Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R37 und R01 AI34867 GM064625 zu NWA Wir danken Dr. R. Tweten von der Universität von Oklahoma für die SLO-Expressionsplasmid unterstützt.

1. Transkriptions Silencing von ASM <ol><li> Samen 1,5 x 10 5 HeLa-Zellen in 2 ml DMEM Wachstumsmedium (DMEM mit hohem Glucose mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1% Penn-Strep) auf 35 mm Glasbodenschalen (MatTek) und Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Am folgenden Tag, absaugen dem Wachstumsmedium und ersetzen Sie es mit 2 ml DMEM reduziert Serummedium (DMEM mit 4% FBS), mindestens 1 Stunde vor der Zugabe der siRNA-Transfektion Mischung. </li><li> Bereiten 4 Röhren für die siRNA-Transfektion Oligo-Mischung. In Röhren A und C, fügen Sie 250 ul Optimem reduziert Serum und 4 ul Lipofectamine RNAiMax, pro 35 mm-Schale transfiziert werden. In Rohr B, fügen Sie 250 ul Optimem reduziert Serum und 8 ul (160 pmol) des Steuermedium GC-Gehalt Oligo (Control siRNA), pro 35 mm-Schale transfiziert werden. In Rohr D, fügen Sie 250 ul Optimem reduziert Serum und 8 ul (160 pmol) des SMPD1 Oligo (tern), pro 35 mm-Schale to transfiziert werden. Die Röhrchen bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert. </li><li> Kombinieren Rohre A und B, um die Transfektion Komplex für Kontroll-siRNA und Rohre C und D für die ASM siRNA zu bilden. Inkubiere die Reaktion bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Fügen Sie die Kontrolle siRNA und siRNA-Transfektion ASM Reaktionsmischungen langsam tropfenweise in die jeweiligen 35-mm-Glasboden Gerichte und bei 37 ° C / 5% CO 2. Bei 24 Stunden nach der Transfektion sanft absaugen Medien und ersetzen mit frischem DMEM Wachstumsmedien. Für eine effiziente ASM Knockdown, die Gerichte sollten weiter bei 37 ° C / 5% CO 2 für ca. 31 h (insgesamt 55 Stunden) vor dem Live-Bildgebung inkubiert werden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Reagenzien für Live-Mikroskopie <ol><li> Eine Lösung von rekombinantem porenbildenden Toxin Streptolysin O (SLO) bei einer Konzentration von 100 ng / ul in kaltem 1x PBS ohne Ca 2 + und Mg 2 +. Die in diesen Tests verwendeten SLO ist constitutively aktiven Cystein-Mutante, die nicht erfordert Reduktionsmittel für Aktivität, freundlicherweise von Dr. Rod Tweten, University of Oklahoma ist. Das Toxin wurde in E. ausgedrückt coli BL21 DE3 und unter nativen Bedingungen gereinigt, wie zuvor 16 beschrieben. </li><li> Bereiten Sie den FM1-43 Stammlösung resuspendieren FM1-43 gefriergetrocknetes Pulver in DMSO, um eine 25 mM Lösung zu schaffen. </li><li> Bereiten Lösung A: Verdünnen Sie die FM1-43-Stammlösung in kaltem DMEM mit Ca 2 + bis zu einer endgültigen Konzentration von 4 uM (1,5 ml pro MatTek Gericht erforderlich) zur Lagerung auf Eis, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Lösung B: Verdünnen Sie die FM1-43-Stammlösung in kaltem DMEM ohne Ca 2 + und 10 mM EGTA (Ca 2 +-freiem DMEM) in einer Endkonzentration von 4 uM (1,5 ml, die pro MatTek Gericht) und speichern auf Eis, bis benötigt. </li><li> Pre-warm (37 ° C) Je 1 ml Lösung A und Lösung B in Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Halten auf Eis Lösungen von DMEM mit Ca 2 + und Ca 2 +-freiem DMEM. </li></ol> 3. Live Cell Imaging von FM1-43 Influx in SLO behandelten und unbehandelten Zellen <ol><li> Füllen Sie eine mittelgroße flache Metallbehälter mit Crushed Ice, kehren sie in einem großen Glasbehälter mit Eis, und zusätzliche Eis nur die Bodenfläche des Metallbehälters ausgesetzt verlassen. Legen Sie ein nasses Papiertuch auf dem freiliegenden Metallboden für gleichmäßigen Wärmefluss zu ermöglichen. </li><li> Nehmen Sie eine Kontroll-siRNA-behandelten MatTek Gericht (Probe 1) und legen Sie sie auf dem kalten nassen Papiertuch. Vorsichtig absaugen alle Medien und 3x waschen mit kaltem Ca 2 +-freiem DMEM. Nach dem letzten Wasch, absaugen alle Medien in die Schüssel. </li><li> Um Bildzellassoziierte FM1-43-Zellen ohne SLO Verwundung (Probe 1) in Gegenwart von Ca 2 +, 180 &amp;mgr; l hinzugefügt kalten Lösung B zum Zentrum Deckglas der Bodenschale 35 mm Glas und Inkubation für 5 min auf Eis (Tabelle 1). </li&gt; <li> Platzieren MatTek Schale auf der Bühne eines konfokalen Mikroskops auf 37 ° C erhitzt und mit einer Klimakammer (die Temperatur, Feuchtigkeit und CO 2-Gehalt beibehalten wird) ausgestattet. Finden Sie den Bereich der Zellen, der abgebildet werden soll der Blick durch ein 40x NA 1.3 Objektiv (Nikon). Falls vorhanden, schalten Sie PerfectFocus oder einem ähnlichen Gerät, um die thermische Drift zu korrigieren. </li><li> 1 ml der vorgewärmten Lösung A sanft auf die Seite der 35-mm-Schale und Deckel ersetzen, der Umweltkammer (Tabelle 1). </li><li> Erwerben Sie Bilder für 4 min bei 1 Frame alle 3 Sek. mit entsprechenden Bildbearbeitungssoftware (Volocity in der Ultraview Vox Perkin Elmer Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie-System). Anregung der FM1-43 mit einem 488-nm-Laserlinie unter Verwendung eines dichroitischen Filters mit einem 488 nm Bandpassgeführt und Emissions Diskriminierung wird durch die Verwendung eines 527 (W55) Emissionsfilter erreicht. Laserleistungsniveaus und die ISO-Empfindlichkeit eingestellt, Bildaufnahmen von 100 ms zu erreichen. </li><li> Die Schritte 3.2 bis 3.6 FM1-43 Kontroll-siRNA-behandelten Zellen in Abwesenheit von Ca 2 + zu erfassen ohne SLO Verwundung (Probe 2), mit der Ausnahme, daß im Schritt 3.5 die Lösung B hinzugefügt werden soll (Tabelle 1). </li><li> Um FM1-43-Einstrom in Steuer siRNA-behandelten Zellen mit SLO entweder in Gegenwart (Probe 3) oder Abwesenheit von Ca 2 + (Probe 4), fügen Sie 180 ul der kalten Lösung B enthält SLO zum Zentrum Deckglas der Verwundeten zu messen 35-mm-Glasbodenschale und Inkubation für 5 min auf Eis, wie in Schritt 3.3. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.6; einstellen Zugabe entweder Lösung A oder Lösung B in Schritt 3.5 (Tabelle 1). </li><li> Um die Rolle von ASM in der Plasmamembran Reparatur, wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,6 mit ASM siRNA-behandelten Zellen für alle Bedingungen (Proben 5-8) (Tabelle 1). </li><li> Um die Rolle von extrazellulärem rekombinanten Sphingomyelinase (SM) auf derKinetik der Plasmamembran Reparatur (reflektiert durch die Hemmung in FM1-43 Zustrom) (Proben 9-10), wird SM aufgenommen (0-50 uU) entweder Lösung A oder Lösung B in Schritt 3.5 und dann während der Live-Zelle hinzugefügt, um Zellen Imaging in einem Gesamtvolumen von 1 ml (Tabelle 1). </li></ol> 4. Quantifizierung von FM1-43-Einstrom in Zellen <ol><li> Nach Filmen erworben wurden, messen die intrazelluläre Fluoreszenzintensität von FM1-43 unter Verwendung von Bildanalyse-Software (Volocity Suite, PerkinElmer). Zeichnen eines Bereichs von Interesse in der zytosolischen Bereich jeder Zelle in dem Feld und Anwendung der Softwaretools, um die mittlere FM1-43-Fluoreszenzintensität in allen Frames der Video bestimmen. </li><li> Um Schwankungen in der Ausgangs FM1-43-Färbung einzustellen, werden die Daten für jede Video fachen Anstieg in der Fluoreszenzintensität über die Zeit ausgedrückt, aufgetragen und für jeden unterschiedlichen Zustand. Die Zunahme in der Fluoreszenz der einzelnen Zeitpunkt proZelle als F T / F 0, wobei F T die mittlere Fluoreszenz im festen Zeitpunkt berechnet wird, und f 0 die mittlere Fluoreszenz zum Zeitpunkt t = 0 (Fig. 1-2). </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release.">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+facilitated+cell+membrane+resealing.">The mechanism of facilitated cell membrane resealing.</a> J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recovery+of+human+polymorphonuclear+leucocytes+from+sublytic+complement+attack+is+mediated+by+changes+in+intracellular+free+calcium.">The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium.</a> Biochem. 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Die Autoren erklären, sie haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Frühere Studien über mechanische Verletzungen und Plasmamembran Reparatur verließ sich auf vielfältige Mechanismen der Zellen zu verletzen, die von Fallenglasperlen, Mikropipettiervorrichtung, Scheren, Kratzen oder Schaben. Das Auslesen von all diesen Tests war eher qualitative als quantitative und hat genaue Informationen über die Kinetik der Reparaturmechanismus nicht geben. Die Fähigkeit von Zellen, die Plasmamembran nach dieser Formen von Verletzungen verschließen wurde durch die Anwesenheit oder Abwesenheit ...

Es ist seit mehreren Jahrzehnten bekannt, dass die Plasmamembran-Reparatur nach mechanischen Verletzungen ist ein Ca 2 +-abhängigen Prozess 1,2. Spätere Studien zeigten, dass Ca 2 +-Einstrom durch die Wunde löst eine kräftige Prozess der Exozytose von intrazellulären Vesikeln an der Stelle der Verletzung, die zum Wiederverschließen 3,4 erforderlich ist. Die Verlustrate der Fluoreszenzfarbstoff in das Zytoplasma der Zellen geladen wurde verwendet, um die Geschwindigkeit der Reparatur zu beurteilen und festgestellt, dass Wiederverschließen wurde innerhalb von &lt;30 sec nach der Verletzung 5 abgeschlossen. Zwei Modelle wurden zunächst vorgeschlagen, die Voraussetzung für die Exozytose in Plasmamembran-Reparatur zu erklären: 1) die &quot;Patch&quot;-Modell, das vorgeschlagen, dass Ca 2 +-Einstrom durch die Läsion löst zunächst homotypischen Fusion von intrazellulären Vesikeln, bilden eine große &quot;Patch&quot; Das wäre dann in die Plasmamembran aufgebracht, um die Wunde 6 und 2) die Spannungsreduzierung Modell, das die Membran adde vorgeschlagen werden verschließendurch Ca 2 +-abhängige Exocytose in der Nähe der Wunde d würde Plasmamembranspannung zu verringern und erleichtert Wiederverschließen der Doppelschicht 7. Die Rolle von Ca 2 + ausgelöste Exocytose in der Plasmamembranreparatur wurde durch Studien, die zeigen, dass Lysosomen enthalten eine Ca 2 +-Sensormolekül, synaptotagmin VII, die Exocytose und deren Plasmamembran Reparatur erleichtert verletzten Zellen verstärkt 8,9,10,11 . Allerdings hat zusätzliche Beweise zeigten, dass Exozytose allein war nicht ausreichend, um die Reparatur der Plasmamembran zu fördern. Neben mechanischen Tränen auf der Plasmamembran, ist eine häufige Form von Zellschädigung Permeabilisierung von durch Bakterien oder Immunzellen 12,13 14,15 hergestellt porenbildenden Toxinen. Im Gegensatz zu mechanischen Tränen, porenbildende Proteine, fügen sich auf der Plasmamembran, eine stabile, Protein-Pore gesäumt, die nicht einfach durch die Anwendung einer Membran &quot;Patch&quot; oder durch Reduktion wieder verschlossen werden könnenten Membranspannung. Interessanterweise Studien zeigten, dass Säugerzellen mit einem effektiven Mechanismus, um die Plasmamembran nach Permeabilisierung mit porenbildende Proteine ​​zu reparieren, und dieses Verfahren erfordert ebenfalls die Gegenwart von extrazellulärem Ca 2 + 12. Dieser Befund warf die Frage auf, ob Transmembranporen Entfernung von der Zelloberfläche war auch ein schneller Prozess, wie bei mechanischen Wunden 5 beobachtet. Überraschenderweise zeigte unsere jüngste Studien, daß das Wiederverschließen der Zellen, die mit porenbildenden Toxinen permeabilisiert hat sehr ähnliche Eigenschaften wie die Reparatur von mechanischen Wunden: erfordert das Verfahren der extrazellulären Ca 2 +, und wird innerhalb von ~ 30 sec abgeschlossen. Die Untersuchung dieses Prozesses näher wir vor kurzem erfahren, dass zusätzlich zu den Ca 2 +-regulierte Exozytose von Lysosomen, Plasmamembran Reparatur beinhaltet eine schnelle Form der Endozytose, die durch die Freisetzung von lysosomalen Enzym ausgelöst wird, saure Sphingomyelinase (ASM) und ist essentiell nicht nur für the Entfernen der Transmembranporen, aber auch für die Reparatur von mechanischen Verletzungen 16. Um die Kinetik der Zellwiederverschließen nach Permeabilisierung mit porenbildenden Proteinen zu bestimmen, die wir in unserem Labor eine Echtzeit-Bildgebung geeignet Methodik, die zuvor verwendet worden war, um Wiederverschließen der Laser verletzt isolierte Muskelfasern 17 beurteilen. Dieser Assay beruht auf Eigenschaften der lipophilen Farbstoff FM1-43, die stabil interkaliert in die äußere Seite der Lipiddoppelschichten Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Wenn der Plasmamembran-Doppelschicht extrazellulären Farbstoff erhält Zugang zu intrazellulären Membranen gestört, die ein empfindliches Assay Plasmamembran Verletzungen erkennen und reparieren 18,16,19,20. Um diesen Test zur Beurteilung der Zellwiederverschließen nach Permeabilisierung mit porenbildende Proteine ​​anzupassen, wir vorinkubierten Zellen bei 4 ° C mit dem bakteriellen Toxin Streptolysin O (SLO), welche an Membrancholesterin 21 bindet. Synchron-ZellePermeabilisierung kann dann leicht durch Bewegen der Zellen vom Medium, um Eis in einem erwärmten Mikroskoptisch, der die Oligomerisation und Änderung der Konformation, die den Transmembranporenbildung führt aktiviert erwärmen erreicht werden. Ein Vorteil dieser Vorgehensweise gegenüber den bisher veröffentlichten Untersuchungen mit Laser Verwundung ist, dass eine größere Anzahl von Zellen gleichzeitig in einem mikroskopischen Feld analysiert werden, eine bessere Abtastung der Zellpopulation. Angesichts der Gemeinsamkeiten zwischen der Zellwiederverschließen Prozess nach mechanischen Verletzungen und Permeabilisierung mit porenbildende Toxine zu sehen ist, der Test beschreiben wir hier eine sehr vielseitige und leistungsstarke Methode zum Präparieren Faktoren in der grundlegenden Verfahren der Plasmamembran-Reparatur beteiligt. Als Beispiel zeigen wir, dass es möglich ist, diesen Test zu verwenden, um Ca 2 +-abhängigen und unabhängigen Schritten des Reparaturvorgangs zu identifizieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HeLa 229 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL2-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose No Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20168</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optimem Reduced Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Control medium GC content RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMPD1 RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HSS143988</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat-inactivated</td>
			<td>Gemini-Bioproducts</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sphingomyelinase from Bacillus cereus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7651</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm-glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C9100-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>UltraViewVoX</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Volocity Suite</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Pathology Devices</td>
			<td>LiveCell System Chamber</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds

Plasma-Membran-Verletzung ist ein häufiges Ereignis, und Wunden müssen schnell repariert, um zelluläre Überleben zu gewährleisten. Einstrom von Ca 2 + ist ein Schlüsselsignalisierungsereignis, das die Reparatur von mechanischen Verletzungen an der Plasmamembran innerhalb von ~ 30 s auslöst. Jüngste Studien zeigten, dass Säugerzellen ihrer Plasmamembran nach Permeabilisierung mit porenbildenden Toxinen in einem Ca 2 +-abhängigen Prozess, der Exozytose des lysosomalen Enzyms saure Sphingomyelinase, gefolgt von Poren Endocytose beinhaltet auch wieder zu verschließen. Hier beschreiben wir die Methodik, um zu zeigen, dass das Wiederverschließen der Zellen durch das Toxin Streptolysin O permeabilisiert ist auch eine schnelle und abhängig von Ca 2 +-Einstrom. Der Assay-Design ermöglicht die Synchronisation der Verletzungsanlaß und eine genaue kinetische Messung der Fähigkeit von Zellen, Plasmamembranintegrität von Abbildungs ​​wiederherzustellen und Quantifizieren des Ausmaßes, mit dem die lipophilen Farbstoff FM1-43 intrazellulären Membranen erreicht. Diese Live-Test ALSo ermöglicht eine sensible Bewertung der Fähigkeit von exogen zugesetzten löslichen Faktoren wie Sphingomyelinase FM1-43 Einstrom hemmen, was auf die Fähigkeit von Zellen, die Plasmamembran zu reparieren. Dieser Assay erlaubt uns zum ersten Mal zeigen, dass Sphingomyelinase wirkt abwärts von Ca 2 +-abhängigen Exozytose, da extrazelluläre Zugabe des Enzyms fördert Wiederverschließen der Zellen in der Abwesenheit von Ca 2 + durchlässig gemacht.

Niedrige Konzentrationen von bakteriellen Sphingomyelinase (SM) Rettungsplasmamembran-Reparatur in Zellen in lysosomalen sauren Sphingomyelinase erschöpft. Verwendung der FM1-43 Abbildungsassay wir früher gezeigt, dass Zellen defizient für das lysosomale Enzym ASM und SLO ausgesetzt Verwundung in Gegenwart von Ca 2 + über einen Plasmamembran-Defekt wird durch extrazelluläre Zugabe des rekombinanten menschlichen Enzyms 19 gerettet. Da das humane lysosomale ASM hat eine...

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Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Echtzeit-Bildgebung von Zellen mit dem lipophilen Farbstoff FM1-43 ausgesetzt ermöglicht eine präzise Bestimmung der Kinetik durch die porenbildende Toxine sind von der Plasmamembran entfernt. Dies ist ein empfindlicher Test, der verwendet werden kann, um Anforderungen für die Ca 2 +, Sphingomyelinase und anderen Faktoren auf die Plasmamembran Reparatur zu beurteilen.

Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sphingomyelinase und in der Reparatur von Pore Toxin-bildenden Wunden

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

live-imaging-assay-for-assessing-roles-ca2-sphingomyelinase-repair

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

11.6K Aufrufe.  University of Maryland.  Echtzeit-Bildgebung von Zellen mit dem lipophilen Farbstoff FM1-43 ausgesetzt ermöglicht eine präzise Bestimmung der Kinetik durch die porenbildende Toxine sind von der Plasmamembran entfernt. Dies ist ein empfindlicher Test, der verwendet werden kann, um Anforderungen für die Ca 2 +, Sphingomyelinase und anderen Faktoren auf die Plasmamembran Reparatur zu beurteilen. 

Serie: Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Techniques for Imaging Ca 2 + Signaling in menschlichen Spermien

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...