1. Laufband Laufen für Revealing das Ausmaß der Muskelverletzung in Mausmodellen <ol><li> Richten Sie den Winkel des Laufbandes Oberfläche für den Einsatz während der laufenden Protokoll. Generell ist eine flache Ebene oder einem Winkel zwischen 7 ° und 15 ° Grad bergab oder bergauf verwendet wird. Einige Laufbänder haben in integraler Apparat, um die Steigung einstellen, während andere das Laufband, durch andere Mittel erhöht werden müssen. </li><li> Legen Sie eine Schale oder einen blauen Labor-Pad unter dem Laufband, bevor die Tiere in der Tretmühle, Abfälle von den Tieren zu sammeln während des laufenden Protokoll. </li><li> Vor dem Ausführen von Mäusen soll die Umwelt des Laufbandes akklimatisiert werden. Dies geht darum, die Tiere im Laufband für 15 Minuten mit dem Stromnetz abgeschaltet und der Riemenantrieb des Motors auf, aber der Gurt nicht bewegen (dh mit der Geschwindigkeit 0 m / s eingestellt ist). </li><li> Schalten Sie den Motivations-Stromnetz. Die Intensität und die Frequenz der Pulse verwendet werden kann in der Regel auf dem Laufband gesteuert werden, sondern variiert von Hersteller zu Hersteller. Im Allgemeinen ist maximale Intensität nicht erforderlich, um Mäuse zu motivieren, wenn sie bei einer hohen Frequenz (mindestens einmal alle zwei Sekunden) die Einhaltung zu verbessern. </li><li> Aktivieren Sie das Laufband an den laufenden Protokoll beginnen. Eine erste Geschwindigkeit von etwa 5 m / min sollte eine Aufwärmphase für die Mäuse verwendet werden. Die Geschwindigkeit des Laufbandes kann langsam beschleunigt werden, in der Regel durch Zugabe von 1-2 Meter / min für jede Minute nach Beginn des Laufbandes. </li><li> Die Einhaltung der Tiere in den meisten Protokollen kann durch eine Reihe von Kleinauflagen (5 Minuten) bei Aufwärmen Geschwindigkeit von 3 bis 10 Tage vor der experimentellen laufen beginnt verbessert werden. </li><li> Eine akute Erschöpfung Übung wird in der Regel beinhalten die Erhöhung der Geschwindigkeit des Laufbandes mit der Zeit, bis eine maximale Geschwindigkeit (in der Regel &lt;30 m / m) erreicht und aufrecht erhalten, bis die Mäuse Anzeichen von Erschöpfung zu zeigen. Kriterien für die Beurteilung Erschöpfung variieren, aber in der Regel eine Maus verbringen mehr als die Hälfte der Zeit auf das Stromnetz oder 5 aufeinander folgenden Sekunden auf dem elektrischen Netz ohne Rückkehr zum Laufband Oberfläche. Nach einer individuellen Maus erschöpft ist, kann aus dem Laufband entfernt werden und die gesamte Zeit laufen können aufgezeichnet werden. </li><li> Die Veränderung des Winkels des Laufbandes kann in akuten laufenden Studien verwendet werden, um die Ausübung Last (mit einem bergauf-Winkel) zu erhöhen oder zu beschädigen exzentrische Kontraktionen (mit einem Downhill-Winkel), dass die sarkolemmalen Membranen der Muskelfasern 1 Reißen zu induzieren. Evans blue Farbstoff kann in Tiere vor solchen Verfahren für den Einsatz als histologischen Farbstoff beschädigte Muskelfasern 2,3 identifizieren injiziert werden. </li><li> Ausdauertraining Laufen Protokolle bieten eine Übung Belastung für das Tier über einen längeren Zeitraum (bis zu Monate), um Umbau des Muskel-oder Herz-Kreislauf-System zu erzeugen. Warm up-Verfahren ist das gleiche wie oben (Schritt 1,5) jedoch die maximale Geschwindigkeit ist in der Regel niedriger und die Laufzeiten sehr lang sein können (&gt; 1 Stunde). </li><li> Nach Abschluss der Ausführung der Mäuse können in ihre Käfige zurück. Laufbänder in der Regel ziemlich schmutzig, während die Mäuse laufen, besonders über lange Protokolle. Es ist notwendig, um dem Laufband sauber, in der Regel mit einem 70% igem Ethanol Spray, nach jedem Gebrauch. </li></ol> 2. Ex vivo-Test der Membrane Repair Kapazität von isolierten Muskelfasern Nach UV-Laser Damage <ol><li> Sezieren die oberflächliche Schicht des M. flexor digitorum brevis (FDB) Muskeln von der Maus zu Fuß. Zuerst schneiden Sie die Haut der Sohle offen an der Mittellinie, während die Betreuung nicht auf die Muskeln darunter Schaden, dann horizontale Schnitte und die Haut abziehen. Die flache weiße Sehne des FDB Muskel (proximalen Sehne) zu sehen an der Fersenbein werden. Unverblümt trennen die Sehne durch die Zange und durchtrennen die Sehnen in der Nähe von Ort der Befestigung, greifen die freie Sehne durch die Zange und ziehen Sie sie sanft auf die FDB vom umgebenden Gewebe zu trennen, während beschneiden Bindegewebe, verbunden bleiben. Beim Anblick des distalen Sehnen Zweig zu den einzelnen Ziffern der FDB durch Schneiden, wo diese Sehnen, die tiefere Schicht der Muskeln verbinden entfernt werden kann. </li><li> Legen Sie die FDB Muskelbündel in 1 ml Kollagenase-Lösung vorgewärmt auf 37 ° C in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, kleben Sie das Rohr in einer horizontalen Ausrichtung in einem 37 ° C Schüttler und schütteln bei 200 rpm für 65 min. Times of Inkubation eventuell angepasst, um eine ausreichende Verdauung, die durch einen ausgefransten Erscheinungsbild und blasse Farbe des Muskels angegeben ist zu gewährleisten. </li><li> Sorgfältig übertragen verdaut FDB Bündel in eine 1,5 ul Zentrifugenröhrchen mit ~ 600 ul von 2,5 Ca 2 + Tyrode über eine 1 ml Pipettenspitze mit einem abgeschnittenen Ende, die einen Durchmesser ausreicht, um die verdauten Bündel leicht durch ohne Unterbrechung hat. Vorsichtig drehen Sie die Röhre in den losen Fasern aus dem Bündel zu schütteln. </li><li> Schneiden Sie ein 30 ul Pipettenspitze, so dass die diameter ist nur geringfügig kleiner als die Muskelbündel (zwischen 15 bis 20 &amp;mgr; m im Durchmesser) Verwenden Sie die Pipette zu ziehen Sie die Bündel in die Pipette und dann schieben Sie sie zurück in die Lösung.. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Mehrheit der Fasern losgelöst von dem Bündel sind. </li><li> Mix distanziert Fasern auch durch vorsichtiges Drehen der Tube, nehmen gewünschte Menge und Höhe auf ein Glas-bottom delta T Schüssel. Das Volumen, um Last auf die Effizienz der Isolation und der Anzahl der nützlichen Fasern, die auf einem Teller für ein bestimmtes Protokoll benötigt werden, variieren. Die restlichen Fasern können in die Röhrchen bei 4 ° C für ca. 6 Stunden für zusätzliche Studien abgelegt. </li><li> Anschließend wird die Schale sitzen für 5 Minuten ruhig stehen. Dies ermöglicht die Fasern auf das Glas Boden der Schale haften. </li><li> Setzen Sie den Glasboden Schüssel auf einem konfokalen Mikroskopie mit einem UV-Laser ausgestattet. Beachten Sie die Fasern unter Phasenmikroskopie bei&gt; 100-facher Vergrößerung auf das Vorhandensein eines normalen Streifung Muster und eine gerade, stabförmige Form zu überprüfen. </li><li> Add FM1-43 oder FM4-64 styrylpyridinium Farbstoffe 4 bis Lösung auf eine Endkonzentration von 2,5 uM 5. </li><li> Um eine Beschädigung der Faser ihre Position für die Imaging-Fenster bewegen, so wird die Faser in einem 45 ° Winkel von der Spitze des Feldes der Blick auf die unten rechts (Abbildung 1) nach links orientiert. Bestrahlen ein 5x5 Pixel-Bereich (ca. 0.9μmx0.9μm) der Plasmamembran mit einem UV-Laser (80 mW oder höher, 351/364 nm) eingestellt, um maximale Leistung für 5 Sekunden. Die bestrahlte Region sollte split der Plasmamembran, das heißt, die Hälfte der 5x5 Box sollte innerhalb der Faser, während der Rest außerhalb der Faser (Abbildung 1) werden soll. </li><li> Machen Sie Bilder von Farbstoff-Eintrag in die Faser im Abstand von jeweils 5 Sekunden für bis zu 5 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.8 für nicht mehr als 3 Fasern pro Gericht, wie die Fluoreszenz-Farbstoff wird schließlich in die Faser Endozytose und erschweren eine Analyse der Daten. Nach 3 Fasern ein neues Gericht sollte aus Schritt 2.5 vorbereitet werden. </li><li> Analysieren von Daten durch die Berechnung der Änderung der Fluoreszenzintensität (&amp;Dgr; F / F 0) zwischen den einzelnen aufgenommene Bild, um die Menge an Farbstoff Eintrag zu messen. Dies erfordert die Messung der mittleren Fluoreszenz eine Fläche von etwa 200 pm 2 mit Analyse-Software wie z. B. die öffentlich zugänglich ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Zum Vergleich zwischen den Fasern, sollte die folgende Berechnung für jeden Frame gemacht werden: &amp;Dgr; F / F 0, wobei F 0 ist die mittlere Fluoreszenz der Region von Interesse in der ersten erfassten Frame (t = 0; vor Verletzungen) und AF ist die Veränderung der Fluoreszenz der einzelnen nachfolgenden Frame (FF 0). </li></ol> 3. Live Cell Imaging Konfokale um den dynamischen Prozess der Cell Membrane Repair-Monitor <ol><li> Mikropipetten wurden aus PYREX Kapillaren aus. Die Kapillare wurde auf einer Mikropipette puller gesetzt und gezogen von voreingestellten Programm (Heat = 695; Pull = 50; Vel .= 55; Time = 250). </li><li> Micropipette war es, ein 3-Achsen (xyz) Mikromanipulator befestigt. </li><li> Die Zellen werden mit Plasmid-DNA mit normalen Methoden, die auf einem Glasboden delta T Schale transfiziert. Die Medien sollten bis 2,5 mm Ca 2 + geschaltet werden Tyrode Puffer vor Experimenten zu beginnen. </li><li> Glasschalen mit transfizierten Zellen wurden auf einer Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop mit 40x 1.3NA Ölimmersionsobjektiv platziert. </li><li> Die akute Live-Zellschäden wurde durch Einfügen der Mikropipette in die Zellmembran durchgeführt und dann schnell zurückziehen Mikropipette aus der Zelle 3,6. Fortlaufende Live-Cell-Bilder wurden im Abstand von 1,54 s / Frame erhalten. </li><li> Für das Saponin induzierte Membranzerstörung Assay, 0,005% Saponin (Sigma) in 2,5 mm Ca 2 + Tyrode Puffer wurde durch einen Schwerkraft-flow individuell zusammengestellt Perfusion System 7 perfundiert. Die Perfusion beträgt etwa 1 ml / min und die Durchblutung Spitze sollte direkt über der Zelle abgebildet platziert werden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Ein Vertreter Film der Maus Laufband kann während der Dreharbeiten gemacht werden. Der Film illustriert die Senkung der laufenden Kapazität der MG53-/ - Mäusen durch den Skelettmuskel Schaden. Das Ausmaß der Schäden durch die UV-Laser-Schaden-Protokoll detaillierte oben verursacht, hängt von der Membran Reparatur Kapazität der Faser untersucht. Diese Kapazität wird durch den Genotyp der Maus, aus dem die Faser wurde isoliert, extrazellulären Bedingungen und gegebenenfalls auf die Proteinexpression (Transfektion oder Infektion) betroffen. Eine normale Wildtyp-Faser ermöglicht eine leichte bis Farbstoff Eintrag (Abbildung 2a) moderieren. Muskelfaser aus dem MG53-/ abgeleitet - Mäuse mit eingeschränkter Membran Reparatur Kapazität bedeutender Eintrag von Farbstoff in die Faser (Abb. 2b) anzuzeigen. Typische Ergebnisse für Mikroelektroden Verletzungen zeigen, die Translokation von MG53-haltigen Vesikelnzeuge an die verletzte Stelle. Abbildung 3a und 3b zeigen GFP-MG53 transfizierten C2C12 Myotuben durch Insertion der Mikropipette in die Zellmembran beschädigt. In der Zelle vor Mikropipette Schaden ist GFP-MG53 auf beiden Plasmamembran und Cytoplasma 3 befindet. Nach Mikropipette Penetration bewegt GFP-MG53 Vesikel Richtung Schadstellen (wie durch Pfeil gekennzeichnet). Abbildung 3c zeigt eine GFP-MG53 transfizierten C2C12 Myoblasten mit 0,005% Saponin, ein Waschmittel, das die Plasmamembran permeabilisieren können behandelt werden. Nach Saponin Behandlung, GFP-MG53 aus Cytosol an die Zellmembran transloziert. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Weisleder, et al. Abbildung 1. Fiber Alignment und Verletzungen Region Definition. Korrekte Ausrichtung der isolierten Muskelfasern innerhalb des Sichtfeldes und die Definition der Verletzung Region gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Weisleder, et al. Abbildung 2. UV-Laser Schäden FDB Faser. Images zeigen Fasern vor, um Verletzungen (0 sec, links) und bei 200 sec nach der Verletzung (rechts). Fasern aus einer Wildtyp-Maus (a) zeigen leichte Verletzungen. Fasern, die aus Mäusen mit geschwächtem Membran Reparatur (b) ermöglichen mehr Farbstoff zu geben. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Weisleder, et al. Abbildung 3. Mikroelektroden und Saponin Schäden an kultivierten Zellen. Images zeigen C2C12 Myotuben (a, b) und einer C2C12 Myoblasten (c) vor Verletzungen (oben) und nach der Verletzung (unten). Zellen mit einer Mikroelektrode (a, b) verletzt zeigen MG53 Translokation, um Verletzungen zu Websites (Pfeile). Zellen mit Saponin (c) behandelt zeigen MG53 Translokation an die Zellmembran.

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Laufband ist eine nützliche Methode ist die Bereitstellung einer Trainingsbelastung zu den behandelten Tieren. Als eine Methode zur Messung der Muskelfunktion und Ausdauer Kapazität ist ein notorisch lauten Ansatz, der nur schwer in eine gleichbleibend reproduzierbar 8 ausgeführt wird. Im Allgemeinen können Zeiten bis zur Erschöpfung als Endpunkt verwendet werden, um große Unterschiede zwischen den experimentellen Gruppen, wie jene zwischen einigen Knockout-Maus Linien und Wildtyp-Mäusen 9 zu beheben. Experimentelle Manipulationen, die subtiler Unterschied, wie einige pharmazeutische Prozesse zu erzeugen, kann nicht aufgelöst werden Unterschiede über den Lärm mit dieser Technik verbunden sind. Um die Reproduzierbarkeit und Sensitivität dieser Techniken zu maximieren, ist es wichtig, die Bedingungen für Sitzung zu Sitzung sehr eng zu halten. Die Zeit des Tages die Tiere ausgeübt werden, sowie die Aufwärmphase Bedingungen verwendet werden, sind wichtige Faktoren und sollte konsistent bleiben von Versuch zu Versuch. Verzerrungseffekte können erhebliche Auswirkungen auf die Gestaltung der Laufband-Protokolle, wie bestimmte Stämme von Mäusen kann viel mehr Zeit auf dem Laufband als andere Stämme und reagieren unterschiedlich auf Ausdauertraining 10. Als allgemeine Richtlinie wird viele Mäuse in der Lage sein zu 200-300 Metern insgesamt zu einer Erschöpfung Studie mit konstanter Anstieg der Geschwindigkeit des Laufbandes (5 m / m Anfangsgeschwindigkeit mit 1 m / m pro Minute nach dem Start aufgenommen) laufen. Für ein Ausdauertraining die Mäuse können zwischen 9-12 m / m für 30 Minuten 2 oder 3 mal pro Woche durchgeführt werden. Allerdings werden die einzelnen Studien erfordern in der Regel einige Optimierungen des Protokolls zum individuellen experimentellen Anforderungen entsprechen. Der UV-Laser-Schaden Verfahren hat sich gezeigt, dass eine effektive Methode zur Messung der Membran Reparatur Kapazität von Skelettmuskelfasern 3,6,11 werden. Ein wesentlicher Bestandteil für den Erfolg dieser Experimente ist es, nur Muskelfasern, die einen geraden, stabförmigen Aussehen Display mit einem regelmäßigen Muster von Rillen und einen reibungslosen Sarkolemm, dass nicht angezeigt wird faltig verwenden. Wenn andere Muskelfasern aktiviert sind Membran beschädigen können bereits vorhanden sein in dieser Fasern und Interpretation der Ergebnisse aus diesen Experimenten kann kompliziert sein. Es ist auch wichtig, dass die Ausrichtung der Faser und der Definition der bestrahlten Region wie in Abbildung 1 definiert werden. Dies stellt eine Verletzung von reproduzierbaren Größe, so dass Vergleich zwischen Fasern. Wenn der definierte Bereich der Verletzung liegt vollständig innerhalb der Faser, wird eine innere Verletzung als Störung des Sarkolemm erstellt werden. Darüber hinaus ist der Wert für &amp;Dgr; F / F 0 berechnet sehr empfindlich auf die Region von Interesse für die Messung der mittleren Fluoreszenz ausgewählt. Eine Fläche von ca. 200 um 2, neben und mit der verletzten Stelle, ist angemessen. Im Gegensatz zu der Region für Verletzungen definiert, sollte dieser Bereich vollständig innerhalb der Faser. Wenn Sie Platz außerhalb der Faser enthalten, werden die daraus resultierenden leeren Bereich &amp;Dgr; F / F 0 in Fasern mit wenig Farbstoff Eintrag zu erhöhen bei gleichzeitiger Senkung der &amp;Dgr; F / F 0 in Fasern mit einem schwereren Phänotyp. Dies verringert die Empfindlichkeit des Tests, wodurch Vergleich zwischen den Fasern erschwert. Für die Mikropipette Schäden Assay sollte der Winkel zwischen der Mikropipette und Glasboden Schüssel etwa 45 Grad sein, um effektiv Schäden der Zellmembran. Die Zellen wurden für Mikropipette Schaden gewählt werden sollte fest mit dem Boden der Schale angebracht werden und runden Zellen nicht, da die meisten wahrscheinlich werden sie nach Mikropipette Stossen zu lösen. Saponin permeabilzation Experimente sind technisch weniger anspruchsvoll und relativ schneller im Vergleich zu Penetration Tests Mikropipette durchzuführen. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen auf Saponin Schäden, einschließlich, dass nur eine Zelle pro Gericht kann verwendet werden, da Saponin wird diffus und Schäden anderer Zellen in die Schüssel.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Nager Laufband </td><td> Columbus Instruments Exer 3 / 6 oder gleichwertig </td><td></td></tr><tr><td> 70% Ethanol </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> Dissection Tools wie feine Spitze Pinzette, Schere Frühjahr </td><td> World Precision Instruments </td><td></td></tr><tr><td> 2 mg / ml Kollagenase Typ I </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 0 CA 2 + Tyrode-Puffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,2, 290 mosm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mm Ca 2 + Tyrode-Puffer (140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,2, 290 mosm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> Temperierbaren Schüttler </td><td> New Brunswick oder gleichwertig </td><td></td></tr><tr><td> Delta TPG Dish </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> LSM 510 konfokalen Mikroskop mit einem Enterprise 80 mW UV-Laser oder eine gleichwertige konfokalen Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> FM1-43 oder FM4-64 Farbstoffe </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat Kapillaren Größe 0,8-1,0 X 100 mm </td><td> PYREX </td><td> Art.-Nr. 9530-2 </td></tr><tr><td> Micropipette puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modell P-97 </td></tr><tr><td> 3-Achs-Mikromanipulator </td><td> Narishige </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Radiance 2100 Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop oder eine gleichwertige Mikroskop </td><td> BioRad </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

visualization of mg53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems

Die Reparatur der akuten Verletzung an der Zellmembran ist ein elementarer Prozess der normalen zellulären Physiologie und defekte Membran Reparatur hat zu vielen degenerativen Erkrankungen des Menschen in Verbindung gebracht worden. Die jüngste Entdeckung von MG53 als wichtige Komponente der Membran Wiederverschließen Maschinen ermöglicht eine bessere molekulare Verständnis der biologischen Grundlagen der Reparatur von Gewebe, als auch für potenzielle translationale Anwendungen in der regenerativen Medizin. Hier haben wir ausführlich die experimentelle Protokolle für die Erkundung der in vivo Funktion des MG53 in die Reparatur von Muskelverletzungen mit Laufband Protokolle an Mausmodellen, für die Prüfung der ex vivo Membran Reparatur Kapazität durch Messung Farbstoff Einstieg in isolierten Muskelfasern, und für die Überwachung des dynamischen Prozess der MG53-vermittelte Vesikeltransport und Zellmembran Reparatur in kultivierten Zellen mit lebenden Zellen der konfokalen Mikroskopie.

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Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Hier beschriebenen Protokolle verwendet werden, um den dynamischen Prozess der MG53-vermittelte Zellmembran Reparatur in ganzen Tieren und auf zellulärer Ebene sichtbar machen. Diese Methoden können auf die Zellbiologie der Plasmamembran Wiederverschließen und der regenerativen Medizin untersucht werden.

Visualisierung der MG53-vermittelte Cell Membrane Repair mit In vivo Und In-vitro- Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

visualization-mg53-mediated-cell-membrane-repair-using-vivo-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

12.3K Aufrufe.  Robert Wood Johnson Medical School. Hier beschriebenen Protokolle verwendet werden, um den dynamischen Prozess der MG53-vermittelte Zellmembran Reparatur in ganzen Tieren und auf zellulärer Ebene sichtbar machen. Diese Methoden können auf die Zellbiologie der Plasmamembran Wiederverschließen und der regenerativen Medizin untersucht werden.

Serie: Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Mit Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) zu Diagnose-Tools entwickeln

Forschung

Biologie

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video bioinformatischen Analyse von humanen embryonalen Stammzellen Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analyse von Schwann-Astrozyten Wechselwirkungen mit In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imaging Cell Membrane Verletzung und subzellulärer Prozesse in der Reparatur beteiligt

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3&#039; End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

Die Analyse der RNA-Prozessierung Reaktionen mit Handy Free Systems: 3 &#39;Ende Spaltung von prä-mRNA-Substrate<em&gt; In-vitro-</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro und In Vivo Ansätze Darm Epithelzelle Durchlässigkeit zu bestimmen

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.