We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.

1. Erzeugung von miniSOG Zelllinien <ol><li> Wachsen U2OS (menschliche Osteosarkom-Zellen) in einer 35 mm-Schale, enthaltend 2 ml niedrigen Glucose Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 ergänzt wird, Atmosphäre. </li><li> Transfektion der Zellen, wenn sie 80% Konfluenz durch Lipofektion mit gereinigtem Transfektion Qualität (A269 / 280-Verhältnis 1,8-2,0) Plasmid-Konstrukte, welche die Sequenzen für miniSOG und mCherry tagged Reparaturproteine ​​gemß dem Protokoll des Herstellers des Transfektionsreagenz 19. Die miniSOG Expressionsplasmide können vom Tsien-Lab bestellt werden: <a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li> Sortieren der Zellen, die das rekombinante Protein mit der miniSOG und mCherry tag exprimiert durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zwei Tage nach der Transfektion. Sammeln Zellenmit Zwischenfluoreszenzintensität, um die Zellen, die überexprimiert werden 20 zu vermeiden. </li><li> Kultur die positiven Zellen auf einer 10 cm-Schale in 10 ml DMEM-Medium, das mit 10% FBS und 0,6 ug / ml des Selektionsmittel G418 (Geneticin) ergänzt wird. </li><li> Nach sichtbare Kolonien auf den Platten entstanden, Bildschirm mCherry positiven Kolonien mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop und ziehen Kreise um sie herum (auf der Unterseite der Platte) mit einem Permanentmarker. Verwenden Sie ein geringer Vergrößerung Luft Objektiv (zB 10-fach) und Pick-Klonen unter Verwendung einer sterilen Technik durch vorsichtiges Kratzen die Kolonien aus und langsam saugen sie in eine sterile 1,000 ul Pipettenspitze. </li><li> Erweitern Sie die ausgewählten Kolonien und frieren Teile davon nach unten unter Verwendung des in Schritt 1.1 mit 10% Dimethylsulfoxid ergänzt beschriebene Wachstumsmedium. Testen Sie die Zellen für die DRF-Bildung durch den Anbau von ihnen auf sterile 18 x 18 mm 2 Deckgläsern und bei denen sie2 Gy von Strahlung. Die bestrahlten Zellen stabil exprimiert eine miniSOG mCherry getaggt Reparaturprotein muss die typische Brennmuster charakteristisch DSBs, wenn sie mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung von zum Abbilden mCherry ein Filter-Set sichtbar zu zeigen. </li></ol> 2. Zellkultur <ol><li> Kultur U2OS-Zellen, die die miniSOG und mCherry tagged Reparaturproteine ​​unter den in Stufe 1.1 angegebenen Bedingungen. Wachsen Zellen auf 80% Konfluenz in einer 35 mm Durchmesser Glasbodenschale mit 2 ml DMEM. Stellen Sie sicher, dass der Leim, der das Deckglas auf den Kunststoff und die verwendeten Kunststoffisst ist beständig gegen wässrigen und alkoholischen Lösungen und beständig gegen das verwendete Harz! </li><li> Vor der Durchführung des Experiments, umreißen eine kleine Fläche von etwa 1 mm 2, die Zellen, die die ektopische Proteine ​​durch Kratzen mit einem sterilen Diamantfeder mit einem Fluoreszenzmikroskop, um den Bereich von Interesse zu identifizieren enthält. Alternativ verwenden Sie eine Bodenschale Glas tKappe enthält eine Deckglas mit einer vorgeätzten Gittersystem in das Deckglas aufgebaut. HINWEIS: Bei Verwendung von hochwertigen korrelative Mikroskopie kombiniert ESI und fluoreszenzmikroskopische Bilder 21, stellen Sie sicher, dass die Dicke des Deckglases mit Ölimmersionsobjektiven kompatibel ist. Es sollte die Dicke No. 1,5 (0,16 bis 0,18 mm). Wählen Sie einen Bereich in der Nähe der Mitte der Schale für die Region im TEM, um untersucht, um Probleme mit der Polymerisation des Harzes, das in der Nähe der Kanten auftreten können, zu vermeiden (siehe Punkt 4,10-4,13). </li></ol> 3. DNA Damage Induction <ol><li> Bestrahlen der Zellen mit Gamma-Strahlung, mit einem radiomime Arzneimittel oder induzieren die Schäden, die durch die Lasermikro Bestrahlung auf einem konfokalen Mikroskop (zB wie in 18,22 bzw. 23 beschrieben). </li><li> In diesem Beispiel Bestrahlung der Zellen mit 2 und 6 Gy Gammastrahlung in einer Cäsium-137-Strahlungsquelle oder Laser microirradiate wird bei 405 nm solid Laser aus einem konfokalen Mikroskop nach Sensibilisierung der Zellen für 20 min mit 0,5 &amp; mgr; g / ml Hoechst. </li></ol> 4. Probenvorbereitung <ol><li> Befestigen Sie die Zellen mit 1 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 M VORSICHT Natriumcacodylatpuffer oder in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, für 30 min bei RT im Dunkeln. ACHTUNG: Paraformaldehyd und Natriumcacodylat sind giftig! Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie die giftigen Substanzen ausreichend. </li><li> Mit 4 ml 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer, pH 7,4 oder Phosphatpuffer, pH 7,4, die Zellen werden zweimal. </li><li> Behandeln Sie die fixierten Zellen mit 2 ml 50 mM Glycin, 5 mM Aminotriazol und 10 mM Kaliumcyanid VORSICHT in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer oder 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) (überprüfen Sie den pH-Wert!) Für 30 Minuten, um zu blockieren nicht umgesetzte Aldehyd-Gruppen und die vom Häm-Gruppen erzeugt reaktive Sauerstoffspezies zu unterdrücken, die den Hintergrund erhöhen können. ACHTUNG: Kaliumcyanid ist extrem giftig! WOhr Handschuhe, arbeiten unter einer Haube und entsorgen Sie die giftigen Substanzen ausreichend. Die Reaktion ist sehr empfindlich gegenüber pH so ist es wichtig, dass der pH-Wert überprüft und genau. </li><li> Nehmen Sie den Bereich, der in Schritt 2.2 in 2D oder 3D auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop ausgewählt wurde, wenn die korrelative Mikroskopie gewünscht wird. </li><li> Bereiten Sie eine 1 mg / ml Diaminobenzidin-Hydrochlorid VORSICHT Lösung, indem ein 10 mg Diaminobenzidin Hydrochlorid-Tabletten in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Add 980 ul destilliertem H 2 O und 20 &amp; mgr; l konzentrierte Salzsäure (11,65 M) zugegeben und gemischt, bis die Lösung hellbraun und transparent. Verdünnen dieser Lösung in 0,1 M Phosphat oder 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml, während der pH mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 7,6 (pH-Wert 7,4 wird empfohlen). ACHTUNG: Diaminobenzidin ist giftig! Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie die giftigen Substanzen ausreichend. </li><li> Für Photooxidation, replace der Puffer mit 2 ml einer 1 mg / ml Diaminobenzidin Hydrochlorid-Lösung in 0,1 M Natriumkakodylat oder Phosphatpuffer. Schützen Sie diese Lösung vor Licht und abkühlen lassen auf Eis bis 4 ° C, um die Löslichkeit von Sauerstoff zu erhöhen. Sättigt die Lösung mit Sauerstoff durch Einblasen von Sauerstoff durch die Lösung (mit einem Schlauch, der in die Lösung eingelegt und mit einer Sauerstoffflasche angeschlossen). Überprüfen Sie den pH-Wert wieder, gegebenenfalls einstellen. Hinweis: Es ist wichtig für die Photooxidationsreaktion, dass der pH zwischen pH 7,0 und pH 7,6. </li><li> Montieren Sie den Teller mit den fixierten Zellen vorsichtig auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einem 40x Ölimmersionsobjektiv Objektiv ausgestattet und verschieben Sie sie in den Bereich von Interesse. Erregen die miniSOG Tag mit blauem Licht durch die Verwendung von Filterwürfel für GFP oder GFP. MiniSOG weist ein Anregungsmaximum bei 448 nm mit einer Schulter bei 473 nm 10. </li><li> Fahren Sie mit der Beleuchtung auch nach der grünen Fluoreszenz miniSOG haist völlig verschwunden, und bis die braune Photooxidationsprodukt des polymerisiert Diaminobenzidin tritt in dem übertragenen Lichtkanal. Wenn das Oxidationsprodukt ist in den meisten der Zellen sichtbar ist, schalten Sie die Fluoreszenzbeleuchtung, um die Photooxidation zu stoppen. HINWEIS: Die Photooxidation kann bis zu mehreren Minuten, abhängig von der Objektivlinse, Filter Übertragungswellenlängen und die Effizienz und der Beleuchtungsquelle zu nehmen. </li><li> Postfix die Zellen mit 1 ml von 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7,4 oder Phosphatpuffer pH 7.4 für 30 min. </li><li> Fixierung der Membranen der Zellen mit 0,1% -0,5% Osmiumtetroxid 20 min in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer, pH 7,4 oder in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4. HINWEIS: Es wird empfohlen, eine möglichst geringe Konzentration von Osmiumtetroxid erforderlich, um die Membranen zu stabilisieren, zu verwenden. Da die polymerisierten DAB Ausscheidungen haben eine hohe Dichte von Stickstoff, die durch ESI, einer starken direkt nachgewiesen werden kannOsmium Färbung ist nicht notwendig, die miniSOG-markierte Protein zu identifizieren und möglicherweise schädlich für die ESI sein. Osmiumtetroxid ist sehr giftig! Arbeiten Sie in einem Abzug und entsorgen Sie die giftigen Abfälle angemessen. </li><li> Dehydratisieren, die Zellen durch eine Ethanolreihe unter Verwendung von 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% Ethanol Schritten (jeweils 5 min). Anschließend Inkubation der Zellen in einem 1: 1-Mischung aus 100% Ethanol und Acrylharz (LR weiß) und die Schüssel auf einem Schüttler für 4 Stunden, um die Infiltration in die Zellen vor der Inkubation der Zellen für mindestens einen weiteren 4 h in 100 zu erleichtern % Acrylharz (LR weiß). </li><li> Um das Harz zu polymerisieren, schneiden Sie den Deckel eines markierten 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Rasierklinge und Mantel die Felge mit Acrylharz-Beschleuniger. Sicherzustellen, dass der Beschleuniger nur den Rand und nicht in das Rohr fließen. Anschließend vorsichtig den Schlauch zu füllen etwa zwei Drittel mit LR Weiß Harz mit einer Pasteurpipette. Darauf achten, dass das Harz nicht in Kontakt zu bekommen with der Beschleuniger auf den Rand! </li><li> Entfernen Sie das Harz, das die Zellen in der Schale unterwandert und die Schale auf den Kopf auf die aufrecht stehenden Mikrozentrifugenröhrchen, so dass die Breite des Rohres nahezu vollständig füllt das Glas abgedeckt Beobachtungsfenster der Schale. </li><li> Warten 1-2 min für das Gaspedal, um das Rohr und das Deckglas zu versiegeln, wird das Röhrchen, so dass das Harz in dem Röhrchen umfasst nun die Zellen. </li><li> Die Schale mit dem Rohr in einem Ofen bei 60 ° C und heilen 12 Stunden. </li><li> Wenn der Block ausgehärtet ist, entfernen Sie die Schale mit dem beigefügten harzgefüllten Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Ofen und trennen die Mikrozentrifugenröhrchen aus der Schale. Erleichtern die Trennung durch Auftauen und Einfrieren in flüssigem Stickstoff und heißem Wasser. </li><li> Entsorgen Sie die Bodenschale Glas und schneiden Sie vorsichtig öffnen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Rasierklinge, um den Block zu entfernen. </li><li> Beschriften Sie den Block mit einem Permanentmarker. </li><li> Verwenden einer Rasierklinge bis dreim die Block, so dass nur das 1 mm 2 Region, die zuvor mit dem Diamant oder Wolfram Stift markiert Bereich enthält (oder enthält die Fläche mit den Zellen von Interesse) bleibt. </li><li> Montieren Sie den Block in einem Ultramikrotom, schneiden Sie den Block mit einem Schneidmesser und Schnittultradünnschnitten von ca. 50 nm mit einem Diamantmesser. </li><li> Pick-up die Abschnitte über die High-Getriebe 300 Maschengitter. Diese Gitter haben sehr kleine Gitterstäbe und decken damit weniger Zellen im Bereich von Interesse. </li><li> Beschichten der Abschnitte über die Netze mit etwa 0,2-0,4 nm aus Kohlenstoff mit einer Kohlenstoffbeschichtung auf die Stabilisierung sie unter dem Elektronenstrahl des TEM. </li></ol> 5. Elektronenmikroskopie <ol><li> Laden Sie die Gitter in eine TEM, die mit einem Energiefilter ausgestattet ist. Nach Einstellen des Mikroskops und der Energiefilter nach den Anweisungen des Herstellers, kontrollieren die Zellen an den Abschnitten in geringen Vergrößerungsmodus (Normalübertragung) und vergleichensie Daten Fluoreszenz, wenn entsprechende (im Schritt 4.4) erhaltenen. </li><li> Einmal im Zellkern mit interessanten Features (DNA-Schaden verfolgen oder DNA-Reparatur-Foci) gefunden wird, wechseln Sie zu dem Energiefilterung-Modus und nehmen eine Dicke Karte. Hinweis: Dieses Verfahren beinhaltet die Eintragung einer Null-Verlust und ein ungefiltertes Bild. Dicken bis zu 0,3 mittlere freie Weglänge (30% der Elektronen des einfallenden Strahls wird von der Probe gestreut) sind dünn genug, um gute Elementar Karten zu erzeugen. </li><li> Rekordquote Karten der Elemente Phosphor und Stickstoff mit der Software, die die Energiefilter des Mikroskops verwendet, steuert. Notieren Sie die Phosphor-Karte Postkantenbilder bei 175 eV Energieverlust mit einer Schlitzbreite von 20 eV und Pre-Kantenbilder bei 120 eV Energieverlust, auch mit einer Schlitzbreite von 20 eV. Für die Stickstoff Karten, Rekord Beitrag Kantenbilder bei 447 eV mit einer Schlitzbreite von 35 eV und Pre-Kantenbilder bei 358 eV, auch mit einer Schlitzbreite von 35 eV. Hinweis: Da der Inhalt der abgebildeten Elemente (phosphOrus und Stickstoff) ist relativ niedrig (ca. 1%), wählen Sie &quot;Ratio-Bild&quot; (qualitative Elementar Karte) über die &quot;3-Fenster-Methode&quot; (quantitativ zu elementarem Karte), um Bilder mit einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen. </li></ol> 6. Bildverarbeitung <ol><li> Öffnen Sie die Elementverhältnis Karten in einer Bildverarbeitungssoftware, die das Dateiformat der erworbenen Bilder (zB Digital Micrograph) verarbeiten kann. Kopieren Sie die Stickstoff-Karte in den roten Kanal und dem Phosphor-Karte in den grünen Kanal eines RGB-Bildes, so zu überlagern und die Karten auszurichten. </li><li> Exportieren Sie das zusammengesetzte Bild als Tagged Image File Format (TIFF) Datei. Öffnen Sie das Bild in einem Bildbearbeitungssoftware, die Schichten verwenden können (zB Photoshop). </li><li> Die Dynamikbereich jedes Kanals durch Neuskalierung der minimalen und maximalen Werte in dem Bild, um eine 8-Bit-Datensatzes (0 bis 255). </li><li> Subtrahieren Sie die Phosphorgehalt aus dem Stickstoff Karte (mit demFenster &quot;Layers&quot;), um eine Karte oder die die Verteilung von Protein zeigt generieren. </li><li> Konvertieren Sie die Karten der Nukleinsäure (Phosphor) und des Proteins (Stickstoff) im vorherigen Schritt in die &quot;Indexfarben&quot; erstellt und eine gelbe Lookup-Tabelle im CMYK-Farbraum für die Karte, die die Nukleinsäure Verteilung und eine Cyan-Lookup-Tabelle zu erstellen um die nicht-Nukleoprotein Karte anzuzeigen. Die Farben werden gewählt, um maximalen Kontrast zwischen den beiden elementaren Karten zu erzeugen. </li><li> Erstellen Sie ein neues Bild, und importieren Sie die Karten, die die Verteilungen von Phosphor und Protein als verschiedene Schichten. Verwenden Sie die &quot;Bildschirm&quot; Transparenz-Modus, um die beiden Schichten übereinander zu sehen. </li><li> Öffnen Sie die Zero-Loss-Bild in Schritt 5.2 erworben. Diese Abbildung stellt ein Bild des aufgezeichneten Bereichs, der wie eine herkömmliche Bild TEM sieht, enthält jedoch nur die Elektronen, die durch die Probe ohne Kollision mit der Probe durchlaufen haben. ExportDieses Bild als TIFF-Bild. </li><li> Öffnen Sie die exportierte Bildnullverlust in einem Foto-Editor und kopieren Sie sie in der obersten Schicht des Bildes, das die elementaren Karte. Richten Sie das Bild mit der &quot;screen&quot; Transparenz-Modus. </li><li> Optional Schwelle der Nullverlust Bild zu segmentieren das Signal, das von der miniSOG stammt. Als separate Schicht In das resultierende Bild, wie oben beschrieben. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells.">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li><li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprint+of+'Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+(QuEST).">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li><li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming.">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li><li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin.">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, 308-322 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ESI kann als ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Prüfung verschiedener Zustände des Chromatins und Ribonukleoproteine ​​im Kern, weil es in der Lage, speziell map Bereiche, die reich an Phosphor sind, ist zu dienen. Erhöht es grundlegend die Menge an Details, die mittels eines Elektronenmikroskops erhalten werden kann, und ist nicht abhängig von unspezifischen Kontrastverfahren. Ein Nachteil ist, dass es ESI dünneren Abschnitten als herkömmliche TEM gleichzeitig Beschleunigungsspannung erfordert. Dies kann d...

Trotz der erheblichen Fortschritte in der Lichtmikroskopie in den letzten Jahren 1, Zellbiologen leiden immer noch unter einer Lücke in Auflösung. Dies begrenzt Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehungen in grundlegenden zellulären Prozesse, die eine koordinierte Zusammenspiel von makromolekularen Komplexen beinhalten (zB in Chromatin-Remodeling, DNA-Reparatur, die RNA-Transkription und DNA-Replikation). Obwohl Transmissions-Elektronenmikroskopen (TEM) s die erforderliche Auflösung, es schwierig war, diese Prozesse strukturell wegen der Unfähigkeit zu definieren, um bestimmte Proteine ​​zu markieren gleichzeitig in der Lage, die biochemische Zusammensetzung der visualisierten Strukturen zu bestimmen. In Abwesenheit von internen Membranen zur Unterscheidung der Kernstrukturen wurde der Kern eine besonders anspruchsvolle Aufgabe. Elektronenspektroskopie-Bildgebung (ESI) löst einige dieser Beschränkungen, indem sie den gleichzeitigen Nachweis und die Differenzierung von DNA, RNA und protein-basierten Kernstrukturen 2-5. Electron spektroskopischen Bildgebung: Um elementaren Verteilungen mit hoher Empfindlichkeit und Auflösung im Elektronenmikroskop abzubilden, kann man ein Bildgebungsspektrometer, die Elektronen, die unelastisch durch Wechselwirkungen mit Innenschale Elektronen eines Elements in der Probe 6 wurde zerstreut wählt verwenden. Weil elementspezifischen Energiemengen als Folge der Ionisation von Atomen in der Probe verloren geht, können diese Elektronen getrennt und visualisiert unter Verwendung eines Spektrometers, das Elektronenmikroskop befestigt werden. Somit Analyse des Spektrums der Elektronen, die mit der Probe in Wechselwirkung getreten zeigt die qualitative und quantitative Informationen über die elementare Zusammensetzung der Probe 7. Elektronen, die keine Energie verlieren, wenn die durch die Probe werden in der &quot;Null-Verlust-Spitze&quot; des Elektronen-Energieverlust gefundenSpektrum. Die Fülle dieser Elektronen zu der Masse, Dichte und Dicke der Probe bezogen ist und der Elektronen, die durch die Probe passieren, ohne mit der Probe oder Energie beim Durchgang durch die Probe zu verlieren besteht. Diese Information kann für die absolute Quantifizierung der Anzahl von Atomen eines bestimmten Elements in der vorliegenden Probe 8 ist. Da biologische Proben bestehen hauptsächlich von Lichtelementen, die schlecht in den einfallenden Strahl der TEM lenken die Elektronen, Färbeverfahren unter Verwendung von Schwermetallsalzen werden müssen, um den Kontrast in der Probe zu erzeugen, aufgebracht werden. Die mangelnde Spezifität der meisten dieser Kontrastmittel und die Unfähigkeit, mehr als ein Fleck, wo Spezifität möglich visualisieren hat den Wert der herkömmlichen Elektronenmikroskopie bei der Untersuchung des Kerns beschränkt. ESI hat signifikante Vorteile gegenüber herkömmlichen TEM, insbesondere für die Untersuchung von Strukturen des Zellkerns.Es ist möglich, die phosphorreichen Natur der DNA- und RNA-enthaltenden makromolekularen Komplexen auszunutzen Nucleoprotein-Komplexe aus Protein-Komplexe zu unterscheiden und verschiedene Nucleoproteinkomplexen ihre Dichte von Nukleinsäuren zu lösen. Der verbleibende biologische Material kann auf der Grundlage seiner Fülle von Stickstoff abgebildet werden. Mapping nur diese beiden Elemente und Analyse von deren Verteilung und relative Häufigkeit innerhalb der verschiedenen anatomischen Strukturen bietet uns eine Vielzahl von Informationen über den Zellkern. Zum Beispiel ist es einfach, Chromatin und den Ribosomen in der Karte darstellt Phosphor Fluss identifizieren. Die interchromatin Raum Kernporenkomplexe und Kernkörper, andererseits leicht in der Stickstoffkartenbild detektiert werden. Mini Singulett-Sauerstoff-Generator-System (miniSOG) Während ESI stellt eine leistungsfähige Technik, um in situ Chromatinstruktur zu studieren, weil es,s Vorteil der charakteristischen Verhältnisse in elementare Zusammensetzung von Phosphor und Stickstoff, kann die Elementzusammensetzung in der Regel nicht verwendet werden, um zwischen den verschiedenen Populationen von Protein-Komplexen zu unterscheiden. Antikörper mit kleinen Goldpartikel im Nanometerbereich markiert wurden allgemein verwendet, um die Lage der einzelnen Moleküle abzubilden. Da die Goldpartikel in der Regel zu einem sekundären Antikörper gebunden ist, wird es in einem Umkreis von etwa 20 nm auf der durch den primären Antikörper nachgewiesen Epitop angezeigt. In Posteinbettungsproben können Antikörper nur die Epitope, die an der Oberfläche der Abschnitte freiliegen detektieren. Während es möglich ist, die Anwesenheit eines Antigens nachzuweisen und in Beziehung zu einer bestimmten anatomischen Struktur der Zelle, die Information, die erhalten wird, nicht vollständig ist, da die meisten der Epitope durch Harz verdeckt. Pre-Einbettungstechniken, die ähnliche Protokolle zu denen für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet verwenden, erlauben den Zugriff auf Antigene in ganzdie gesamte Tiefe der Probe, aber die Permeabilisierung Schritte, die erforderlich sind, damit der Antikörper an die Zelle eindringen erfordern typischerweise die Entfernung von Lipidmembranen und Komponenten, die nicht durch Aldehyde fixiert werden können, zu entfernen. Darüber hinaus ist die bevorzugte Aldehyd Fixiermittel für Ultra Konservierung, Glutaraldehyd, üblicherweise zerstört Epitopen und folglich wird Paraformaldehyd in der Regel erforderlich. Dies ist weniger effektiv bei der Protein-Protein-Vernetzung. Ein weiterer Nachteil von Antikörpern, die mit einer Gold-Nanoteilchen bezeichnet werden, ist, daß Gold ein sehr elektronendichtes Material, das einen starken Kontrast, die interessante strukturelle Details der Probe, die schwächeren Kontrast hat verschleiern kann erzeugt. Die Entstehung des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) als ein exprimiertes Protein-Tag hat die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie, um Fragen in der Zellbiologie Antwort umgewandelt. Tagging ein Protein mit einem kleinen Leuchtstoff Domäne ermöglicht Abbildung von seiner Verteilung in vivo </em&gt; ohne Permeabilisierung Verfahren, die die Struktur verändern können. Um die elegante Prinzip der Verwendung von Protein-Tags, um die Proteinverteilungen Karte in einer Zelle Elektronenmikroskopie zu übersetzen, wurde ein System benötigt, das in der Lage ist, ein Signal in der Nähe der Struktur von Interesse produzieren und erzeugen Kontrast in der TEM ist. Polymerisierten Diaminobenzidin ist ein Flecken, die oft in der Histologie verwendet wird, um Antikörper nachzuweisen verbindlich. Diese Färbung wird üblicherweise unter Verwendung von Meerrettichperoxidase (HRP) an einen sekundären Antikörper konjugiert abgeschieden. Obwohl die Reaktion ein zuverlässiges Ergebnis ist HRP nicht in das Cytosol der Zellen 9 katalytisch aktiv. Die Reaktionsprodukte von HRP kann auch diffundieren weg von der Stelle der Erzeugung, so dass ihre Auflösung ist schlechter als der Nanogold-Verfahren 10. Um diese Probleme zu umgehen, wurde der Flash / ReAsH System 11 entwickelt. Es besteht von rekombinanten Fusionsproteinen, die ein Tetracysteinmotiv Motiv besitzen. Dieses Motiv ermöglicht die Bindung vona biarsenic Fluorophor. Wenn sie erregt werden, wird das gebundene Flash oder ReAsH Lage, den hochreaktiven Singulett-Sauerstoffs und somit photoconvert Diaminobenzidin (DAB) in einem Polymer, das unmittelbar am Ort der markierten Proteine ​​Ausscheidungen zu erzeugen. Der DAB-Polymer kann mit Osmiumtetroxid, die Elektronendichte ist, und kann somit verwendet werden, um die Verteilung des rekombinanten Fusionsproteins in der TEM abzubilden gefärbt werden. Im Jahr 2011 Shu et al. 10 präsentiert den miniSOG System, das aus einem kleinen 106 Aminosäuren Fusion-Tag aus einem Flavoprotein von Arabidopsis, die Leuchtstoff und in der Lage, viele Singulett-Sauerstoff-Radikale, wenn sie mit 448 nm blaues Licht angeregt zu erstellen ist abgeleitet aus. Jene Singulettsauerstoff Reste können photo oxidize Diaminobenzidin verwendet werden, um Polymere an und nahe der Oberfläche der markierte Protein, das wesentlich näher als Immunogold markierten Antikörpern 11 bilden. Während der Blitz / ReAsH System erfordert womit sich die FluorChrom und das Diaminobenzidin in die Zellen, bevor Sie die Photokonversion, die miniSOG System benötigt nur Diaminobenzidin und leicht und außerdem ist etwa so effektiv zweimal bei Polymerisation von Diaminobenzidin. Hier wird miniSOG in Kombination mit ESI, um die Ultrastruktur von DNA-Reparatur-Foci Karte eingesetzt. DNA-Reparatur-Foci (DRF) Nicht reparierten DNA-Doppelstrangbrüche stellen eine ernsthafte Bedrohung für die Zelle, da sie für die Umsiedlung und den Verlust der genetischen Information zu führen. Wiederum kann dies Seneszenz, Krebs und Zelltod führen. Viele Proteine, die an DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur beteiligt sind, sammeln sich Schwerpunkte, die um einen DNA-Doppelstrang zusammenzubauen brechen 12-14. Obwohl ihre Funktion nicht bekannt ist, stellen sie die Website in den Zellkern, die die DNA-Doppelstrangbruch enthält, und ist der Ort von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur. DNA-Reparatur foci (DRF) wurden durch Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert worden, und sie als Biomarker für DNA-Schäden 12,15 dienen. Sie sind massiv in Bezug auf die Größe des Doppelstrangbruch und wurden als relativ homogen bis in die jüngste superauflösende Mikroskopie Studien zeigten einige Anzeichen von Unter Abschottung der Moleküle innerhalb jedes konzentrieren 16. Um zu verstehen, wie diese Seiten organisiert sind, ist es notwendig, alle der zugrunde liegenden biologischen Strukturen relativ zueinander zu visualisieren. Dies kann nicht durch Fluoreszenz-Mikroskopie erreicht werden, ist jedoch durch Elektronenmikroskopie 17,18 möglich. Hier wird ein Verfahren beschrieben, das Elektronen-spektroskopischen Bildgebung kombiniert mit der miniSOG Methode, um das Potenzial dieses kombinierten Ansatzes zu illustrieren, um die Ultrastruktur von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur zu erkunden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded 35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD&#160;</td>
			<td>not made for immersion objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White: acryl resin</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White accelerator</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td>
			<td>SPI</td>
			<td>1161123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten-Point Lab Pen</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>41148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater 208carbon</td>
			<td>Cressington</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra microtome Leica EM UC6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS5</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Micrograph V.2.30</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSOG-Constructs</td>
			<td>Tsien-Lab</td>
			<td></td>
			<td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDC1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>53BP1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rad52 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium 137 radiation source &#34;MARK 1&#34;</td>
			<td>&#160;(J.L. Shepherd &#38; Associated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FiJi</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife ultra 35&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming Knife ultratrim</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>12300</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade 8%</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>16020</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution 10M</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Medigas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-1,2,4-triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>207810</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>15058</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade Single Edge Carbon Steel</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>71960</td>
			<td>Caution Sharp!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope 200 kV</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIF Tridiem 863 Energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)

Die Grenzen der optischen Auflösung und der Herausforderung der Identifizierung von spezifischen Proteinpopulationen in der Transmissionselektronenmikroskopie wurden Hindernisse in der Zellbiologie. Viele Phänomene können durch in vitro-Analyse, ein vereinfachtes System erläutert und benötigen zusätzliche Strukturinformationen in situ, insbesondere im Bereich zwischen 1 nm und 0,1 &amp; mgr; m, um vollständig zu verstehen. Hier Elektronen spektroskopische Bildgebung, eine Transmissions-Elektronenmikroskopie-Technik, die gleichzeitige Abbildung der Verteilung der Proteine ​​und Nukleinsäuren ermöglicht, und ein Ausdruck tag, miniSOG, kombiniert werden, um die Struktur und Organisation der DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Foci studieren.

ESI Vergleichen der ESI Bilder des Kerns (1) mit den üblichen TEM-Bilder (zB Bild 7-1) zeigt eine dramatische Zunahme der anatomischen Strukturen, die leicht unterschieden werden können. Die Chromatin Rücken erscheinen gelb und es ist ganz einfach, die Chromozentren in Mauszellen zu identifizieren. Kernkörperchen leicht von Chromatin durch ihre runde Struktur und unterschiedliche Farbe unterschieden werden, da die vormontierte R...

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Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

visualization-minisog-tagged-dna-repair-proteins-combination-with

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

10.0K Aufrufe.  University of Alberta. Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Serie: Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Forschung

Biologie

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualisierung der MG53-vermittelte Cell Membrane Repair mit In vivo Und In-vitro- Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

Photodiodenbasierte optische Bildgebung zur Aufzeichnung der Netzwerkdynamik mit Einzelneuronauflösung bei nicht-transgenen Wirbellosen

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)