Bu çalışma NIH (U54HD41857 ve PL1EB008542, Oncofertility Konsorsiyumu Yol Haritası hibe içinde P30 Biyomalzeme Çekirdek) tarafından finanse edildi.

1. Folikül İzolasyon Northwestern Üniversitesi kurallar ve düzenlemeler, Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri tarafından belirlenen ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım için kurulan Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı protokolü uyarınca hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı. Optimal sonuçlar için, tüm diseksiyonları bakteriyel kontaminasyonu en aza indirmek için 37 ° C sıcaklık kontrolü için ısıtmalı aşamaları ve temiz bir bankta, CO 2 ortam düzeyde L15 medya pH kontrolü için yapılır. Diseksiyonu medya (DM), 50 IU / ml penisilin ve 50 ml / ml streptomisin ve% 1 FBS ile takviye L15 medya ile hazırlanmıştır. Bakım medya (AA) 50 IU / ml penisilin ve 50 ml / ml streptomisin ve% 1 FBS ile takviye αMEM medya ile hazırlanmıştır. <ol><li> 16 günlük fare taze disseke yumurtalıklar,% 0.1 kollajenaz ve% 0.1 DNaz içeren 1-2 ml MM ile yeni bir 35 mm Petri kabı içine aktarın. 37 ° C ve% 5 CO 2 bir inkübatör içinde 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan sonra, kollajenaz çıkarın ve sonra taze DM 35 mm Petri kabında transfer DM birkaç yıkama adımları uygulayın. Yavaşça atılan şırınga bağlı iki 28 5 / 8 göstergesi iğneler kullanarak tüm yumurtalık (veya kesme) folikülleri uzak Flicking yumurtalık folikülleri izole edin. Folikülünün bütünlüğüne zarar vermeden, mümkün olduğu kadar çok stroma olarak çıkarın. Yumurtalık başına 20-40 ikincil foliküller (130-150mm) parçalara ayır. Bu foliküller genellikle 2-3 kat somatik hücre var. </li><li> 60 mm IVF (in vitro fertilizasyon) Petri kabı ve dış bilezik 3 mL MM merkezi için 1 ml MM ekleyin. Kısaca durulama IVF çanak dış halka bir pipet ile sağlam folikülleri aktarın ve sonra seçici (1.4 &#39;e bakınız) merkezi bir kuyunun içine aktarabilirsiniz . Inkübatör bu IVF çanak saklayın. </li><li> Bütün kökler toplandıktan sonra, seçim adım 5-8x büyütme ile bir diseksiyon mikroskop altında yapılır. Sağlıklı folikülleri aşağıdaki morfolojik özellikleri: <ul><li> 2-3 somatik hücre tabakaları </li><li> 130-150 mm </li><li> Oosit ve somatik hücre arasında hiçbir ayrım </li><li> Bozulmamış ve yuvarlak oosit Kapsülleme için tüp bebek yemekleri merkezi haline sağlıklı folikülleri aktarın. </li></ul></li></ol> 2. Folikül Encapsulation, Yöntem 1 - &quot;Bırak Yöntemi&quot; <ol><li> IVF çanak ortasına 40 mM CaCl 2 ile 50 IU / ml trombin TBS içinde 1 ml ekleyin. Çözülme ve buz üzerinde fibrinojen stok tutmak (TBS 50 mg / ml). Fibrinojen hakkını kullanmak önce oda sıcaklığına kadar getirin. </li><li> Karıştırma 1x PBS,% 0.5 PBS çözüm aljinat ve 50 mg / ml fibrinojen çözüm 02:01:01 oranı 1.7 ml steril mikrosantrifüj tüp fibrinojen / aljinat çözeltisi hazırlayın. Çözüm kabarcıkları tanıtan kaçının. Yavaşça girdap ve spin-aşağı. Çözümü biraz bulanık görünür ve kullanmadan hemen önce hazırlanmalıdır. </li><li> Fibrinojen / Bir IVF çanağı dış halka aljinat çözüm iki damlacıkları: kapsülleme ve yıkama için 10 mcL damlacık için 90 mcL damlacık yerleştirin. Buharlaşma azaltmak için, ısıtma aşamasında diseksiyon mikroskobu kapatın. 200 mikron mikropipet ucu ve hızlı bir şekilde karıştırın kullanarak kültür ortamı (5 mcL) asgari bir miktarı ile 10 mcL damlacık içine transfer 10-15 folikülleri. Ilk damla çözüm en az bir miktarı (&lt;5 mcL) ve karışımı ile 90 mcL damlacık tüm foliküllerin içine aktarın. </li><li> Aynı zamanda bir folikülü IVF çanak trombin / Ca 2 + çözüm içine 10 mcL pipet, ve bırakın kullanarak fibrinojen / aljinat çözüm 5 mcL aspirat. Tüm foliküller kapsüllü kadar bu adımı tekrarlayın. </li><li> Cross-Link trombin / Ca 2 + çözüm 5-7 dakika boncuk. Boncuk fibrin jel veya koyu hale gelecektir. Ilk koyu boncuklar ile başlayan, AA içeren bir Petri kabı içine boncuk aktarın. 15-30 dakika kalan trombin durulayın inthe inkübatör için çanak inkübe edin. </li><li> Hemen 100 folikül gelişimi medya mcL ve görüntü içeren 96 kuyu kültür plaka içine boncuk aktarın. Büyüme ortamı (GM) rekombinant FSH 10 mIU / mL, 3 mg / ml BSA ile desteklenmiş αMEM medya ile hazırlanan, 1 mg / mL sığır fetuin, 5 mg / ml insülin, 5 mg / ml transferrin, 5 ng / ml selenyum. </li></ol> 3. Folikül Encapsulation, Yöntem 2 - &quot;Parafilm Yöntemi&quot; <ol><li> % 0.5 aljinat çözeltisi ve 50 mg / ml fibrinojen solüsyonu 1.7 ml steril mikrosantrifüj tüp 1:1 oranında karıştırılarak fibrinojen / aljinat çözüm hazırlayın. </li><li> 3 mm ayırıcılar ile parafilm kaplı cam slayt üzerine fibrinojen / aljinat karışımı Pipet 7.5 mcL damla. Bir minima her damla içine 1 folikül transferMedya l miktarı. </li><li> 7.5 mcL trombin / Ca 2 + çözüm, her bir damla ekleyin. Jel oluşturması nedeniyle neredeyse anında Karıştırma gereksizdir. </li><li> Ikinci parafilm kaplı cam slayt jeller Kapak, 100 mm Petri kabı baş aşağı slaytları koyun, 5 dakika boyunca inkübatör transfer. </li><li> AA içeren bir Petri kabı içine boncuk aktarın ve kültürünün yanı sıra daha önce açıklanan içine. Boncuklar birbirine yapışırsa, boncuklar arasında çapraz bağlantı nedeniyle, hafifçe forseps ile ayrılmış olabilir. </li></ol> 4. Folikül Görüntüleme ve Medya değiştir <ol><li> Her 2 günde bir, kültürlü foliküllerinin bir ışık mikroskobu ve folikülün çapı yazılım programı ImageJ ile ölçülür kullanarak görüntülü. </li><li> Her 2 günde bir, taze, ön-dengelenmiş büyüme medya tarafından, yarısı büyüme ortamı (50 mcL) değiştirilmiştir. </li></ol> 5. 3D Matrix ve in vitro Oosit Olgunlaşma Folikül Kurtarma (IVM ) <ol><li> Kültür 8 gün sonra, hidrojeller net bir fibrin bileşeni tamamlamak bozulması nedeniyle görünür ve köklerinin 300-400 mikron çapında genişletmek. Kalan aljinat aljinat liaz, özellikle aljinat düşürür ve hayvan hücreleri etkilemez bitki kaynaklı bir enzim tarafından parçalanır. </li><li> Boncuklar içeren kuyulardan büyüme ortamı çıkarın ve 10 IU / αMEM mL aljinat liaz 100 ml. Inkübatör plaka 25-30 dakika bırakın. </li><li> Künt bir son ucu ile çözünmüş boncuk folikülleri çıkarın. DM içeren bir IVF çanak dış halka ilk transferi ve daha sonra merkezi haline iyi yıkamak için DM içeren. </li><li> Yıkandıktan sonra, kıl foliküllerinin dış transferi, ve olgunlaşma medya içeren bir IVF çanak daha sonra iç bilezik, in vitro maturasyon medya (IVM) αMEM,% 10 FCS, hCG 1.5 IU / mL oluşur ve 5 ng / ml epidermal büyüme faktörü (EGF) </li><li> 15-16 saat CO 2 inkübatör aktarın. Kümülüs hücreleri genişlemesi için folikülleri inceleyin. Oosit kümülüs hücreleri çıkarmak, nihai konsantrasyonu hiyalüronidaz çözüm eklemek 0,1 mg / ml ve 2-3 dakika inkübatörde inkübe. Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme kesme oosit kümülüs hücreleri 75 mm mikropipet ucu kullanın. Bir ışık veya bir diseksiyon mikroskobu altında oosit olgunlaşma aşamasında belirleyin. Olası aşamaları, en en olgun, <ul><li> Dejenere. Oosit, iki veya daha fazla parçalar halinde parçalanır. </li><li> Germinal vezikül (GV) evre. Oosit, oosit (GV) çekirdeğin varlığı ile devam açıktır hCG maruz yanıt mayoz devam etmedi. </li><li> Germinal vezikül dağılımı (GVBD). Nükleer membran oosit yoktur, ama kutup vücut mevcut yoktur. Bu nedenle, oosit mayoz-I halen devam etmektedir. </li><li> Metafaz-II tutuklandı oosit (MII). Oosit mayoz devam etti ve şimdi metafaz-II tutuklandı. Bir kutup vücudun bir ışık veya bir diseksiyon mikroskobu görünür olmalıdır. Daha sonraki deneylerde döllenmiş sürece oosit MII kalacaktır. </li></ul></li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: (Şekil 1) in vitro kültür için bir FA-IPN over foliküllerinin bir roman kapsülleme yöntemi tanımladı. Over foliküllerinin somatik hücre bazı katmanlar tarafından çevrili bir oosit oluşur. Birden fazla hücre bölmeleri arasındaki iletişim sağlıklı folikül gelişimi ve oosit olgunlaşması için gereklidir. Folikül 9,11,12 mimarisi korurken 3D hidrojel Folikül kapsülleme folikül genişleme destekler. Folikül gelişmeye olduğu gibi, onların hacmi katlanarak genişler ve kapsülleme biyomateryal inhibe bir basınç kuvveti gelişimi olmadan bu genişleme izin vermelidir. FA-IPN fibrin plazmin tarafından folikül aktif ve aljinat (Şekil 2) 13 ve biyolojik olarak tesirsiz proteolitik parçalanabilir iki doğal malzemelerden yapılmış bir ağdır. Folikül gelişimi sırasında, fibrin yıkım folikül yakın yerel başlar ve fibrin hidrojel temizlenir kadar devam eder. Kültür dönemi boyunca bozulmadan kalır-bozunur olmayan aljinat bileşeni, hidrojel 3 boyutlu yapısını destekler. Foliküllerin gelişme ikinci aşama (150-180 mikron çapında) izole ve FA-IPN jeller gelişme antral aşamada 400 mm genişletildi. HCG stimülasyon, kültürlü folikülleri, cumulus hücre genişleme geçmesi ve oositlerin döllenme için metafaz II mayoz ve ilerlemeye devam edebilirsiniz. Bu sonuçlar, kapsülleme yöntemini ve kapsülleme malzemesi in vitro (Şekil 3) follikül kültür ve başarılı bir olgunlaşma izin öneririz . Encapsul etrafında fibrin yıkımated folikülleri kültürünün ilk günü başlar ve 6 günde tamamlanmıştır. Aprotinin, çözünen bir plazmin inhibitörü, fibrin yıkım değiştirmek ve kapsülleme malzemesi (Şekil 4) mekanik degrade uzatmak için kullanılabilir. Eğer foliküllerinin 0.01 TIU / ml aprotinin ile kültür, fibrin ilk 4 gün boyunca bozulmuş yavaş. Bununla birlikte, köklerinin hala antral aşamasına geliştirmek ve oosit aprotinin aprotinin removed.A yüksek konsantrasyonda (0.1 TIU / ml) sonra metafaz II mayoz devam etmek için yetkili kalır fibrin yıkım önemli ölçüde inhibe, matris sertlik folikül genişleme ve somatik hücre önler matriks içine işgali görülmektedir. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Oosit gelişimini desteklemek somatik hücre bir veya daha fazla katman ile çevrili merkezi bir oositin folikül gelişimi Akış Şeması. Yumurtalık folikülü oluşur. Folikülleri preovulatory antral aşamada ikincil gelişir, oosit çevreleyen somatik hücre ne zaman somatik hücre bitişik, çoğalırlar ve farklılaştırmak ve oosit büyüklüğü artar. In vitro maturasyon (IVM) folikül kültürü için son adım oosit, kümülüs hücreleri olarak adlandırılan, hCG stimülasyon sonra genişletin ve oosit mayoz bölünme devam eder ve bir metafaz II (MII) evre ilerler. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2a.jpg" alt="Şekil 2a" /> Şekil 2a. In vitro 3D folikül kültür Aljinat ve fibrin-aljinat (a) Aljinatta nazik jelleşme ve biyokimyasal özellikleri, mesh boyutu, kontrol sertlik ve biyolojik inertlik nedeniyle in vitro folikül kültürü için uygun bir doğal biyomateryal. Aljinat α-L-guluronic asit (G) ve β-D-mannuronic asit (M) doğrusal bir polisakkarit kopolimer. Tekrar G monomerlerin Alanları, &quot;G-blok&quot; olarak adlandırdığı, kalsiyum, kalsiyum iyonlarının varlığında bir hidrojel oluşturmak için çapraz bağlanır. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2b.jpg" alt="Şekil 2b" /> Şekil 2b (iki) Küçük kapsüllü foliküllerinin kültürünün başında aljinat düşük basınç kuvveti deneyim. Ancak, folikül boncuk yerinden hacmi genişledikçe folikül genişleme ters yönde (b-ii) daha yüksek basınç kuvveti sonuçları artmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2c.jpg" alt="Şekil 2c" /> Şekil 2c bireysel polimerlerin zincirleri çapraz bağlama önce fibrin aljinat çözüm tamamen dolaşmış. FA-IPN iki bileşenleri trombin ve kalsiyum karışımı maruz kalan hemen çapraz-bağlantı başlar. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3a.jpg" alt="Şekil 3a" /> Şekil 3a. FA-IPN İkincil folikülleri folikül izolasyon ve kapsülleme Akış Şeması 16 günlük fare (Ai) izole edilmiştir. Üreme organları (A-ii) disseke ve izole foliküllerinin bir tabak bakım medya (A-iii) ile aktarılır. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3b.jpg" alt="Şekil 3b" /> Şekil 3b fibrinojen aljinat çözüm folikül kapsülleme bırak yöntemi (B: i-iv). İki damla fibrinojen-aljinat çözümü, durulama, damla (10 mcL) ve kapsülleme damla (90 mcL) çanak (Bi) pipetlenir. Sonraki 3-5 foliküllerinin bir durulama damla (B-ii) transfer edilir. Durulama ve medya kaldırma sonra, folikülleri kapsülleme açılan (B-iii) aktarılır. Her bir follikül 10 mcL pipet ucu ile 5 mcL fibrinojen-aljinat çözüm emişli ve sonra trombin / kalsiyum solüsyonu (B-iv) içine atılır. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3c.jpg" alt="Şekil 3c" /> Şekil 3c 5 dakika boncuk çapraz bağları. Parafilm fibrinojen aljinat çözüm folikül kapsülleme yöntemi (C: i-iii). Fibrinojen-aljinat çözeltisi (7.5 mcL) parafilm kaplı cam slayt pipetlenebilir ve (Ci, ii) durulandıktan sonra folikülleri ayrı ayrı her bir damla aktarılır. Trombin solüsyonu (7.5 mcL), (C-iii) her damla eklenir. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3d_e.jpg" alt="Şekil 3d-e" /> Şekil 3d e. damla ikinci bir parafilm kaplı cam slayt ile kaplıdır ve FA-IPN 5 dakika inkübatör çapraz. (D) 96-plaka kapsüllü foliküllerinin büyüme ortama aktarılır. (E) FA-IPN (beyaz ok) bir kapsüllü folikül bir görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Büyüyen folli fibrin yıkımcle. Foliküllerin folikülü etrafında açık bir daire ile gösterilmiştir kültür dönemi boyunca, FA-IPN fibrin bileşeni bozulmasına yol açar. Folikül 3D mimarisi kalan aljinat tarafından desteklenmektedir. 0 (D0) fibrin hala bozulmamış ve folikülün etrafında matris bulutlu; kültür 1 gün folikülün etrafında açık halka görünür (D1) (beyaz ok) ve fibrin yıkım ön radyal gün genişletmeye devam ediyor sonra günü 2 (D2) ve kültür gün 4 (D4). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. Folikül gelişimi Görüntüler gün 0 FA-IPN Temsilcisi görüntüleri ofsecondary folikül gelişimi (A), 4 (B), 6 (C) ve 8 (D) kültür. 8 gün sonra, antral foliküller in vitro olgunlaştı ve MII aşamada oosit (E, kutup vücut siyah ok ile gösterilen) gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6. Fibrin yıkım aprotinin inhibe olmuştur. Gün 2, 4, 10 ve 12 folikülleri büyüyen ilk satırda gösterilmiştir. Aprotinin konsantrasyonlarda 0.01 TIU / ml (ikinci satır) ve 0.1 TIU / ml kültür ortamı, 0, 2 ve 4 gün eklendi. Sadece aprotinin kaldırma sonra 0.01 TIU / ml aprotinin bozulmuş fibrin kültürler folikül ve antral aşamasına gelinmiştir. 0.1 kültür foliküllerin TIU / ml aprotinin FA-IPN büyümeye vermedi. <table border="1"><tbody><tr><td> Kısaltma </td><td> Tam adı </td></tr><tr><td> CO 2 inkübatör </td><td> % 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör </td></tr><tr><td> COC </td><td> Cumulus oosit kompleksi </td></tr><tr><td> 3D </td><td> Boyutlu 3 </td></tr><tr><td> DM </td><td> Diseksiyon medya </td></tr><tr><td> AGF </td><td> Epidermal büyüme faktörü </td></tr><tr><td> FA-IPN </td><td> Fibrin-aljinat nüfuz ağ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Fetal sığır serumu </td></tr><tr><td> GM </td><td> Büyüme medya </td></tr><tr><td> GV </td><td> Germinal vezikül </td></tr><tr><td> hCG </td><td> İnsan koryonik gonadotropin </td></tr><tr><td> ITS </td><td> İnsülin Transferrin selenyum takviyesi </td></tr><tr><td> IVF çanak </td><td> Iyi Center, in vitro fertilizasyon çanak 60 mm </td></tr><tr><td> AA </td><td> Bakım medya </td></tr><tr><td> MII aşamada oosit </td><td> Metafaz II aşamada oosit </td></tr><tr><td> rFSH </td><td> Rekombinant Folliküler Uyarıcı Hormon </td></tr><tr><td> TBS </td><td> Tris tamponlu salin </td></tr><tr><td> TIU </td><td> Tripsin inhibitör birimler </td></tr></tbody></table> Tablo 1 Kısaltmalar

<ol>
	<li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+maturation,+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system.">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li><li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture.">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li><li>Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Follicle+Growth+and+Oocyte+Maturation+by+Culture+in+Alginate+Hydrogel+Following+Cryopreservation+of+the+Ovary+or+Individual+Follicles.">Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).</li><li>Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+achievements+and+future+research+directions+in+ovarian+tissue+culture,+in+vitro+follicle+development+and+transplantation:+implications+for+fertility+preservation.">Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).</li><li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development.">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).</li><li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development.">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li><li>Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mouse+follicle+development+by+follicle-stimulating+hormone+in+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+is+dependent+on+follicle+stage+and+dose.">Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose.</a> Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).</li><li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes.">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).</li><li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development.">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).</li><li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+Three-Dimensional+Culture+Supports+Development+of+Nonhuman+Primate+Secondary+Follicles.">Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles.</a> Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).</li><li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+follicle+micro+environment.">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li><li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+follicles+produce+live,+fertile+offspring.">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li><li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility.">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li></ol>

FA-IPN sunulan over folikül kapsülleme yöntemi, in vitro 3D ortamda folikül kültür sağlar . FA-IPN ilk mekanik özellikleri hem fibrin ve aljinat kombinasyonu tarafından belirlendiği bir dinamik, duyarlı hücre-matriks. Kültür sırasında, kapsüllü folikül sadece kültür sonunda kalan aljinat katkıda yavaş yavaş azalan bir jel sertlik sonuçları IPN sadece bir bileşeni, fibrin, aşağılamak proteazlar aktive eder. FA-IPN ile elde edilen dinamik mekanik özellikleri, gelişmekte olan kökle...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fetuin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>F3385</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Gibco</td>
<td>10082-139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aprotinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10236624001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wako</td>
<td>039-00475</td>
<td>40 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A412</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>rFSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hCG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ITS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I1884-1VL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;MEM+Gluta MAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>32561</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>30-002-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tisseel Fibrin kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>921030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Alginate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FMC BioPolymers</td>
<td>LF200DL</td>
<td>Mw 418kDa</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3 dimensional system

Seks hormonları salgılar yumurtalık fonksiyonel ünitesi over folikül ve oosit olgunlaşma destekleyen in vitro folikül teknikleri temel biyoloji araştırmak için model folikül gelişimi için bir araç sağlar ve fertiliteyi korumak için bir teknik olarak daha da geliştirilmektedir. kliniği 1-4. Bizim in vitro kültür sistemi, hücre-hücre etkileşimleri ve parakrin sinyal, doğrudan folikül gelişimi 5 3D foliküler mimarisini koruyarak doğal yumurtalık ortamı taklit etmek için hidrojeller kullanmaktadır. Daha önce, folikülleri başarıyla aljinat, kalsiyum iyonları ile jelleşme 6-8 uğrar inert bir alg elde edilen polisakkarit kültüre edildi . 0.25% w / v bir konsantrasyon meydana Aljinatta hidrojeller folikül kültürü için en müsamahakar olduğunu ve en yüksek gelişim yeterlik 9 korudu. Aljinat hidrojeller böylece folikül gelişimi 10 etkisi folikül bir basınç kuvveti folikülün çapı sonuçları, parçalanabilir bir artış değildir. Biz daha sonra fibrin ve aljinat bir karışımını aynı anda jel olduğu bir fibrin aljinat nüfuz ağ (FA-IPN) dayalı bir kültür sistemi geliştirdi. Bu kombinasyon, her iki bileşen başlangıçta matris katılık katkıda bulunmak için, dinamik bir mekanik ortam sağlar, ancak artan folikül tarafından salgılanan proteazlar destek sağlamak için sadece aljinat bırakarak matris fibrin düşürür. NPI, aljinat içeriği% 0.25 &#39;lik, tek başına 5 aljinat ile mümkün değildir altına düşebilir. Böylece, folikül genişledikçe, azaltılmış katı madde içeriği nedeniyle daha düşük bir basınç kuvveti yaşayacaksınız. Burada, bir kapsülleme yöntemi ve FA-IPN içinde yumurtalık folikülleri için bir in vitro kültür sistemi açıklanmaktadır. Dinamik mekanik ortamda küçük foliküller katı bir korteks ikamet eden ve bir daha müsamahakar medulla geçmek boyutu 11 artış olduğu doğal yumurtalık ortamı taklit eder. Parçalanabilir bileşeni insan folikülleri normalde in vivo geçmesi hacim olarak daha büyük 10 6 kat artış desteklemek amacıyla özellikle klinik çeviri için kritik olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System at JoVE.com

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

3D fibrin aljinat nüfuz ağ over folikül kapsülleme için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bu sistem, olgun oosit üretmek için olgunlaşmamış köklerinin gelişimini desteklemek için proteolitik degradasyon ile yapısal destek birleştirir. Bu yöntem, hücre-hücre genişleme sınırlayıcı olmadan kişileri korumak için kültürü hücre agrega uygulanan olabilir.

Proteolitik Degradable 3 Boyutlu Sistem Yumurtalık Folikül Encapsulation ve Kültür Bir Yöntem

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

a-method-for-ovarian-follicle-encapsulation-culture-proteolytically

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.2K Görüntüleme.  Northwestern University. 3D fibrin aljinat nüfuz ağ over folikül kapsülleme için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bu sistem, olgun oosit üretmek için olgunlaşmamış köklerinin gelişimini desteklemek için proteolitik degradasyon ile yapısal destek birleştirir. Bu yöntem, hücre-hücre genişleme sınırlayıcı olmadan kişileri korumak için kültürü hücre agrega uygulanan olabilir.

Video: A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Biyomühendislik

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as well as substance testing. These models are mostly cultivated in membrane-insert systems, their permeability toward different substances being an essential factor. Typically, applied methods for determination of these parameters usually require large sample sizes (e.g., Franz diffusion cell) or laborious equipment (e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)). This study presents a method for determining permeability coefficients directly in membrane-insert systems with diameter sizes of 4.26 mm and 12.2 mm (cultivation area). The method was validated with agarose and collagen gels as well as a collagen cell model representing skin models. The permeation processes of substances with different molecular sizes and permeation through different cell models (consisting of collagen gel, fibroblast, and HaCaT) were accurately described.
Moreover, to support the above experimental method, a simulation was established. The simulation fits the experimental data well for substances with small molecular size, up to 14 x 10-10 m Stokes radius (4,000 MW), and is therefore a promising tool to describe the system. Furthermore, the simulation can considerably reduce experimental efforts and is robust enough to be extended or adapted to more complex setups.

A method for determination of permeability in a membrane insert system for multi-well plates and in silico parameter optimization for the calculation of diffusion coefficients using simulation are presented.

Bir yöntem belirleme geçirgenliği ve Difüzyon bir zarda bir 3D doku modelindeki simülasyonu için ekleme sistemi çok iyi kaplamalar için

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Hyaluronik asit Hydrogels hasta kaynaklı Glioblastoma hücreleri 3 boyutlu kültür için dayalı.

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

3D dinamik kültür sistemi ile bir çok katmanlı mezenkimal kök hücre levha inşaatı

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...