This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.

1. In vitro-Test: Entdecken SERCaMP Mitteilung von einer stabilen SH-SY5Y-Zelllinie <ol><li> Platte SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL (SERCaMP) in Gewebekultur-behandelten Platten mit 150.000 Zellen pro cm 2 Oberfläche. Für Platten mit 96 Vertiefungen, zum Beispiel Saatgut 50.000 Zellen pro Vertiefung (1A). Wachsen SH-SY5Y-Zellen in DMEM (hoher Glukose, GlutaMAX, Pyruvat) + 10% Rinderwachstumsserum + 1x Penicillin / Streptomycin. <ol><li> Passage-Zellen bis zu 15 mal (1B). Höhere Durchlaufhäufigkeit wurde nicht getestet. </li><li> Zurückzukehren Zellen befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5,5% CO 2 und über Nacht inkubieren. </li></ol></li><li> Vor Versuchs Behandlung (en) zu sammeln eine Ausgangsprobe für jede Vertiefung durch Übertragung von 5 ul Kulturüberstand zu einem opaken mauert Platte mit 96 Vertiefungen. Vor dem Sammeln, klopfen Sie die Platte auf allen Seiten und wirbeln Gradienten Effekte zu vermeiden. Verschließen Sie die undurchsichtige Platte mit einem Klebstoff sEaling Blatt und bei 4 ° C bis zur enzymatischen Assay. Anmerkung: Secreted Gluc-SERCaMP ist in Zellkulturmedium sehr stabil. Wir bereits berichtet etwa 5-10% der Gluc-Aktivität wurde nach einer 72-stündigen Inkubation bei 37 ° C (auf SH-SY5Y-Zellen inkubiert) 12 verloren. </li><li> Gönnen Zellen wie gewünscht, um ER Kalziumabbau zu untersuchen (zB Umwelt-, pharmakologische, genetische Manipulationen). Vermeiden Sie lange Aussetzung an Umgebungsbedingungen (außerhalb der Brutapparat) als pH-Änderungen schnell bei atmosphärischem CO 2 entstehen. Hinzufügen HEPES zum Kulturmedium auf 20 mM, pH-Stabilisierung 14, wenn längerer Manipulationen erforderlich sind. Lichteinwirkung zu vermeiden, wenn mit HEPES in Kulturmedium 15. <ol><li> Positive Kontrolle: Behandeln Sie die Zellen mit 100 nM Thapsigargin (Tg) oder 50 uM Cyclopiazonsäure (CPA) für 4-6 Stunden für Experimente in SH-SY5Y-Zellen. Maximale Reaktion in anderen Zelllinien können längere Inkubationen oder verschiedene Konzen erforderlichtrationen von Verbindungen. </li><li> Negative Kontrolle: Collect Kulturmedium aus der Eltern SH-SY5Y-Zellen. Nach unserer Erfahrung ist die Hintergrundlumineszenz für diesen Test weniger als 0,05% der basale Sekretion von stabil SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP Zellen. </li></ol></li><li> Sammeln und speichern 5 ul Proben des konditionierten Medien zu den gewünschten Zeitpunkten, wie in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Beurteilen Sie enzymatischer Aktivität in dem Medium, wie in Abschnitt 5 beschrieben. </li><li> Untersuchen intrazellulärer Gluc durch Immunoblot oder Lumineszenz-Assays. <ol><li> Für Immunoblot: lysieren Zellen in modifiziertem RIPA-Puffer, enthaltend 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% Natriumdesoxycholat, 1 mM EDTA, 1% NP40 und Protease-Inhibitoren. Separate auf SDS-Polyacrylamid-Gel und Transfer zu 0,20 um PVDF-Membran. Dazu werden die Membranen mit Gluc Antikörpers (1: 2000 Verdünnung) über Nacht bei 4 ° C. Führen sekundären Antikörper Inkubation und Membran wäscht nach benutzerdefinierten Protokolls für Nachweisreagenz der Wahl. </li><li> FürLumineszenz-Assays (Abbildung 2): Führen Sie folgende Schritte auf dem Eis: <ol><li> Entfernen Sie das gesamte Medium aus Vertiefungen der Gewebekulturplatte und spülen mit 200 ul kaltem PBS. </li><li> Hinzuzufügen 75 ul Lysepuffer, enthaltend 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40 und Protease-Inhibitoren in jede Vertiefung. </li><li> Drehen der Platte auf einem Orbitalschüttler (120 Upm) bei 4 ° C für 20 min. </li><li> Pipette vorsichtig das Lysat nach oben und unten mit einer Mehrkanalpipette, die Vermeidung von Luftblasen. Bringen Sie 5 ul Lysat zu einer undurchsichtigen Platte und bewerten Lumineszenz, wie in Abschnitt 5 beschrieben. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. In vitro-Test: transiente Transfektion von immortalisierten Zellen mit SERCaMP Hinweis: Wir haben festgestellt, dass die transiente Transfektion Verfahren können zellulären Stress zu induzieren und stumpf die anschließende Gluc-SERCaMP Antwort. Der folgende Ansatz wurde entwickelt, um die Transfektion eff minimieren<html> ECTS in SH-SY5Y-Zellen. Optimierung dieses Verfahrens (einschließlich Auswahl des Transfektionsreagenz) zum alternativen Zelllinien erforderlich. Wenn möglich, ist es empfehlenswert, stabile Zelllinien oder viralen Transduktion Methoden in den Abschnitten 1 und 3 jeweils beschriebenen verwenden. <ol><li> Platte SH-SY5Y-Zellen in einer 100 mm-Schale mit 4 × 10 6 Zellen. Dieses Gericht wird ausreichen, um re-Samen etwa 300 Brunnen (96 Well-Plattenformat) nach der Transfektion Verfahren. </li><li> Transfizierenden Zellen mit Xfect Reagens unter Verwendung von 20 ug Plasmid-DNA (kodiert Gluc-SERCaMP) und 6 ul Xfect Reagenz. Skala DNA und Xfect Reagenz entsprechend für größere oder kleinere Kulturgefäße. </li><li> Zurückzukehren Zellen für 48 Stunden Inkubator. </li><li> Trypsinize Zellen und reseed Platten mit 96 Vertiefungen mit 60.000 Zellen pro Vertiefung. Folgen Sie den nachfolgenden Schritten in Kapitel 1 beschrieben. </li></ol> 3. In vitro-Test: viralen Vektor-vermittelte Expression von Gluc-SERCaMP Zelt &quot;&gt; Hinweis: Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektor Verpackung 16 und Reinigung 12 und Lentivirus Produktions 13 wurde bereits berichtet. <ol><li> Titer Gluc-SERCaMP AAV unter Verwendung der folgenden Primer und Sonden: Vorwärts-Primer, 5&#39;-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 &#39;; Rückwärts-Primer, 5&#39;-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 &#39;; Sonde (5&#39;-6-FAM / 3&#39;-BHQ-1 bezeichnet), 5&#39;-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 &#39;für die quantitative PCR. <ol><li> Vorbereitung der Standardkurve durch Linearisierung eines Plasmids, welches Gluc und Reinigung der DNA unter Verwendung einer Spin-Säule (Macherey-Nagel zB NucleoSpin Gel und PCR-Reinigung). Quantifizierung der DNA durch Trennen an einem Agarosegel zusammen mit einer Masse-Leiter. Vorzubereiten 1.10 Verdünnungen von DNA von 100 pg / ml bis 10 fg / ml in PBS. Berechnung der Kopien / ml Gluc Plasmid-DNA in jeder der Konzentrationen, bezogen auf das Molekulargewicht des Plasmids. </li><li> Verdünnen Sie die AAV-Stamm in PBS (entsprechender Verdünnung wird abhängig sein,Parameter der Viruspräparat und empirisch bestimmt). </li><li> Führen Sie die PCR-Reaktion in einem Echtzeit-PCR-System unter den folgenden Bedingungen: 95 ° C × 5 min, 94 ° C × 20 Sekunden und 60 ° C × 1 min für 41 Zyklen. Berechnen Sie Kopien / ml unter Verwendung der Standardkurve. </li></ol></li><li> Titer Lentivirus mit einer p24 Lenti-X schnellen Titer Kit. Auftauen lentiviralen Aliquots auf Eis und verdünnen das p24-Kontrollprotein in SH-SY5Y Medium. <ol><li> Verdünnen Sie die Lentivirus, so dass es auf die Standardkurve (zB 1: 20.000 oder 1: 100.000) fällt. Die erforderliche Verdünnung Faktor wird auf dem lentiviralen Herstellungsparameter variieren und muss empirisch ermittelt werden. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für alle folgenden Schritte. </li></ol></li><li> Platten Zellen auf 96-Well-Platten. Für SH-SY5Y-Zellen, können Beschichtungsverfahren in Abschnitt 1 dargelegt befolgt werden. Für Ratten primären kortikalen Neuronen, sollten Zellen isoliert und auf entsprechend beschichtete Platten ein ausgesät werdens die zuvor beschriebenen 16. Pflegen Ratte primären kortikalen Neuronen in Neurobasalmedium mit 1x B27 und 500 &amp; mgr; M L-Glutamin. Führen Sie jeden zweiten Tag die Hälfte mittel Börsen. </li><li> Transduktion der Zellen mit Virus. Das Ziel ist es, virale Transduktion Expression auf niedrigem Niveau zu erreichen, wie Gaussia-Luciferase bietet robuste Signal. <ol><li> AAV-Transduktion SH-SY5Y-Zellen: transduzieren am Tag nach Beschichtung. Verdünnter AAV bis 6,0 x 10 &amp; sup7; VG / &amp; mgr; l in AAV-Verdünnungspuffer (PBS + 0,5 mM MgCl 2). In 5 ul verdünnt AAV (3,0 x 10 8 vg; MOI von etwa 6.000) pro Well von 96-Well-Platte (3A). Verwenden Sie 10% Bleichmittel auf viralen Vektor Abfall inaktivieren. </li><li> AAV-Transduktion Ratten primären kortikalen Neuronen: transduzieren 6-8 Tage nach der Plattierung. Verdünnter AAV bis 4,0 x 10 &amp; sup6; VG / &amp; mgr; l in AAV-Verdünnungspuffer. In 5 ul verdünnt AAV (2,0 x 10 7 vg; MOI von etwa 350) pro VertiefungPlatte mit 96 Vertiefungen (3B). Die optimale MOI sollte empirisch für andere Zelltypen bestimmt werden. Verwenden Sie 10% Bleichmittel auf viralen Vektor Abfall inaktivieren. </li><li> Lentivirale Transduktion von SH-SY5Y-Zellen: transduzieren am Tag nach Beschichtung. Verdünnen Sie Lentivirus zu 20 pg / ul p24 in Hanks ausgewogener Salzlösung (mit Titerung Kit Konzentration bestimmt). Add 5 ul der verdünnten Virus pro Vertiefung (100 pg von p24, das entspricht 1.250.000 lentivirale Partikel oder ~ 1.250 IFUs) einer Platte mit 96 Vertiefungen 100 ul Volumen. Skalieren entsprechend für größere Formate. Verwenden Sie 10% Bleichmittel auf virale Abfall inaktivieren. </li></ol></li><li> Sammeln Sie eine Vorbehandlung Probe des Mediums und beginnen experimentelle Behandlungen 48 h (SH-SY5Y) oder 5-7 Tage (rat primären kortikalen Neuronen) nach Transduktion. </li></ol> 4. In Vivo SERCaMP Assay Hinweis: Vor der Durchführung von Tierversuchen irgendwelche Achten Sie auf ordnungsgemäße Genehmigung durch Ihre Einrichtung zu erhalten. AlleÜberleben Operationen sind unter sterilen Bedingungen mit ausreichender Betäubung durchgeführt werden. Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden genehmigt und sind in Übereinstimmung mit NIH ACUC Richtlinien. <ol><li> Autoklaven chirurgische Instrumente vor der Operation zu starten (121 ° C, 30 min Sterilisations, 20 min Trockenzeit). Reinigen Sie alle Instrumente in einem Ultraschallgerät unmittelbar nach allen Verfahren und vor dem Autoklavieren. Pflegen sterilen Bedingungen während des Überlebens der Operation. Für Operationen mehrere Tiere erfordern, wischen chirurgische Instrumente mit 70% Alkohol, ultrasonicate und Perlen sterilisieren zwischen Ratten. Siehe Materialliste für die notwendigen Instrumente. </li><li> Bereiten rat für die Chirurgie. Hier verwenden wir männliche Sprague-Dawley (180-200 g). <ol><li> Betäuben Ratten mit Isofluran Gas für 3 Minuten (4-5% Isofluran bei 1000 cm³ / min zugeführt), gefolgt von intraperitoneale Injektionen von Xylazin (8 mg / kg) und Ketamin (80 mg / kg). Bewerben Augensalbe zur Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen. BEgin Operation, sobald die Ratte ist tief narkotisierten, wie durch das Fehlen von Ziehreflex folgenden Schwanz oder Fuß Prise demonstriert. </li><li> Rasieren Sie die Region des Bauches leicht unter den Rippen (niedrig BWS) auf die Mitte der Bauchregion. Scrub die OP-Bereich dreimal im Wechsel 70% Alkohol und Betadine Scrub. Zeigen Ratte in Rückenlage auf sterilen OP-Bereich mit sterilen OP-Abdeckungen. </li></ol></li><li> Verdünnter AAV-Gluc-SERCaMP bis 7,6 x 10 9 vg / ml (Endkonzentration). Gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens. Anmerkung: Reichweite der Viruskonzentration (Abbildung 4) variieren. <ol><li> Pipette 105 ul verdünnt AAV in eine sterile Schale. Verwenden Sie eine 30-Gauge-Nadel, um das Virus in eine Spritze zu sammeln. </li></ol></li><li> Durchführung von Operationen, die Leber zu entlarven und zu injizieren AAV-Gluc-SERCaMP. <ol><li> Vor dem Vornehmen eines Einschnitts in der Bauchhöhle, gelten 0,25% Bupivacain zu dem Schnittbereich. Mit einem Skalpell einen horizontalen Schnitt unterhalb Brustkorb (apnäherungs 2-3 cm). Stumpf sezieren, um das Bindegewebe aus Unterhaut zu trennen. </li><li> Schneiden Sie Bauchmuskel, Freilegung der rechten medialen Leberlappen. Hinweis: zusätzliche Lappen kann basierend auf End-Anwendung injiziert werden. </li><li> Zeigen Tier unter Operationsmikroskop und passen Sie nach rechts medialen Leberlappen in das Blickfeld zu bekommen. Spritzen Sie Virus in Parenchym der medialen Lappen; 3 separate Websites, etwa 33 &amp; mgr; l pro Standort. Hinweis: Lassen Sie Nadel im Gewebe für 5-10 sec nach der Injektion bis zur Lieferung des gesamten Einspritzvolumen zu gewährleisten. </li><li> Naht der Bauchmuskeln und die Haut getrennt und fügen Neosporin mit Wattestäbchen. Zeigen Ratte in einem Wiedergewinnungskammer, bis das Bewusstsein wiedererlangt und Ratten in der Lage, aufrecht zu erhalten. Lassen Ratten (n) nicht unbeaufsichtigt, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Haus einzeln, bis der Einschnitt verheilt und Nahtmaterialien entfernt worden sind (7-14 Tage). <br/&gt; Anmerkung: Wie pro NIH postoperativen Richtlinien halten chirurgische Rekord. Anmerken Käfigkarte mit Verfahren, Datum, Experiment Kennung, Körpergewicht und Tag der Operation. Schmerz / Not, Kot Produktion, Aktivität und Futter- und Wasseraufnahme sind überwacht und aufgezeichnet 3 Tage post-OP werden. Postoperative Analgesie wird durch Zugabe von Paracetamol auf die Trinkwasser (450 mg / 100 ml) zur Verfügung gestellt, obwohl wir in der Regel nicht zu beobachten Anzeichen von Schmerzen oder Leiden nach der Operation. </li></ol></li><li> Beginnen Schwanz Blutentnahme 4-7 Tage nach der Injektion. Bereiten Blutentnahmeröhrchen Etiketten und pre-Wiegen. Zugabe von 50 &amp; mgr; l Heparin (1000 U / ml) zu jedem Röhrchen. </li><li> Platz Ratte in Isofluran-Narkose Kammer 3 min (4-5% Isofluran bei 1.000 cm³ / min geliefert). Entfernen Ratte aus der Kammer und in Nasenkegel (2-3% Isofluran bei 500 cm³ / min geliefert). Blutentnahme kann beginnen, sobald die Ratte ist tief anästhesiert, wie durch das Fehlen von Ziehreflex folgenden Schwanz pi nachgewiesennch. <ol><li> Mit einer sterilen Schere Rutenspitze (1-2 mm) und sammeln Bluttropfenweise in vorgefüllten Heparin Röhrchen. Blutentnahme bis zum Volumen von mehr als 2 erreicht: 1 Blut in Heparin-Verhältnis (&gt; 100 &amp; mgr; l Blut / 50 ul Heparin). Blutabnahmemengen können basierend auf experimentellen Design angepasst werden. Verwenden Sie einen feuchten Watte zur blutstillende Pulver an den Schwanz gelten die Blutung zu stoppen. </li><li> Speicher Blutröhrchen bei 4 ° C, wenn das Sammeln nachfolgende Proben. Wischen Schere mit Ethanol-Pad und Perlen sterilisieren zwischen Sammlungen. </li><li> Wiegen Sammelröhrchen und stellen Sie mit Heparin, um 2: 1-Verhältnis (Blut: Heparin). Dieser Schritt wird die Menge von Heparin in jeder Probe (Tabelle 1) zu normalisieren. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 2.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Den Überstand (Plasma) in ein frisches Röhrchen und bei -80 ° C bis zum Zeitpunkt der Luciferase-Assay (Abschnitt 5). Anmerkung: Lagerung von Proben bei 4 ° C bis zu 72 Stunden vor der enzymatischen Assay weist minimal Wirkung auf Lumineszenz (5A). Bis zu 3 Gefrier-Tau-Zyklen von Plasmaproben keine Wirkung auf die Lumineszenz (5B). </li></ol></li><li> Thapsigargin Verwaltung (Positivkontrolle): <ol><li> Vorbereitung Thapsigargin durch Verdünnung in Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 2,5 mg / ml. Injizieren Thapsigargin bei 1 mg / kg ip in den Unterleib. Hinweis: Thapsigargin erhöht Thrombin-induzierte Blutplättchengerinnungs 17 und kann die Blutentnahme aus Schwanz erschweren. </li></ol></li><li> Gaussia-Luciferase-Assay: <ol><li> Tauen die Plasmaproben auf Eis. Hinweis: Für die Längsschnittstudien, Tauwetter und führen Lumineszenz-Assay für alle Zeitpunkt Proben am selben Tag (mit Einzel Herstellung von Substrat). </li><li> Transfer 10 ul Plasma zu einem opaken Wandplatte und messen Enzymaktivität, wie in Abschnitt 5. Führen Sie 3-4 technischen Wiederholungen jeder Plasmaprobe beschrieben. </li></ol></li><li> Euthanasiein Anmerkung: Der Vorteil SERCaMP Technologie ist die Fähigkeit zur Überwachung ER Calcium longitudinal. Je nach Versuchsparameter und Endpoint-Analysen, sind Tiere, die von Maßnahmen zur Endpunktanalysen angebracht und im Einklang mit den institutionellen ACUC Richtlinien eingeschläfert werden. </li></ol> 5. Lumineszenzassay <ol><li> Vorbereitung Coelenterazin (CTZ) Stammlösungen durch Verdünnen der Verbindung in angesäuertem Methanol (30 ul 10 N HCl auf 3 ml Methanol), 20 mM. Bereiten Sie den einmaligen Gebrauch und Aliquots bei -80 ° C. </li><li> Herstellung der Arbeits Substrat am Tag des Assays. <ol><li> Für in-vitro-Tests, zu verdünnen Coelenterazin bis 8 um in PBS, zB fügen 10 ul 20 mM CTZ Lager zu 25 ml PBS (6A, B). </li><li> Zur in vivo-Assays, verdünnter Coelenterazin bis 100 &amp; mgr; M in PBS, 500 mM Ascorbinsäure, 5 mM NaCl. </li></ol></li><li> Inkubieren bereit CTZ für mindestens 30 minbei Raumtemperatur vor dem Test. Anmerkung: Dieser Schritt wird häufig in Gaussia-Luciferase-Assays enthalten, da es Berichte über raschen Zerfall Substrat während ersten 30 min nach der Herstellung. Wir haben diesen Effekt nicht in unserem System (6C) beobachtet; jedoch sind wir oft die Inkubationsschritt, da haben wir keine negativen Auswirkungen auf den Test gefunden. </li><li> Verwenden Sie ein Plattenlesegerät, das in der Lage Überwachung Biolumineszenz und mit einem Substrat Injektor ausgestattet ist. Prime die Linien mit dem Substrat. Hinweis: Das Ausgangssubstrat durch die Leitungen können anfällig für Abbau sein. Künstlich niedrige Werte für die frühe Proben zu vermeiden, zu injizieren 20-30 leere Brunnen (Laden eines leeren Teller auf dem Lesegerät) vor der Messung experimentellen Proben. </li><li> Injizieren Sie 100 ul Substrat in gut schütteln mittlerer Geschwindigkeit für 5 Sekunden, und messen die Lichtemission. Für die Biotek Synergy II-Plattenlesegerät, integriert Lichtemission über 0,5 s (in vitro Proben) und 5 sec (invivo Proben) für den Leseschritt. Optimierungs-Plattenleseparameter für optimale Testleistung. Hinweis: Gaussia-Luciferase Exponate Flash-Kinetik mit schneller Signalabfall (im Vergleich zu mit anderen Luciferasen beobachteten Kinetik leuchten). Die Flash-Kinetik Gluc durch Serum in Zellkulturmedium (7A) beeinflusst, Hervorhebung der Bedeutung der Kontrolle für den Mittelzusammensetzung in Proben. Aufgrund des schnellen Zerfalls der Lumineszenz nach Zugabe von Substrat (Flash-Kinetik), der Zeit zwischen spritzen und lesen müssen bei allen Proben gleichförmig sein. Das Plattenlesegerät sollte so eingestellt sein Substrat auf eine gut zu injizieren, warten Sie eine feste Zeit (zum Beispiel verwenden wir eine 5 sec schütteln Schritt), und lesen, dass auch. Hinzufügen Substrat auf eine gesamte Platte, bevor Lesung stellt eine erhebliche Herausforderung, wenn Substrat in alle Vertiefungen gleichzeitig zugegeben werden. Wenn ein Einspritzer nicht verfügbar ist, kann das Problem teilweise durch Inkubation der Platte für 10 Minuten zwischen Substrat ADDI umgangention und Messung (wodurch die steilen Teil der Zerfallskurve) (7B). </li><li> Wiederholen Sie die Injektion, die Wartezeit, und lesen Sie Schritte für jede Vertiefung auf der Platte. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).</li><li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers.">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li><li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats.">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li><li>Hareendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+gene+therapy:+immune+challenges+and+strategies+to+circumvent+them.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.</a> Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll hebt die in vitro und in vivo Nützlichkeit Gluc-SERCaMP Erschöpfung der ER Calcium zu überwachen. Obwohl die Proteinmodifikation, um SERCaMP erzeugen scheint auf andere Reporter-Proteine ​​12 verallgemeinern, wählten wir Gaussia-Luciferase für seine robusten (200-1000-fach größer) Biolumineszenz im Vergleich zu anderen Luciferasen 18. Wir zeigen, nachweisbar Thapsigargin-induzierte Gluc-SERCaMP Mitteilung über einen 100-fachen Dosisbereich von Gluc-SER...

Das endoplasmatische Retikulum (ER) Funktionen in vielen Zellkapazitäten einschließlich Proteinfaltung, Proteinsekretion Lipidhomöostase und intrazelluläre Signal 1. Von zentraler Bedeutung für normale ER-Funktion wird beibehalten Lumencalciumkonzentrationen bei ~ 5.000 Mal jene im Zytoplasma 2-4 gefunden. Dieser energieintensive Prozess wird durch die sarco / endoplasmatischen Reticulum Calcium ATPase (SERCA), eine Pumpe, die Calcium-Ionen in das ER bewegt geregelt. Efflux von Kalzium aus dem ER wird hauptsächlich durch den Ryanodin (RyR) und Inositol-Triphosphat (IP3R) -Rezeptoren vermittelt werden. Da viele ER Prozesse sind abhängig von Kalzium, kann stören den Speicher, um ER Stress und schließlich zum Zelltod führen. ER Calcium Dysregulation in Krankheiten wie Kardiomyopathie, Diabetes, Alzheimer beobachtet und Parkinson-5. Infolge der Progressivität dieser Krankheiten wurde schwierig, die Ursache-Wirkungs-Wieder abgrenzenhung zwischen Pathogenese und Veränderungen in der ER Kalziumspeicher. Eine Anzahl von Technologien für signifikante Fortschritte im Verständnis der ER Calciumdynamik, einschließlich Farbstoffe und genetisch kodierte Calciumindikatoren (GeCIS) erlaubt. Geringe Affinität Calcium-Farbstoffe, die in der Fluoreszenz zu erhöhen, wenn Ca 2+ gebunden ist, kann in die Zellen geladen werden, um subzellulären Kompartimenten mit hohen Konzentrationen an Calcium 6 zu untersuchen. GeCIS wie D1ER und Catcher ermöglichen Überwachung Calciumschwankungen genauere Steuerung der subzellulären Lokalisation 7-9. Vor kurzem hat eine weitere Klasse von GeCIS sogenannter Kalziummess Organell eingeschlossenen Proteinindikatoren (CEPIA) beschrieben worden sind 10. Ein dritter Ansatz, der Genetik und der Chemie kleiner Moleküle ist gezielte Esterase-Farbstoffbeladung (TED), die eine genetisch kodierte Carboxylesterase (zum ER gezielte) mit einem Ester-basierten Calcium Farbstoff 11 verwendet. Während der AFORementioned Ansätze haben inhärenten Stärken und Schwächen, können sie wertvolle Einblicke in ER Kalziumdynamik durch akute Fluoreszenzmessungen bereitzustellen. Sie sind jedoch für die Langzeitstudien oft erforderlich, um den Krankheitsverlauf zu untersuchen nicht optimal. Mit dem Ziel der Entwicklung einer Methode zur Calciumdynamik über längere Zeiträume hinweg zu beobachten, wurde identifiziert und entwickelt eine Proteinmodifikation, die sezerniert ER Calcium Überwachung Proteine ​​(SERCaMPs) 12 zu schaffen. SERCaMP umgeht einige Einschränkungen mit anderen Methoden verbunden sind, durch die Bereitstellung einer minimal-invasiven Ansatz, um wiederholt zu verhören die ER Kalziumspeicher. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Carboxy-terminalen Peptids ASARTDL (Alanin-Serin-Alanin-Arginin-Threonin-Asparaginsäure-Leucin) ausreicht, um ER-Retentions fördern; jedoch unter Bedingungen, die Abnahme der ER Calcium verursachen kann, ist die Peptidsequenz nicht mehr ER localizatio behaltenn und das Protein sekretiert 13. Die Basis der SERCaMP Technologie ist das Anhängsel ASARTDL zum Carboxy-Terminus eines sezernierten Proteins (zB Gaussia-Luciferase oder Gluc), so dass die Sekretion von ER Calciumverarmung ausgelöst, wodurch eine robuste Reporter ER Calcium Dysregulation 12. Die Expression von Gluc-SERCaMP über transgene Methoden können biologische Flüssigkeiten wie Zellkulturmedium und Plasma, um Änderungen der Gluc-Aktivität als Indikator für die ER Calciumhomöostase analysiert werden. Das Verfahren findet Anwendung für die Langzeitstudie über progressive Veränderungen in der ER Calciumspeicher sowohl in vitro als auch in vivo. Das folgende Protokoll wird als eine allgemeine Übersicht zur Verwendung von Gluc-basierte SERCaMP zu ER Calciumhomöostase studieren geschrieben, aber das Protokoll kann als Leitfaden für alternative Reporter SERCaMPs dienen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>02-682-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% NP-40 solution&#160;</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28324</td>
			<td>for intracellular GLuc assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL luer-lok syringes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200uL filter tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>RT-L200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 surgical sutures</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9598192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-821-13A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microplate sealing sheets</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>AB-0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-246-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Auto Flow System</td>
			<td>E-Z Anesthesia</td>
			<td>EZ-AF9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal recovery chamber</td>
			<td>Lyon Vet</td>
			<td>ICU-912-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9386574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine growth serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30541.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine, Native</td>
			<td>Regis Technologies</td>
			<td>1-361204-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting needles 3/8 circle sutures</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital ultrasconic cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS60D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA mass ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10496-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaussia luciferase (recombinant protein)</td>
			<td>Nanolight</td>
			<td>321-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8023S</td>
			<td>1:2000 (WB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500</td>
			<td>CellPoint Scientific</td>
			<td>DS-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluc assay plates (96 well, opaque)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Allmedtech</td>
			<td>63323-276-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>995-2949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Stop Styptic powder</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>5867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>a452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R Centrifuge</td>
			<td>Bekman Colter</td>
			<td>368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neosporin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-898-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin Gel and PCR Cleanup</td>
			<td>Machery-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipet</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L-200XLS+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 Lenti-X rapid titer kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR film seal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReFresh Charcoal Filter canister</td>
			<td>E-Z Anesthesia</td>
			<td>EZ-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades, #10</td>
			<td>Fine Science tools Inc</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD rats 150-200g</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Rats</td>
			<td>rats ordered at 150-200g.&#160; Surgery 5 days after arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal ear tags</td>
			<td>National Band and Tag co</td>
			<td>1005-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drapes</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SP-MPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9033</td>
			<td>harmful to human health</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virapower lentiviral packaging mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4975-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect Transfection reagent</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Valley Vet</td>
			<td>468RX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring endoplasmic reticulum calcium homeostasis using a gaussia luciferase sercamp

Das endoplasmatische Retikulum (ER) enthält, die höchste Stufe von intrazellulärem Calcium, wobei Konzentrationen etwa 5000-fach größer als cytoplasmatische Ebenen. Strenge Kontrolle über ER Calcium ist zwingend notwendig für die Proteinfaltung, Änderung und Menschenhandel. Perturbationen ER Calcium kann in der Aktivierung des ungefalteten Protein-Reaktion, einer dreipoligen ER Stressantwort Mechanismus führen und tragen zur Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen. Die Fähigkeit, ER Kalzium Veränderungen während der Krankheit Beginn und Fortschreiten zu überwachen ist wichtig, im Prinzip, dennoch schwierig in der Praxis. Derzeit verfügbare Verfahren zur Überwachung von ER Calcium, wie Calcium-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe und Proteine, Einsicht in ER Calciumdynamik in Zellen bereitgestellt, aber diese Werkzeuge sind nicht für in-vivo-Studien geeignet. Unserem Labor haben gezeigt, dass eine Modifikation des Carboxyterminus von Gaussia-Luciferase vermittelt die Sekretion des Reporters in Reaktion aufER Kalzium Erschöpfung. Die Verfahren zur Verwendung einer Luciferase beruht, sezerniert ER Calciumüberwachungsprotein (SERCaMP) zum in vitro und in vivo-Anwendungen werden hier beschrieben. Dieses Video zeigt Leber Injektionen, pharmakologische Manipulation von Gluc-SERCaMP, Blutentnahme und Verarbeitung, und Assay-Parameter für Längs Überwachung der ER Kalzium.

Die Gluc-SERCaMP Methode ermöglicht die Beurteilung ER Calcium-Homöostase durch Abtasten extrazellulären Flüssigkeiten. Mehrere Steuerungen können in der Versuchsplanung einbezogen werden, um die Interpretation der Ergebnisse zu verbessern. Erstens kann die Verwendung eines konstitutiv sezerniertes Reporter (zB Gluc ohne die C-terminale ASARTDL oder &quot;Gluc-No tag&quot;) eingesetzt werden, um die Auswirkungen der experimentellen Behandlungen auf den sekretorischen Weg (global zellulären Sekretion) und ...

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Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

13.0K Aufrufe.  National Institutes of Health. Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Serie: Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Forschung

Biologie

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Transfizieren RAW264.7-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...