Wir danken Peking Wu für die Verwendung ihrer Daten. Diese Arbeit wurde durch einen NSF CAREER Award an JEK unterstützt

1. Vorbereitung von ~ 50 nm Durchmesser kleine unilamellare Vesikel (SUVs) für Membrane Protein Folding <ol><li> Eine Lösung von 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) Lipide in Chloroform gekauft und aliquotiert in saubere Glasflaschen in 20 mg pro Fläschchen Mengen für die Lagerung. Eine Schicht von Stickstoffgas wird jedem Fläschchen gegeben, um Lipid Oxidation zu verhindern, und die Ampullen sind mit Kappen und Parafilm versiegelt. Die Fläschchen sind in einem -20 ° C Gefrierschrank bis zur Verwendung gelagert. </li><li> Ein einziges Fläschchen, dass ein Aliquot von 20 mg Lipid in Chloroform enthält, ist für jedes Experiment verwendet. Der Inhalt des Fläschchens werden getrocknet mit einem Strom von Stickstoffgas für 1 Stunde, bis kein Lösungsmittel bleibt. </li><li> Getrocknete Lipide werden in 1 ml 20 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH = 7,3) mit einem Wasser-Ultraschallbad für ca. 30 Sekunden. Diese Lösung suspendiert Lipid erscheint bewölkt, und ist mit einem Kunststoff-15-ml-Röhrchen mit konischem Boden übertragen. Ein weiteres 1 mL Aliquot Phosphatpuffer wird die leere Glasflasche, die ursprünglich Lipid enthaltenen hinzugefügt und Beschallung wird wiederholt, die Lösung wird dann auf den gleichen 15-ml-Röhrchen gegeben. Dieser Vorgang wird insgesamt 4-mal wiederholt, bis der letzte Band in das Rohr 4 mL, was zu einer Lipid-Konzentration von 5 mg / mL in diesem Bestand Vesikel-Lösung. </li><li> Die 4 mL Volumen von Lipid-Vesikel-Lösung ist in einem warmen platziert (~ 30 ° C) Wasserbad, und beschallt mit einem Ultraschallgerät Mikrospitze für 1 Stunde bei 50% Einschaltdauer. Der Zweck des Wasserbades ist zweifach. Erstens verhindert sie die Lipid-Lösung zu heiß wegen der Beschallung Prozess. Zweitens sorgt das warme Bad, dass die Temperatur der wässrigen Lösung Lipid-Doppelschicht oberhalb der Phasenübergangstemperatur während der Beschallung bleibt; für DMPC, ist dieser Übergang Temperatur ~ 23 ° C. </li><li> Die beschallte Lösung wird durch ein 0,22 um Spritzenfilter, um Schmutz aus dem Ultraschallgerät Spitze zu entfernen, und das filtrierte Lösung wird äquilibriert über Nacht bei 37 ° C bestanden </li></ol> 2. Probenvorbereitung für die anfängliche Fluoreszenz Unfolding Curve <ol><li> Eine Stammlösung von 10 M Harnstoff in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,3) hergestellt wird. Es ist wichtig, dass das Wasser in den festen (und nicht umgekehrt) hinzugefügt werden, da die große Menge an Harnstoff nimmt eine bedeutende Volumen in der Lösung. Diese Harnstofflösung kann durch Zugabe von gelösten Stoffen, um eine saubere, leere Flasche und das Hinzufügen von Wasser bis zu den beabsichtigten Endvolumen aufgefüllt werden. Diese Lösung kann verlangen, Erwärmung im Wasserbad oder auf einer Heizplatte unter Rühren auf den gelösten Stoff aufzulösen. Harnstoff ist hygroskopisch und deshalb die tatsächliche Konzentration der Harnstofflösung soll anhand Brechungsindex werden. 1 </li><li> Eine Aktie Pufferlösung von 20 mM Phosphat (pH 7,3) hergestellt wird. </li><li> Eine Stammlösung von entfalteten Proteins hergestellt wird. Dieser Bestand Protein-Lösung soll eine Konzentration von ~ 200 nM Protein in 8 M Harnstoff, 20 mM Phosphat-Puffer haben. </li><li> Die Proben für die Fluoreszenz-Studien sind in der folgenden Weise hergestellt. Entsprechende Mengen auf Lager Protein (Abschnitt 2.3), hat Lipid-Lösung (5 mg / ml Lipid, Abschnitt 1), hat 10 M Harnstoff-Lösung (Abschnitt 2.1) und Lager-Phosphat-Puffer (Abschnitt 2.2) kombiniert werden, um Proben mit ~ 4 machen uM Protein, 1 mg / mL Lipid und 0 bis 8 M Harnstoff in 1 m-Schritten. Das Gesamtvolumen jeder Probe wird 200 pl. Ein Beispiel-Tabelle (Tabelle 1) enthalten ist, die Listen von Volumes unter Verwendung einer 200 uM Lager Protein-Lösung erforderlich. </li><li> Blank-Proben gemacht werden, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben, ist aber Protein nicht hinzugefügt. An die Stelle des Proteins, 4. Mai ul einer 8 M Harnstoff-Lösung hinzugefügt, so Konzentrationen von anderen Komponenten identisch mit denen in Abschnitt 2.4 sind. Diese Rohlinge werden verwendet, um Streuung und andere Hintergrund-Signal, dass in der Fluoreszenz-Spektren von Protein scheint zu subtrahieren. </li><li> Die Proben aus den Abschnitten 2.4 und 2.5 sind bei 37 ° C für mindestens 2 Stunden inkubieren, bevor die Messung von Fluoreszenz-Spektren, um komplette Falt-und Gleichgewichts zu gewährleisten. </li></ol> 3. Die Messung der Fluoreszenz-Spektren Tryptophan-Fluoreszenz jeder Probe und Blank wird mit einem steady-state-Fluorometer. Fluoreszenzspektren sollte mit Anregungswellenlänge von 290 nm aufgezeichnet werden, um Anregung von Tyrosinresten zu vermeiden, und gescannte 305 bis 500 nm liegt. Typische Ein-und Ausgang Bandpass ist 3 nm. Die Wellenlänge Inkrement-und Integrationszeit für Signal-Rausch-Verhältnis optimiert werden. Typische Werte für Wellenlängen Inkrement-und Integrationszeit sind 1 nm / Schritt und 0,5 sec / Schritt jeweils. Membranproteine ​​in der Regel falten sich in synthetischen Lipiden nur dann, wenn die Temperatur über die Doppelschicht Phasenübergangstemperatur ist. Daher wird in diesem Fall von DMPC, ist die Temperatur der Probe konstant gehalten ° bei 30 C. Ein Mikrovolumens Quarzglas-Küvette mit 160 ul beträgt in diesen ex genutztExperimente. 4. Generierung von Initial Unfolding Curve und Abschätzung der Gibbs-Membrane Protein Unfolding <ol><li> Fluoreszenzspektren in Form eines xy Dataset in Software wie Igor Pro, Matlab, Origin oder Excel geladen. </li><li> Signal aus dem Harnstoff-und Lipid-Vesikel Hintergrund muss subtrahiert mit dem folgenden Verfahren werden: Spectrum A = raw Fluoreszenzspektrum von Proteinen in Gegenwart von Lipid-Vesikel und spezifische Konzentration von Harnstoff. Spectrum B = raw Fluoreszenzspektrum entsprechenden Blindprobe, die Lipid-Vesikel und gleichzeitig Harnstoffkonzentration enthält als die in Spektrum A; kein Protein ist in der Blindproben. Korrigierte Spectrum = Spectrum A - C * Spektrum B. C ist ein Skalar typischerweise gleich 1,0. In einigen Fällen ist C kleiner oder größer als 1,0 aufgrund der Streuung eines Problems, bei Über-oder Unter-Subtraktion in der Nähe des ~ 305-320 nm-Bereich. </li><li> Die Wellenlänge der maximalen Fluoreszenz, λ max, ist von korrigierten Spektren für jeden Harnstoffkonzentration tabellarisch dargestellt. Ein typischer Wert für voll entfalteten Membranprotein ist 350 nm, während die von gefalteten Proteins ist ~ 330 nm. Tabellarische Wellenlängen sind Bruchteil umgewandelt entfaltet durch die Umwandlung der Palette von λ max-Werte (~ 330 bis ~ 350 nm) auf den Bereich von 0,0 bis 1,0, die λ max-Wert um Bruchteil entfaltet Bevölkerung korrelieren. Zum Beispiel kann ein λ max-Wert von 330 nm bis 0,0 entspricht, entspricht 350 nm bis 1,0, und 340 nm entspricht 0,5 in der Fraktion entfaltet. Diese Fraktion der entfalteten Proteins wird dann gegen Harnstoff-Konzentration aufgetragen. Wie bereits erwähnt, sollte die Harnstoffkonzentration experimentell durch Messung Brechungsindex bestimmt werden. </li><li> Wir gehen davon aus, dass das Protein in einem von zwei Zuständen existieren: gefaltet oder entfaltet. Die Handlung von Teil entfaltet, f, im Vergleich zu Harnstoff-Konzentration, C, kann die Gleichung angepasst werden: 2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="Gleichung 2" /> Der Koeffizient m entspricht der Geschwindigkeit der Änderung der freien Energie in Bezug auf Denaturierungsmittel Konzentration und C m entspricht dem Mittelpunkt Harnstoff Konzentration, bei der das gefaltete Bevölkerung entspricht entfalteten Bevölkerung. Diese Werte sind die passenden Variablen aus der kleinsten Quadrate durch Daten-Analyse-Software erhalten. R (0.001987 kcal / mol • K) wird das Gas-Konstante und T die Temperatur (303 K). </li><li> Die Koeffizienten aus der fit erhalten werden eingesetzt, um die Gibbs-Energie (kcal / mol) der Entfaltung in Abwesenheit von Harnstoff zu bestimmen: <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="Gleichung 3"/> . </li></ol> 5. Optimierte Unfolding Curve für genauere Messung der Gibbs-Energie der Entfaltung. <ol><li> Die Entfaltung Kurve oben beschrieben zeigt die Palette von Harnstoff-Konzentrationen, die die größte Veränderung in der λ max Ursachen. Dieser Bereich ist in der Regel klein, und die Mehrheit der Entfaltung stattfindet, in diesem kleinen Bereich. Um genau zu bestimmen, die freie Energie der Entfaltung, werden zusätzliche Proben in dieser Region analysiert werden, um ein Grundstück, dass viele Datenpunkte, die für optimierte kleinsten Quadrate befinden, zu erlangen. Zum Beispiel, wenn das Protein entfaltet sich zwischen 2 und 4 M Harnstoff, können die Proben gemacht, dass enthalten 2 - 4 M Harnstoff in 0,2 M Schritten genauer zeigen die Form dieser wichtigen Region in der sich entfaltenden Kurve. Es ist nicht notwendig, um leere Spektren bei jedem Harnstoffkonzentration zu messen, es reicht aus, um eine leere Spektrum messen jede ~ 0,5 M Schritt. </li><li> Die freie Energie der Entfaltung von diesem Grundstück erhalten können geringfügig von der in der ursprünglichen Entfaltung Kurve erhalten, sondern spiegelt einen genaueren Wert. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: <table border="1"><tbody><tr><td> Probe </td><td> endg. [Urea], M </td><td> Lager-Protein (ul) </td><td> Lager Lipid (ul) </td><td> Sofort lieferbar 10 M Harnstoff (ul) </td><td> Lager-Puffer (ul) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ~ 0,16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Volume von Stammlösungen benötigt, um Fluoreszenz-Proben machen <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Tryptophan-Fluoreszenz-Spektren von ~ 5 uM Vertreter Membranprotein, dass eine einzige Tryptophanrest enthält. (A) Raw Fluoreszenzspektren von Protein (Spektrum A von 4,2), (B) Raw Fluoreszenzspektren blank (Spektrum B von 4,2), (C) Berichtigt Spektrum von 4,2. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Korrigierte Tryptophan Fluoreszenzspektren von Membranproteinen aus Abbildung 1 für eine Vielzahl von Harnstoff-Konzentrationen. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Unfolding Kurve aus den Daten in Abbildung 2 erhalten, mit fit Gleichung in 4.4. Die Gibbs-Energie ist nach Abschnitt 4.5 berechnet.

<ol>
	<li>Shirley, B. A., Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Folding and Stability. , 177-190 (1995).</li><li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves.">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li><li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein.">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li><li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro.">&#946;-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li><li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+scene+investigation:+membrane+proteins.">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li><li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces.">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li><li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Tryptophan+Microenvironment,+Soluble+Domain,+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding:+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA.">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li></ol>

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Generation der Entfaltung Kurven von Membran-assoziierte Proteine ​​und Peptide, die Tryptophan enthalten. Hier wird davon ausgegangen, dass die Tryptophan-Fluoreszenz spiegelt, ob das Protein gefaltet ist und eingefügt in synthetische Lipidvesikel oder entfaltet in Lösung. Zusätzliche Annahmen, wie zB Zwei-Staaten-Faltung und lineare Abhängigkeit der freien Energie mit Denaturierungsmittel Konzentration, sind in dem aktuellen Bericht gemacht;. Modifikation von diesen Annahm...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850345C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biochemicals</td>
<td>04821527</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P288</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P285</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

thermodynamics of membrane protein folding measured by fluorescence spectroscopy

Membrane Proteinfaltung ist ein aufstrebendes Thema sowohl mit Grundlagen-und gesundheitsbezogene Bedeutung. Die Fülle von Membranproteinen in der Zelle zugrunde liegt die Notwendigkeit einer umfassenden Studie über die Faltung von dieser allgegenwärtigen Familie von Proteinen. Darüber hinaus haben Fortschritte in unserer Fähigkeit, Krankheiten, die mit falsch gefalteten Proteinen assoziiert kennzeichnen signifikante experimentelle und theoretische Anstrengungen auf dem Gebiet der Proteinfaltung motiviert. Schnelle Fortschritte in diesem wichtigen Bereich ist leider durch die inhärenten Herausforderungen mit Membranproteinen und der Komplexität der Klappmechanismus verbunden behindert. Hier skizzieren wir ein experimentelles Verfahren zur Messung der thermodynamischen Eigenschaft der Gibbs-Energie der Entfaltung in Abwesenheit von Denaturierungsmittel, Δ G ° H 2 O, für eine repräsentative integrales Membranprotein von E. coli. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Anwendung der Fluoreszenz-Spektroskopie, um das Gleichgewicht Populationen von gefalteten und ungefalteten Zuständen als Funktion der Denaturierungsmittel Konzentration zu bestimmen. Experimentelle Überlegungen für die Herstellung von synthetischen Lipidvesikeln sowie wichtige Schritte in der Datenanalyse Verfahren sind hervorgehoben. Diese Technik ist vielseitig und kann mit verschiedenen Arten von Denaturierungsmittel, einschließlich Temperatur und pH-Wert, sowie in verschiedenen Umgebungen Faltung von Lipiden und Mizellen verfolgt werden. Das aktuelle Protokoll ist eine, die verallgemeinert werden, um eine Membran oder lösliches Protein, das die Kriterien erfüllt, kann unten besprochen.

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Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Dieses Video Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur Erlangung der Gibbs-Membran Proteinfaltung durch Tryptophan-Fluoreszenz.

Thermodynamik der Membrane Protein Folding durch Fluoreszenz-Spektroskopie

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

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18.2K Aufrufe.  University of California San Diego - UCSD. Dieses Video Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur Erlangung der Gibbs-Membran Proteinfaltung durch Tryptophan-Fluoreszenz.

Serie: Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Forschung

Biotechnik

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Mikrofluidischen Mischern für ein Studium Proteinfaltung

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Herstellung von extrazellulären Matrix Proteinfasern für Brillouin-Spektroskopie

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Engineering-"Golden" Fluoreszenz durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren und Protein-Analyse durch Massenspektrometrie und Fluoreszenz

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

Molekulare Federkonstantenanalyse mittels Biomembran-Kraftsondenspektroskopie

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...