medium (MEM, Invitrogen-Gibco-Life Technologies Inc., Rockville, MD), pH 7,4, ergänzt mit 0,2 mg / ml Glutamin, 10 pg / ml Insulin vom Schwein, 1 mM Pyruvat, 0,1 mM L-Ascorbinsäure, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 250 ng / ml Amphotericin B (Antibiotika antimykotische: Sigma, St. Louis, MO), und kohlensäurehaltiges mit befeuchteten 5% CO 2, Balance Luft, bei 37 ° C. Das Medium wurde alle 2 Tage gewechselt. Tissue kann verwendet werden, behandelt mit einer Vielzahl von Reagenzien oder Sonden oder links für nachfolgende biochemische oder morphologische Analysen unbehandelt. Der folgende Abschnitt beschreibt Verfahren, um konsistente voller Dicke der Netzhaut Querschnitte erstellen. 5. Sectioning <ol><li> Mit einem Kryostat <ol><li> Fix Netzhautgewebe in 4% parafomaldehyde über Nacht bei 4 ° C; </li><li> Das Gewebe spülen kurz mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS); </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Gewebe aus dem Filterpapier, während es in PBS in einer 35 mm Schale mit einem Dissektionsmikroskop; </li><li> Transfer-Gewebe zu 30% Saccharose und halten über Nacht bei 4 ° C; </li><li> Saug entfernt die überschüssige Lösung um das Gewebe zu erhalten, ausreichend Tissue-Tek Medium (OCT Compound 4583), um Gewebe decken, und lassen Sie es bei Raumtemperatur für 2 Stunden einweichen, um das Gewebe durchdringen; </li><li> Baue einen quadratischen Rahmen (10 mm x 10 mm, 5 mm Höhe) mit Dentalwachs und legen Sie sie in das Gewebe, fügen Sie mehr Tissue-Tek Medium mit dem Rahmen (sicherstellen, dass die Gewebeprobe ist flach) und in einen Gefrierschrank zu füllen (- 20 ° C) für mindestens 1 Stunde; </li><li> Übertragen Sie die gefrorene Probe blockieren, um eine Probe-Plattform (sicherstellen, dass die Sample-Block steht senkrecht auf der Plattform); </li><li> Montieren Sie die Probe-Plattform in einem vorgekühlten Kryostaten (-20 ° C, Leica, CM1900) und stellen Sie sicher, dass der Block steht senkrecht auf der Klinge; </li><li> Entfernen Sie das Wachs und den Rahmen zu blockieren, bevor Schneiden des Gewebes in der gewünschten Dicke; </li><li> Setzen Sie die Teile auf Gelatine-behandelten Objektträgern. </li></ol></li><li> Mit einem Vibratom <ol><li> Fix und spülen Sie das Gewebe wie oben für den Kryostat beschrieben; </li><li> Legen Sie das Gewebe in vorgewärmte, geschmolzen 4% Agar in einen kleinen Behälter und halten bei 4 ° C, bis der Agar erstarrt vollständig; </li><li> Mit einem scharfen Messer auf die Agar in einen kleinen Block mit der Gewebeprobe Innenverkleidung; </li><li> Kleben Sie die Sample-Block auf einer Vibratom Probenhalter mit Krazy Kleber (stellen Sie sicher, das Stück Gewebeprobe steht senkrecht auf der Plattform von the Probenhalter, dh senkrecht zur Klinge) und montieren Sie die Halterung auf einem Vibratom Schneidesystem (Leica, Series 1000) mit der Probe Block vollständig im eisigen Wasser getaucht; </li><li> Schneiden Sie die Sample-Block in 50 Abschnitte um und legen Sie sie auf Gelatine-behandelten Folien mit einer weichen Bürste. </li></ol></li></ol> 6. Immunhistochemie Verwenden Sie Standard-Protokoll. Immunolabeled dicke Schnitte können mit einem konfokalen Mikroskop betrachtet werden. 7. Repräsentative Ergebnisse: Morphologie wurde während des Zeitraums von sieben Tagen der Kultur erhalten. Bilder der Netzhaut vor und nach der Kultivierung sind in dem Video.

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	<li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).</li><li>Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+technique+of+adult+retina+for+regeneration+studies+on+adult+CNS+neurons.">A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons.</a> Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+physiologically+functional+adult+mammalian+retinas.">Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas.</a> PLoS One. 2, e221-e221 (2007).</li><li>Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+adult+rabbit+retina.">Organotypic culture of adult rabbit retina.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function:+high+cost+of+Na++transport.">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> J Neurosci. 12, 840-853 (1992).</li><li>Kobuch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+adult+porcine+retina+and+retinal+pigment+epithelium+in+perfusion+culture:+characterisation+of+an+organotypic+in+vitro+model.">Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model.</a> Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).</li><li>Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+organotypic+culture+model+of+adult+mammalian+neurosensory+retina+in+co-culture+with+retinal+pigment+epithelium.">Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).</li><li>Guduric-Fuchs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+study+of+pig+retinal+development.">Immunohistochemical study of pig retinal development.</a> Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).</li><li>Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+density+of+the+domestic+pig+retina.">Photoreceptor density of the domestic pig retina.</a> Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).</li></ol>

Vision-Forscher haben eine Vielzahl von Netzhaut-Kultur etabliert, darunter organotypischen Systeme, um eine Vielzahl von Themen, wie Retina Stammzelltransplantation 1, retinale Regeneration 2 und exogene Genexpression 3-5 studieren. Allerdings ist erwachsener Säugetiere Netzhaut schwer aufrecht zu erhalten in vitro, vor allem aufgrund der hohen Energiebedarf der Photorezeptoren 6. Koizumi et al. Beschrieben ein Kaninchen Netzhaut organotypischen Kultur, in ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen-Gibco </td><td> 10370-021 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml Pipettenspitze </td><td> ISC BioExpress </td><td> P-3250 bis 19 </td><td></td></tr><tr><td> NUNC Zellkultureinsatzes </td><td> Thermisch </td><td> 137443 </td><td> 8μm, Polycarbonat </td></tr><tr><td> Whatman 4M Filterpapier </td><td> Whatman </td><td> 1004 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro-mediatech Inc </td><td> 10 bis 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Fluka </td><td> 05040 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone Amphotericin B </td><td> Invitrogen-Gibco </td><td> 15290018 </td><td></td></tr><tr><td> Trephine Klingen </td><td> Bausch and Lomb </td><td> T3096 </td><td> 6.00mm </td></tr><tr><td> OCT-Verbindung </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 62550-01 </td><td> 4583 </td></tr><tr><td></td><td> Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Leica </td><td> CM1900 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratom </td><td> Leica </td><td> Serie 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Die konfokale Mikroskopie; </td><td> Carl Zeiss </td><td> LSM510 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-synaptischen Vesikel Protein 2 (SV2) monoklonalen Maus-Antikörper </td><td> DSHB </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Anti-sauren Gliafaserproteins (GFAP) polyklonale Kaninchen-Antikörper </td><td> DAKO </td><td> DAKO </td><td></td></tr><tr><td> Propidiumiodid (PI) </td><td> Sigma </td><td> P4170 </td><td></td></tr></tbody></table>

organotypic culture of full-thickness adult porcine retina

Es ist ein anerkannter Bedarf an In-vitro-Modellen, zu ersetzen oder reduzieren kann Tierversuch. Porcine Netzhaut hat eine ähnliche neuronale Struktur der menschlichen Netzhaut und ist daher eine wertvolle Arten für das Studium Mechanismen der menschlichen Netzhaut Verletzungen und degenerativen Erkrankungen. Hier beschreiben wir eine kostengünstige Methode zur organotypischen Kultur von ausgewachsenen Schweinen Netzhaut vor Augen von einem Schlachthof erhalten isoliert. Nach dem Entfernen der vorderen Segment wurde ein Trepan Klinge verwendet, um mehrere neurale Retina-Bruch-Membran-RPE-Aderhaut-Sklera Explantate aus dem hinteren Bereich des ausgewachsenen Schweinen Augen zu schaffen. Ein Stück sterile Filterpapier wurde verwendet, um die neuronalen Netzhaut abhebt von jedem Explantat. Das Filterpapier-Retina-Komplex wurde kultiviert (Photorezeptor Seite nach oben) auf dem Gipfel eines Einsatzes, die vom Boden der Kulturschale mit einem maßgeschneiderten Stand gehalten wurde. Der Stand ermöglicht eine gute Zirkulation des Kulturmediums auf beiden Seiten der Netzhaut. Insgesamt ist dieses Verfahren einfach, reproduzierbar und erlaubt Erhaltung der einheimischen retinalen Struktur für mindestens sieben Tage, so dass es ein nützliches Modell für eine Vielzahl von morphologischen, pharmakologische und biochemische Untersuchungen an Säugetieren Netzhaut.

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Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

Hier beschreiben wir eine kostengünstige Methode zur organotypischen Kultur von ausgewachsenen Schweinen Netzhaut für sieben Tage. Kurz gesagt, wurde ein steriles Filterpapier verwendet, um die neuronalen Netzhaut abheben von der RPE und Ort Photorezeptor Seite nach oben auf einem Einsatz von einem maßgeschneiderten Stand angehoben.

Organotypischen Kultur der Full-Dicke ausgewachsenen Schweinen Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

organotypic-culture-of-full-thickness-adult-porcine-retina

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14.8K Aufrufe.  University of Medicine and Dentistry of New Jersey - UMDNJ. Hier beschreiben wir eine kostengünstige Methode zur organotypischen Kultur von ausgewachsenen Schweinen Netzhaut für sieben Tage. Kurz gesagt, wurde ein steriles Filterpapier verwendet, um die neuronalen Netzhaut abheben von der RPE und Ort Photorezeptor Seite nach oben auf einem Einsatz von einem maßgeschneiderten Stand angehoben.