SL wurde von einem Stipendium der DFG (Graduate Research School 845) unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der DFG (SFB 530/C1 &amp; FOR 967) und durch HOMFOR unterstützt.

1. Vorbereitung der Stammlösungen <ol><li> Bereiten Sie Calcium-freien Puffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM EGTA, 10 mM Glukose in 10 mM HEPES-KOH (pH 7,35)). </li><li> Solubilisieren FURA-2 AM in DMSO zu einer 1 mM Stammlösung zu erhalten. Mix mit einem Vortex, bis die Lösung homogen hellgelb. Schützen Kelch von Licht. Verdünnen Sie die FURA-2 AM Stammlösung in 1 ml Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin in einer Endkonzentration von 4 uM für das Laden von HeLa-Zellen. </li><li> Bereiten Sie eine 12,5 mM Puromycin Stammlösung in destilliertem Wasser (pH 7,0). Shop Aliquots bei -20 ° C. Verdünnen Sie die 12,5 mM Puromycin Stammlösung in der Calcium-freien Puffer zu einer Endkonzentration von 500 nM Puromycin. </li><li> Lösen Sie Thapsigargin in DMSO zu einer 1 mM Stammlösung zu erhalten. </li><li> Solubilisieren 1 mg ophiobolin A in 20 ul Chloroform und anschließend mit 25 ul DMSO mischen. Die Mikrozentrifugenröhrchen bleibt geöffnet, bis Chloroform verdampft. So ist die endgültige ophiobolin Eine Konzentration von 100 mM. Shop Aliquots bei -20 ° C. Vor dem Gebrauch zu verdünnen Stammlösungen in Calcium-freien Puffer zu einer Endkonzentration von 100 nM. So funktioniert endgültige DMSO-Konzentration für Live Cell Imaging 0,1% nicht überschreiten. </li><li> Lösen Sie Trifluoperazin in DMSO zu einer Konzentration von 10 mM und speichern Aliquots bei -20 ° C. Verdünnen Stammlösungen in Calcium-freien Puffer zu einer Endkonzentration von 10 uM vor dem Gebrauch. So endgültige DMSO-Konzentration für Live Cell Imaging, wie zum ophiobolin A, nicht mehr als 0,1%. </li><li> Lösen Sie den siRNAs (SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA und Kontroll-siRNA) in RNase freiem Wasser auf ein 20 uM Stammlösung. Mix mit einem Vortex und beobachten Solubilisierung durch Auge. Store 50 ul Aliquots bei -20 ° C. </li></ol> 2. Gene Silencing in HeLa-Zellen Um den Beitrag eines bestimmten Proteins zu ER Ca 2 +-Efflux-Studie hat das jeweilige Gen effizient mit zwei verschiedenen siRNAs (Abb. 1) zum Schweigen gebracht werden. Darüber hinaus hat die Wirkung von silencing durch Expression des jeweiligen Wildtyp-Gen zu überwinden. In der Regel verwenden wir siRNAs, die gegen die kodierenden und nicht-kodierenden (UTR) Region bzw. des Gens von Interesse gerichtet sind. Der Einsatz UTR-directed siRNA bietet eine bequeme Möglichkeit für die Komplementierung. <ol><li> Seed 5,2 x 10 5 HeLa-Zellen (ATCC-Nr. CCL-2) in einer 6 cm Kulturschale mit einem 25 mm Deckglas (mit 200 ul von Poly-L-Lysin (1 mg / ml) für 1 h vorbehandelt) in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin und bei 37 ° C in eine feuchte Umgebung mit 5% CO 2 (Endvolumen 3,9 ml). </li><li> Transfizieren die Zellen mit SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA, oder eine negative Kontroll-siRNA mit HiPerFect Reagenz nach den Anweisungen des Herstellers (Endkonzentration von siRNA: 20 nM). Kurz gesagt, bereiten siRNAs frisch in einem separaten Reaktionsgefäß vor der eigentlichen Transfektion Verfahren: In 20 pl HiPerFect Transfektionsreagenz bis 4 ul jeder siRNA (20 nM), die in 80 ul OptiMEM gelöst ist. Diese Mischung wird vorsichtig gevortext und bei Raumtemperatur inkubiert für 10 min. Fügen Sie die siRNA-Mix (104 ul) tropfenweise zu dem ausgesät 5,2 x 10 5 HeLa-Zellen (3,9 ml). </li><li> Nach 24 h, ändern das Medium (3,9 ml) und schleusen die Zellen ein zweites Mal mit der gleichen siRNA-Mix (104 ul). </li><li> Bewerten silencing mittels Western-Blot-Analyse. Es sollte über 80% betragen. Wash-Zellen von der Zellkulturschale in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und ernten in DMEM. Zählen Sie die Zellen durch den Einsatz der Gräfin Automated Cell Counter. Lyse der Zellen in Zell-Lyse-Puffer (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 mM MgCl 2, 0,5% NP40) ergänzt mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail (3 pg / ml Pepstatin A, 3 g / ml Leupeptin, 3 pg / ml Antipain, 3 pg / ml Chymastatin) zugeben und mit SDS-Probenpuffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 5% β-Mercaptoethanol, 0,01% Bromphenolblau ), um eine endgültige Konzentration von 10.000 Zellen / ul. Wärme-Proben bei 56 ° C für 15 min und anschließend fügen Sie einige Glasperlen und Vortex für 20 min zu fragmentieren DNA. Separate 20 ul jeder Probe von einem Laemmli-Typ SDS-PAGE (in der Regel 15% für das Trenngel Polyacrylamid). Transfer getrennten Proteine ​​auf eine PVDF-Membran durch Elektroblotting (&quot;Wet-Blot&quot;) bei konstanten 400 mA für 3 h oder über Nacht in Transfer-Puffer (100 mM Glycin, 12,5 mM Tris-HCl). Danach setzen Block mit 5% (w / v) fettarmer Trockenmilch in PBS für 30 min bei Raumtemperatur und anschließend den Fleck an den primären Antikörper gegen den C-Terminus von Sec61α aus Kaninchen gerichtet und ein Anti-β-Aktin- Antikörper aus der Maus. Waschen Sie den Fleck in PBS-TritonX-100 (0,05%) und tWICE in PBS für 5 min, jeweils. Visualisieren Sie die primäre Antikörper mit ECL Plex Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Cy5-oder ECL Plex Ziege-anti-Maus IgG-Cy3-Konjugat und der Typhoon-Trio Imaging-System in Kombination mit dem Bild Quant TL-Software 7.0. Im Falle der SEC61A1 Gen, ist die maximale schalldämpfende Wirkung in der Regel 96 h nach der ersten Transfektion gesehen. Ein repräsentatives Experiment ist in Abb.. 2. </li></ol> 3. Die Komplementation von HeLa-Zellen Um den Phänotyp SEC61A1 Schweigen zu retten, war die SEC61A1 cDNA in die multiple Klonierungsstelle (MCS) von pcDNA3-interne Ribosomenbindungsstelle (IRES)-GFP-Vektor, der Cytomegalovirus-(CMV)-Promotor, der MCS enthaltenen eingefügt, der IRES, plus die grüne fluoresecent Protein (GFP) kodierenden Sequenz. <ol><li> 48 h nach der ersten siRNA-Transfektion, Austausch des Mediums (3,9 ml) ein zweites Mal und verwandeln die Zellen entweder mit leerem Vektor oder SEC61A1 Expressionsplasmid mit Fugene HD nach dem Protokoll des Herstellers (final Verhältnis von Vektor zu Fugene HD ist 4 ug Vektor zu 16 ul Fugene HD). Kurz gesagt, bereiten Plasmide frisch in einem separaten Reaktionsgefäß vor der Transformation vor: Fügen Sie 16 ul Fugene HD Transformation Reagenz bis 4 pg jedes Plasmid, das in 80 ul OptiMEM gelöst ist. Gently Wirbel dieser Mischung und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. Fügen Sie die Plasmid-Mix (0,1 ml) tropfenweise zu dem ausgesät 5,2 x 10 5 HeLa-Zellen (3,9 ml). </li><li> Nach 48 h von Plasmid-Ausdruck, vorbehaltlich Kulturschalen zur Fluoreszenz-Mikroskopie vor Kalzium-Imaging und Ernte. Bei Bedarf ersetzen DMEM von PBS für eine bessere Fluoreszenzsignale. Rekord Fluoreszenzbilder auf einem Fluoreszenz-Mikroskop mit CCD-Kamera ausgestattet. Transformation Effizienz, indem die Anzahl der Zellen, die GFP-Fluoreszenz von Zellen in der Hellfeld-Modus gezählt und sollte über 80% bestimmt werden. Ein typisches Ergebnis ist in Abb.. 3. </li></ol> 4. Live-Cell Calcium Imaging <ol><li> Vor der Messung, Transfer das Deckglas mit transfizierten HeLa-Zellen in einem separaten 3,5 cm Kulturschale beschichtet. Laden Sie die Zellen mit 4 uM FURA-2 AM in 1 ml DMEM für 45 min bei 25 ° C im Dunkeln 11,12. </li><li> Fix ein 25 mm Deckglas in der iMIC Metall Kammer und waschen Sie die Zellen zweimal und inkubieren in einem Calcium-freien Puffer (jeweils 300 ul). </li><li> Starten Sie das Sammeln von Daten auf einem iMIC Mikroskop mit polychromen V durch abwechselndes spannend bei 340 nm und 380 nm und Messung der emittierten Fluoreszenz bei 510 nm (Filter gesetzt: Strahlteiler, 565 nm; Emitter, 605/70 nm). Beispiel-Bilder mit 20-50 Zellen / Frame alle 3 s. Rekord FURA-2-Signale als das Verhältnis F340/F380, wo F340 und F380 in den Hintergrund-subtrahiert Fluoreszenzintensität entspricht bei 340 und 380 nm auf. </li><li> Nach 1 min, behandeln Zellen mit Puromycin (500 uM) in Calcium-freiem Puffer oder mit dem gleichen Puffer. Alternativ behandeln Zellen mit einem kleinen Molekül-Hemmer (z. B. 10 uM Trifluoperazin oder 100 uM ophibolin A) oder mit dem Calcium-freien Puffer. </li><li> Nach ratiometrische Messungen für 2 oder 10 min durchgeführt werden, fügen Thapsigargin (1 pM) und setzen Sie die Messungen. </li><li> Schließlich cytoslic [Ca 2 +] wird aus Verhältnis-Messungen von einem etablierten Kalibriermethode geschätzt. 2. Analysieren von Daten von Excel 2007 und Origin 6.1. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Bisher haben wir uns die Frage, ob Schweigen der SEC61A1 Gen beeinflusst Kalzium (Ca 2 +) Leckage aus dem ER (Abb. 1). Die SEC61A1 Gen wurde durch zwei verschiedene siRNAs in HeLa-Zellen 96 Stunden lang zum Schweigen gebracht. Während silencing kaum beeinflusst das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit wurde Protein-Transport in das ER von semi-permeabilisierten Zellen nahezu vollständig gehemmt. Darüber hinaus wurden die SEC61A1 Schweigen Zellen stark in Bezug auf Ca 2 + Leckage aus dem ER betroffen. Die Wirkung von Gen-Silencing wurde durch die Expression des Gens SEC61A1 umgekehrt. So bilden Sec61-Komplexe, die in der ER-Membran von allen kernhaltigen Zellen sind Ca 2 +-Kanäle undicht, die voraussichtlich eine entscheidende Rolle in der Ca 2 +-Homöostase spielen können. Dagegen ist die Anwesenheit von großen, mit Wasser gefüllten Poren mit unkontrollierten Ionendurchlässigkeit, wie von Sec61-Komplexe in der ER-Membran gebildet, ernsthaft mit der geregelten Freisetzung von Ca 2 + stört aus dem ER-Lumen in das Cytosol, ein wesentlicher Mechanismus für die intrazelluläre Signalisierung. Wir identifizierten eine Calmodulin (CaM)-Bindungsmotiv in der cytosolischen N-Terminus von Säugetieren Sec61α dass gebunden CaM aber nicht Ca 2 +-freien apocalmodulin mit nanomolaren Affinität und Sequenz-Spezifität. Auf zellulärer Ebene, stimuliert zwei verschiedene CaM-Antagonisten Ca <sup&gt; 2 +-Freisetzung aus dem ER in der Gegenwart, aber nicht in der Abwesenheit von Sec61-Kanäle (Abb. 4 und 5). Letztere wurde nicht beobachtet, wenn Sec61-Kanäle vorhanden waren, die enthaltenen Mutationen im IQ-Motiv Sec61α. So, Ca 2 +-CaM ist bei der Begrenzung Ca 2 + Leckage aus dem ER (Abb. 6) beteiligt. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Ablaufschema. Siehe Text für Details. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Datenanalyse zum Schweigen zu Effizienz. Silencing wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern, die gegen Sec61α und β-Aktin (Ladekontrolle) gerichtet wurden ausgewertet. Die primären Antikörper wurden durch Verwendung von ECL Plex Sekundärantikörper und Fluoreszenz-Bildgebung. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Datenanalyse für die Transfektionseffizienz. Die Bilder wurden auf einem Fluoreszenz-Mikroskop mit CCD-Kamera ausgestattet aufgezeichnet. Transformation Effizienz, indem die Anzahl der Zellen, die GFP-Fluoreszenz von Zellen in der Hellfeld-Modus gezählt bestimmt werden. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Screenshots aus lebenden Zellen Kalzium-Imaging von HeLa-Zellen in Anwesenheit von Kontroll-oder SEC61A1-siRNA und das Vorhandensein oder Fehlen der CaM-Antagonist ophiobolin A. HeLa-Zellen wurden mit siRNA gegen SEC61A1 (B) oder eine gezielte Behandlung negativen Kontroll-siRNA (A) für 96 h wie angegeben. Diese Zellen wurden mit dem Calcium-Indikator FURA-2 AM beladen und inkubiert in einem Ca 2 + freiem Puffer mit 0,5 mM EGTA, dann Puffer oder ophiobolin A (Ophio A) in Puffer wurde zugegeben und die Inkubation fortgesetzt. Nach 10 min, Ca 2 +-Freisetzung wurde durch Aufbringen von Thapsigargin (TG) in Abwesenheit von externen Ca 2 + ausgelöst und die Inkubation fortgesetzt. Screenshots aus dem kontinuierlichen Kalzium-Imaging wurden zu den angegebenen Zeiten entnommen. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Datenanalyse für Live Cell Calcium Imaging Experimente. (A) Kinetik und quantitative Analyse einer Reihe von Experimenten, wie in Abb. dargestellt. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] wurde von Ratio-Messungen von einem etablierten Kalibriermethode 2 geschätzt. Die Wirkung von Thapsigargin ist als Balkendiagramm dargestellt. (BD) Die Zellen wurden mit Kontroll-siRNA oder die angegebene SEC61A1-siRNA für 48 h behandelt und dann entweder mit Kontroll-Vektor (C), oder SEC61A1 Expressionsplasmid (C), oder Mutante SEC61A1 Expressionsplasmid (D) wie verwandelt. Nach 48 h wurden Kalzium-Imaging Experimente wie in Abb. 4 und 5A durchgeführt. Die statistische Analyse der Veränderungen in der cytosolischen Ca 2 +-Konzentration nach der Zugabe von Thapsigargin in Experimenten wie dargestellt in A gezeigt. P-Werte &lt;0,001 wurden als signifikant von ungepaarten t-Test definiert und werden durch drei Sternchen (***), ns, nicht signifikant angegeben. Die Zahl der Zellen, analysiert werden angezeigt. Durchschnittliche Werte angegeben sind, sind auf Fehler und Bars Standardfehler der Mittelwerte (SEM). Wir stellen fest, dass diese Beispiele aus Lit. wurden angepasst. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. Diese Daten zeigen, dass die Freisetzung von naszierenden Ketten aus den Sec61-Komplex in der Tat führt zu Calcium-Freisetzung aus dem ER und die Bildung eines Calcium-Nanodomänenstruktur rund um die cytosolische Mündung des Sec61-Komplex. Das Kalzium wird durch Calmodulin gebunden und Calcium-Calmodulin schließt den Sec61-Komplex. &quot;

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	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling.">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+physiological+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells.">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li><li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores.">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li><li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation.">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li><li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum:+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes.">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li><li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry.">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li><li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocon+closure+to+Ca2++leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells.">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. 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L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum.">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li><li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++signalling+by+Na+/Ca2++exchangers+in+mast+cells.">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li><li>Gross, S. 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In Säugerzellen spielt das endoplasmatische Retikulum (ER) eine wichtige Rolle in Protein Biogenese sowie in Calcium-Signalgebung. Hier haben wir ein experimentelles System, das uns direkt auf die Rolle eines potentiellen Ca 2 + Leckkanal und seine mutmaßlichen regulatorischen Mechanismen 13 charakterisieren lässt beschrieben. Dieses experimentelle System gibt uns die einzigartige Gelegenheit, i) Beurteilung des Beitrags der einzelnen ER-Membran-Proteinen auf passive Ca 2 +-Efflux aus dem ER in verschiedenen Zelltypen, ii) charakterisieren die Proteine ​​und Mechanismen, die diese passive Ca 2 +-Efflux zu begrenzen und iii) die Auswirkungen von Erkrankungen im Zusammenhang Mutationen in den entsprechenden Komponenten. Wir stellen fest, dass nur lebensfähige Zellen analysiert werden sollten und dass insgesamt die Lebensfähigkeit sollte über 80% betragen. Daher ist die Lebensfähigkeit der Zellen routinemäßig ausgewertet beschäftigt Nuclear-ID blau / grün Lebensfähigkeit der Zellen Reagenz nach dem Protokoll des Herstellers. Darüber hinaus statistische Analyse der Veränderungen in der cytosolischen Ca 2 +-Konzentration ist obligatorisch. Deshalb haben die Experimente für vier verschiedene Chargen von Zellen und zwei Deckgläsern durchgeführt werden mit mindestens 20 Zellen für jede Bedingung in einem einzigen Experiment untersucht werden müssen. Wir nehmen zur Kenntnis, dass die verschiedenen Experimente an der gleichen Zeit nach der Aussaat auf dem Deckgläschen durchgeführt werden müssen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> DMEM + Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> Nuclear-ID Blau / Grün die Lebensfähigkeit der Zellen Reagenz </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ENZ-53004 </td></tr><tr><td> FURA-2 AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> Ophiobolin A </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ALX-270 bis 109 </td></tr><tr><td> Trifluoperazine </td><td> Sigma </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Gräfin ® Automated Cell Counter </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon-Trio Imaging-System </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> TE2000-S-Mikroskop mit DS-5MC Kamera </td><td> Nikon </td><td></td></tr><tr><td> iMIC Mikroskop mit polychromen V </td><td> Till Photonics </td><td></td></tr></tbody></table>

live cell calcium imaging combined with sirna mediated gene silencing identifies ca2+ leak channels in the er membrane and their regulatory mechanisms

In Säugerzellen spielt das endoplasmatische Retikulum (ER) eine wichtige Rolle in Protein Biogenese sowie in Calcium-Signalgebung 1. Die heterotrimeren Sec61-Komplex in der ER-Membran ist ein wässriges Weg für neu synthetisierte Polypeptide in das Lumen des ER. Neuere Arbeiten aus verschiedenen Laboratorien vorgeschlagen, dass diese heterotrimeren Komplex kann auch Form transiente Ca 2 +-Kanäle undicht 2-8. Die wichtigste Beobachtung für diese Vorstellung war, dass die Freisetzung des entstehenden Polypeptide aus dem Ribosom und Sec61-Komplex durch Puromycin führt zu transienten Freisetzung von Ca 2 + aus dem ER. Außerdem hatte es in vitro beobachtet worden, dass die ER luminalen Protein BiP bei der Verhinderung Ionenpermeabilität auf der Ebene der Sec61-Komplex 9,10 beteiligt ist. Wir haben ein experimentelles System, das uns direkt auf die Rolle des Sec61-Komplex als potentielle Ca 2 + Leckkanal und zu charakterisieren seine vermeintlichen Regulationsmechanismen 11-13 ermöglicht gegründet. Dieses System kombiniert siRNA-vermittelten Gen-Silencing und Live-Ca 2 +-Imaging-13. Die Zellen werden mit siRNAs gegen die Codierung und untranslatierten Region (UTR), bzw. der SEC61A1 Gen oder eine negative Kontrolle siRNA gerichtet behandelt werden. In Ergänzung der Analyse werden die Zellen mit einem IRES-GFP Vektor, der die siRNA-resistente Ausdruck des Wildtyp-Gen ermöglicht SEC61A1 co-transfiziert. Dann werden die Zellen mit dem ratiometrische Ca 2 +-Indikator Fura-2 beladen, gleichzeitig Veränderungen in der cytosolischen Ca 2 +-Konzentration in einer Reihe von Zellen über ein Fluoreszenz-Mikroskop zu überwachen. Die kontinuierliche Messung der cytosolischen Ca 2 + ermöglicht auch die Evaluierung der Auswirkungen von verschiedenen Mitteln, wie Puromycin, kleines Molekül-Inhibitoren und Thapsigargin auf Ca 2 + Leckage. Dieses experimentelle System gibt uns die einzigartige Gelegenheit, i) Beurteilung des Beitrags der einzelnen ER-Membran-Proteinen auf passive Ca 2 +-Efflux aus dem ER in verschiedenen Zelltypen, ii) charakterisieren die Proteine ​​und Mechanismen, die diese passive Ca 2 +-Efflux zu begrenzen und iii) die Auswirkungen von Erkrankungen im Zusammenhang Mutationen in den entsprechenden Komponenten.

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Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Das endoplasmatische Retikulum spielt eine wichtige Rolle in Protein Biogenese und in Calcium-Homöostase. Wir haben ein experimentelles System, das uns auf die Rolle der Ca2 +-Kanäle Leck-Adresse und ihrer vermeintlichen Regulationsmechanismen charakterisieren lässt etabliert. Dieses System beinhaltet siRNA-vermittelten Gen-Silencing-und Live-Cell-Ca2 +-Imaging.

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

18.0K Aufrufe.  Saarland University. Das endoplasmatische Retikulum spielt eine wichtige Rolle in Protein Biogenese und in Calcium-Homöostase. Wir haben ein experimentelles System, das uns auf die Rolle der Ca2 +-Kanäle Leck-Adresse und ihrer vermeintlichen Regulationsmechanismen charakterisieren lässt etabliert. Dieses System beinhaltet siRNA-vermittelten Gen-Silencing-und Live-Cell-Ca2 +-Imaging.

Serie: Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Forschung

Biologie

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sphingomyelinase und in der Reparatur von Pore Toxin-bildenden Wunden

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects facilitated research in new facets of mosquito biology, including functional genetic studies in the primary African malaria vector Anopheles gambiae and the dengue and yellow fever vector Aedes aegypti. RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing has been used to target genes of interest in both of these disease vector mosquito species. Here, we describe a procedure for preparation of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are combined with food and ingested by larvae. This technically straightforward, high-throughput, and relatively inexpensive methodology, which is compatible with long double stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) molecules, has been used for the successful knockdown of a number of different genes in A. gambiae and A. aegypti larvae. Following larval feedings, knockdown, which is verified through qRT-PCR or in situ hybridization, can persist at least through the late pupal stage. This methodology may be applicable to a wide variety of mosquito and other insect species, including agricultural pests, as well as other non-model organisms. In addition to its utility in the research laboratory, in the future, chitosan, an inexpensive, non-toxic and biodegradable polymer, could potentially be utilized in the field.

Here we describe a procedure for inhibiting gene function in disease vector mosquitoes through the use of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are ingested by larvae.

Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

Monitoring ER / SR Calcium Release mit dem gezielten Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor Catcher<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.