Diese Methode kann helfen, geschlechtsabhängige Unterschiede in den neurogenen Nischen zu untersuchen und ihre Neuroplastizität zu verstehen, Veränderungen, die soziale Interaktionen in der Präriewühlmaus unterstreichen. Der Test von Neurosphären ist ein ausgezeichnetes Werkzeug, um das Proliferations- und Differenzierungspotenzial von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen zu bestimmen. Um zu beginnen, legen Sie eine Petrischale auf eine Oberfläche von Eis umgeben.
Legen Sie das Gehirn auf der Schale und fügen Sie 20 Milliliter kalte Waschlösung. Teilen Sie das Gehirn in der koronalen Ebene mit einem Skalpell in zwei Gewebeblöcke auf, wodurch der Schnitt auf Bregma-Niveau in der vorderen-hinteren Achse durchgeführt wird. Extrahieren Sie die subventrikuläre Zone, oder VZ, Gewebe aus dem Rostralblock, und der Dentate Gyrus, oder DG, Gewebe aus dem kaudalen Block.
Um die VZ zu sezieren, halten Sie eine der Hemisphären mit einer Dumont Zange, und legen Sie die feinen Spitzen einer zweiten Zange unter das Gewebe, das das Caudate-Putamen auskundungen. Öffnen Sie die Zange entlang der dorsal-ventralen Achse, um das Gewebe zu trennen, und sammeln Sie die VZ in einem Zentrifugenrohr mit zwei Milliliter kalter Waschlösung. Das Gewebe von mehr als zwei Tieren nicht bündeln.
Wiederholen Sie die Mikrodissektion in der anderen Hemisphäre und lagern Sie die Röhre mit dem Gewebe auf Eis. Um die DG zu sezieren, verwenden Sie ein Skalpell, um einen koronalen Schnitt in den kaudalen Block zu machen, um zwei Scheiben zu erhalten, in denen die Hippocampusbildung beobachtet wird. Verwenden Sie Dumont Zangen, um eine der Scheiben zu halten, und machen Sie einen horizontalen Schnitt zwischen DG und CA1 mit einer anderen Zange.
Machen Sie dann einen vertikalen Schnitt zwischen der GD und CA3, um die GD zu trennen. Wiederholen Sie die Sezieren in der anderen Hemisphäre der ersten Scheibe, dann in beiden Hemisphären in der zweiten Scheibe. Sammeln Sie die vier DG-Stücke jeder Wühlmaus in einem Zentrifugenrohr. Legen Sie die Zentrifugenrohre in den Biosicherheitsschrank und warten Sie etwa 10 Minuten, bis die Gewebefragmente durch die Schwerkraft ausfallen.
Dann entfernen Sie die Waschlösung und fügen Sie jedem Rohr einen Milliliter warmer enzymatischer Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Rohre bei 37 Grad für 10 Minuten. Um die Gewebefragmente aufzulösen, pipette sie auf und ab mit einer Ein-Milliliter-Spitze, aber nicht Pipette mehr als 30 Mal.
Wiederholen Sie die Inkubation bei 37 Grad Celsius, dann pipette das Gewebe wieder. Fügen Sie neun Milliliter N-2 Medium zu jedem Rohr hinzu, um die enzymatische Behandlung zu verdünnen, und zentrifugieren Sie die Rohre bei 200 mal g für vier Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern N-2 Medium und wiederholen Sie die Zentrifugation.
Entfernen Sie den Überstand aus jedem Rohr, und setzen Sie die Zellpellets der VZ und DG in zwei Millilitern bzw. einem Milliliter des B-27-Mediums wieder auf. Filtern Sie jede Zellsuspension mit einem 40-Mikrometer-Zellsieb, um nicht verdautes Gewebe zu entfernen. Kultur die gefilterten Zellen in einer ultra-niedrigen Befestigung 24-Well-Platte, mit zwei Brunnen für die VZ und eine Gut für die DG. Fügen Sie 20 Nanogramm pro Milliliter Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 und 20 Nanogramm pro Milliliter epidermalen Wachstumsfaktors zu jedem Brunnen hinzu, und brüten Sie die Platte dann 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und hoher Luftfeuchtigkeit auf.
Nach der Inkubation die Hälfte des Kulturmediums entfernen und durch frisches B-27-Medium ersetzen, ergänzt durch doppelte Konzentrationen der Wachstumsfaktoren. Wiederholen Sie diesen Vorgang jeden dritten Tag. An Tagen, an denen es nicht notwendig ist, das Kulturmedium zu ändern, fügen Sie Wachstumsfaktoren zu einer endgültigen Konzentration von 1X hinzu.
Neurosphären wurden aus den neuronalen Stammzellen gebildet, die aus der subventrikulären Zone isoliert wurden, und dentate Gyrus von weiblichen und männlichen erwachsenen Präriewühlmäusen. Obwohl es Trümmer in der Primärkultur gab, waren nach der ersten Passage nur Neurosphären vorhanden. Eine höhere Anzahl von Neurosphären wurden aus der weiblichen subventrikulären Zone als aus der männlichen subventrikulären Zone oder dem Dentate Gyrus von Frauen und Männern gewonnen, was darauf hindeutet, dass die Anzahl der erhaltenen Neurosphären von der proliferativen Zone und dem Wühlmaus-Sex abhängt.
Der Durchmesser der Neurosphären wurde an den Tagen 8, 11 und 14 gemessen. Es nahm schrittweise für männliche und weibliche Wühlmäuse in beiden neuronalen Regionen, aber Neurosphären aus dem männlichen Gehirn abgeleitet waren kleiner im Vergleich zu denen aus dem weiblichen Gehirn abgeleitet. Anhaftende Neurosphären wurden am sechsten Tag in Gegenwart von Wachstumsfaktoren oder am 15. Tag ohne Wachstumsfaktoren charakterisiert.
Am sechsten Tag exprimierten die neurosphärenabgeleiteten Zellen unter undifferenzierten Bedingungen Nestin, einen Marker für neuronale Vorläufer. Es war auch möglich, Doppelkortin-positive Zellen und den Proliferationsmarker Ki-67 zu identifizieren, die auf das Vorhandensein von neuronalen Vorläufern oder unreifen Neuronen hinweisen. Jedoch, der Mangel an Kolokalisierung von Ki-67 mit DCX deutete auf das Vorhandensein von post-mitotischen Neuroblasten.
Am 15. Tag wurden unter Differenzierungsbedingungen reife Neuronen und Zellen mit dem gliaalen Phänotyp gefunden, die das Differenzierungspotenzial der isolierten Zellen demonstrierten. Beim Versuch dieses Protokolls, denken Sie daran, dass in der Lage zu erkennen und mit früheren Praxis in Mikrodissektion ist von grundlegender Bedeutung, nur Zellen aus den neurogenen Nischen zu isolieren. Nach diesem Protokoll können Experimente entwickelt werden, um Mechanismen zu identifizieren, die an der Proliferation, Differenzierung und des Überlebens von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen beteiligt sind, Prozesse, die in der Präriewühlmaus noch unbekannt sind.
