Diese Arbeit wurde durch Mittel aus der kanadischen Institutes of Health Research [MOP-1112666 zu CVB &amp; ME] unterstützt.

Ethik-Anweisung: Alle Experimente und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Laboratory Biosafety-Richtlinien von der University of British Columbia, Vancouver, Kanada durchgeführt. 1. Herstellung von 35 mm Glasbodenkulturschalen für FRET-basierte konfokale Mikroskopie <ol><li> Bereiten Sie Platten mit dem folgenden Verfahren 36-48 Stunden vor den Experimenten. </li><li> Abrufen gewählt gallertartig Proteinmischung und 0,25% Trypsin-EDTA von -20 ° C Lagerung und halten sie in mobilen Eisbad bis zur Verwendung. HINWEIS: Die Beschichtungsproteinmischung sollte nur für einen kurzen Zeitraum auf RT ausgesetzt werden, um die Mischung zu verhindern, vor der Verwendung Verfestigen. Trypsin-Lösung sollte auch halten gekühlt werden, bis sie benötigt werden; alternativ kann Trypsin von -20 ° C Lagerung nach Beendigung von Schritt 1.5 abgerufen werden. </li><li> Bereiten Sie eine Verdünnung von 01.25 Proteinmischung: DMEM (ohne Zusatz von Serum, gekühlt). Übertragen geeigneten Volumen Proteinmischung / DMEM auf jede Platte vorbereitet. Für 35 mm Glasbodenplatten, fügen Sie etwa 200 ul voll Kreis inneren Glas auf der Unterseite der Platte abzudecken. </li><li> Lassen Platten für mindestens 30 min in der Sicherheitswerkbank und bei RT zu sitzen. Warmen DMEM mit 10% NCS bis 37 ° C in einem Wasserbad während dieser Zeitperiode. </li><li> Warm Trypsin in Wasserbad auf 37 ° C unmittelbar vor der nächsten Schritte. </li><li> Entfernen DMEM, die derzeit in Kulturkolben mit einer Glaspipette und abgesaugt werden. Waschboden des Kolbens mit warmem sterilem PBS verbleibenden DMEM Rückstände zu entfernen. </li><li> Vertreiben zuvor kultivierten glatten Muskelzellen aus Flaschenboden: HINWEIS: Flasche wurde festgestellt Tage zu diesem Schritt Zellen zu ermöglichen Vorbereitung zu erreichen gewünschten Konfluenz (ca. 80%) vor Platte. Die Zellen wurden in dem Kolben in 20 ml DMEM mit 10% NCS und inkubiert bei 37 ° C mit 5% CO 2 -Zufuhr 24 h ursprünglich suspendiert, wonach DMEM Versorgungs aktualisiert wurde , und die Zellen zurückgegeben wurden Inkubator. DMEM wurde aktualisiert Vorabendry 48 Stunden nach diesen ersten Schritten, bis die Zellen Konfluenz erreichten. <ol><li> Waschflasche schnell mit 1 ml Trypsin und dann 1 ml Trypsin entfernen Saugwirkung verwendet wird. </li><li> Fügen Sie in weiteren 1 ml Trypsin und lassen für längere Zeit (ca. 30-60 sec), Kolben swishing das Enzym in Kontakt mit dem gesamten Boden des Kolbens zu gewährleisten. </li><li> Beobachten Sie, wie viel Zellen unter einem Mikroskop abgelöst, bis sie mit der Trennung von Kolben zufrieden. Alternative Rascheln Trypsin-Lösung und die Kontrolle Zellablösung, bis zufrieden mit Anteil von Zellen aus Kolben getrennt. HINWEIS: Der Kolben kann für etwa 30-60 Sekunden in den Inkubator zurückgegeben werden, diesen Prozess zu beschleunigen, bei 37 ° C. </li><li> Sobald Zellen unter Verwendung von Trypsin abgelöst wurden, fügen Sie frisches DMEM mit 10% NCS in den Kolben die Trypsin Reaktion zu stoppen (ausreichendes Volumen , so dass Trypsin 1/8 des Gesamtvolumens in Kolben bildet). HINWEIS: Wenn beispielsweise ein 250-ml-Kulturkolben verwendet, würde dieswerden 7 ml DMEM auf die 1 ml Trypsin in 8 ml Zelllösung zu ergeben zugegeben. </li></ol></li><li> Transfer resultierende Zell Lösung aus dem Kolben zu einem sauberen (labeled) 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> 1 ml frischem DMEM plus 10% NCS auf jeder Platte vorbereitet (ausreichend Medium 24 Stunden dauern). </li><li> Vorsichtig umdrehen jedes Pellet mehrere Male Zelllösung zu brechen Röhre enthält, die sich gebildet haben können. </li><li> Pipette Volumen sanft gemischten Zelllösung in jede Platte gewünscht. HINWEIS: Die empfohlene SMCs Nummer für dieses Protokoll überzogen ist 0,5-0,8 x 10 6 pro 35 mm Kulturschalen. Diese Zahlen können variieren vom Zelltyp abhängig und sollten von jedem Labor getestet und modifiziert werden. </li><li> Schwenken Sie die Platte gründlich rechts / links gleichmäßige Verteilung der Zellen über Glasboden zu gewährleisten. </li></ol> 2. Transiente Transfektion mit adenoviraler Vektor , der D1SR Ca 2+ Indicator <ol><li> Nach der Zugabe von mirdium und Zelllösung zu jeder Platte, lassen Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2 Versorgung für mindestens 1 Stunde inkubieren Zellen zu ermöglichen richtig Glas auf der Unterseite der Teller zu befestigen. Überprüfen Platten unter einem Mikroskop bei 15-Minuten-Intervallen, bis die Zellen gut befestigt sind. </li><li> Abrufen Adenovirus-D1SR aliquoten von -80 ° C Lagerung und halten in der mobilen Eisbad auf biologischen Sicherheitsschrank zu transportieren. </li><li> Pipette gewünschte Dosis (Multiplizität der Infektion von 100) von gekühlter D1SR zu jeder Platte. HINWEIS: Die Berechnung für das Volumen der adenoviralen Lösung pro Platte erforderlich ist, hängt von der Virustiter in der ursprünglichen Vorratslösung, die als plaquebildenden Einheit (PFU) dargestellt wird. Basierend auf unserer Erfahrung empfehlen wir eine Vielzahl der Infektion (MOI) von 100, die als die Anzahl oder Viruspartikel interpretiert wird benötigt, um eine glatte Muskelzelle (SMC) in der Kulturplatte zu infizieren. </li><li> Inkubieren der infizierten Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 -Zufuhr O / N. </li><li> Am nächsten Tag wieder aufzufüllen Zellen mit 1 ml frischem DMEM plus 10% NCS. </li><li> Inkubieren Platten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C in 5% CO 2 O / N. </li></ol> 3. Messung der SR Luminal Ca 2+ Mit FRET-basierten konfokale Imaging <ol><li> O / N Inkubation Nach Entfernen des Kulturmediums von der Platte. </li><li> Waschen der Kulturplatte mit 1 ml warmen physiologischen HEPES-PSS - Puffer , enthaltend (in mmol·L - 1) NaCl 140, Glucose 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl 2 1,5 und MgCl 2 1 (pH 7,4) dreimal. </li><li> 1 ml frisches, warmes HEPES-PSS Puffer unmittelbar vor dem Beginn der Aufzeichnung. </li><li> Mit den ersten Bildgebung der FRET SE (sensibilisierten Emission) Anwendung (oder eine ähnliche Funktion) auf der konfokalen Mikroskops zugehörigen Software. <ol><li> Sobald Anwendung geöffnet ist, klicken Sie in das Register &quot;Einstellungen&quot; Einstellungen anpassen gewünschten experimentellen Bedingungen zu erreichen. </li> &lt;li&gt; Manuelle Kanaleinstellungen ändern, so dass die Zellen in der Folge bei 440 nm (für den Spender und FRET-Kanäle) angeregt werden und 513 nm (für den Akzeptor-Kanal). Sammeln Sie die Emissionswellenlängen bei 488 nm (für Spender) und 535 nm (für FRET und Akzeptor). </li><li> Eingestellt, die Intensität von Licht bei 15% Transmission bei 150 ms Anregungsbelichtungszeit von Zellen (Aufzeichnungszeit für drei sequentiellen GFP-Donor, FRET und YFP-Akzeptor-Kanäle) und 10 sec Intervallen zwischen den Belichtungen. </li></ol></li><li> Stabilisiert Platte auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Live&quot; Taste Bildauflösung zu überprüfen. Tweak-Einstellungen weiter, bis die gewünschte Auflösung erreicht ist. </li><li> Noch unter der Registerkarte &quot;Setup&quot;, um ein Bild der Probe nehmen Sie die &quot;Bild aufnehmen&quot; Taste. </li><li> Bewegen Sie sich auf die &quot;Auswertung&quot; Registerkarte, wählen Sie die entsprechende Methode die FRET-Effizienzen für die Experimente zur Berechnung getan. Methode 3, mit der Ratiometrisch Berechnung [E A (i) = B / A] Wird für Experimente empfohlen Chamäleons wie die D1SR Indikator beteiligt sind. </li><li> Umschalten auf den &quot;Graph&quot; Registerkarte können die Intensitätswerte aufgezeichnet in graphischer Form während des Experiments zu beobachten. </li><li> Zeichnen Sie einen ROI im Bildbetrachter die entsprechende mittlere Intensität dieser Bereich von Interesse in der Grafik als Experiment weiter zu beobachten. HINWEIS: Ermittler können auch wählen, mehrere ROIs zu ziehen und haben Intensitäten aufgezeichnet werden entsprechend und gleichzeitig auf dem Graphen angezeigt. Alternativ können die Ermittler einen einzelnen ROI für die erste Aufnahme umreißen, und fahren Sie durch das Öffnen des Experiments auf einer Datenanalyse orientierte Version der Software mehrere ROIs zu einem späteren Zeitpunkt zu skizzieren. HINWEIS: Weitere Einzelheiten über die Schritte, die erforderlich FRET-Experimente zur Einrichtung kann in FRET Anwendungs-Assistent-Handbüchern. Wenn das Mikroskop nicht mit dem FRET-Assistenten, das folgende Protokoll ausgestattet ist, verwendet werden, um die Parameter ein fürAufnahme manuell. </li><li> Starten Sie die Aufnahme und die Datenerfassung ermöglichen mindestens 3 min eine stetige basalen Aufzeichnung des Signals auf die Einführung des Mittels von Interesse vor zu gewährleisten. </li><li> Einführung Ca 2+ -moving Mittel (zB 2 uM Thapsigargin; 100 nm Endothelin-1) als Werkzeug zur Abreicherung SR Ca 2+, indem Sie manuell die vorbestimmte Dosis Pipettieren direkt in die Platte an einer Stelle , als in der Nähe der Region von Interesse sind wie möglich erfasst. Weiter für eine gewünschte Zeit nach der Behandlung der Aufnahme. </li><li> Capture-ratiometrisches FRET serielle Bilder (512 x 512 Pixel) mit einem 63X Ölimmersionsobjektiv des konfokalen inverses Mikroskop die FRET SE Anwendung. </li><li> Sammeln Sie Daten aus Bildgebung aus einem Cluster von 5-10 SMCs in jeder Region von Interesse (ROI) und anschließend formatieren und zu analysieren Statistiken basierte Software. <ol><li> Um Daten für eine spätere Verwendung zu speichern, Rechtsklick auf die aufgezeichneten Spur über und wählen Sie die Option &quot;Export&quot; zu Save die Tabelle mit aufgezeichneten mittleren Signalintensitäten auf dem gewählten Laufwerk des Forschers. </li><li> Normalisieren von Daten von jedem einzelnen Experiment, indem jeder Datenpunkt durch die Startintensitätswert dividiert zum Zeitpunkt 0 sec beobachtet. </li><li> Import normalisierte Daten aus Kalkulationstabellen in einem Statistikprogramm Projektdatei durch manuelles Kopieren und Einfügen relevanten Datenzeilen aus ihrem ursprünglichen Tabellen / sec. </li><li> Automatische Graphen erzeugen, um den Datensätzen entsprechen, in das Programm eingefügt. Hinweis: Die Standardprogrammeinstellungen erzeugen Liniendiagramme aus importierten Daten. Diagrammtyp angezeigt wird, kann durch Klicken auf den &quot;Wählen Sie eine andere Art von Graph&quot; Taste unter dem &quot;Change&quot; geändert werden, in der Hauptwerkzeugleiste Position. </li><li> Pool Daten mehrere unabhängige Studien innerhalb einer größeren Gruppe von identischen Experimenten in einem einzigen Datenblatt repräsentieren eine durchschnittliche Spur für den spezifischen Test durchgeführt, zu erzeugen. </li></ol></li></ol&gt; 4. Vorbereitung der cytoplasmatischen Ca 2+ Indicator <ol><li> Man löst 0,0125 g Pluronic Säure (PA) in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer schwarzen Mikrozentrifugenröhrchen (kann das Rohr in mobilen Wasserbad erwärmen PA zu helfen aufzulösen). </li><li> Abrufen einer Röhre (50 ug) des cytoplasmatischen Ca 2+ Indikatorfarbstoffs (Fluo-4 AM) von -20 ° C der Lagerung. </li><li> Wickeln Sie das Rohr an Farbstoff in der Folie, um es zu schützen, so viel wie möglich von dem Kontakt mit Licht. </li><li> Pipette 45 ul der DMSO + PA-Lösung in das Rohr, den Farbstoff enthält. Wickeln DMSO + PA-Lösung in Folie und lagern bei RT. </li><li> Mischungs Inhalt des Röhrchens gründlich durch Lösungspolymerisation bis Pipettieren und unten mehrere Male. Alternativ beschallen für 10 min die Färbehülse. HINWEIS: Jede Methode gründlich den Farbstoff in der gesamten DMSO + PA-Lösung verteilt wird ausreichen, um; es ist einfach eine Frage der Präferenz des Prüfers. Wenn Ermittler Lösung zu beschallen wählt es,sollte in einem isolierten Bereich / Raum durchgeführt werden, wo andere werden durch den Lärm nicht betroffen. Forscher sollten auch schwere Schalldämpfer benutzen Ohren zu schützen. <ol><li> Wenn Lösung Beschallen, legen Folienwickelrohr der Farbstoff in einem Schaumrohrhalter und Platz im Inneren des 2/3 voll (mit dH 2 O) Ultraschallbad enthält. </li><li> Platz Ultraschallbad in isolierten Bereich / Raum und Energie Maschine (Kopfschutz gewährleisten ist an Ort und Stelle vor dem Beschallen Prozess initiieren). Lassen Sie Platz und lassen Sie Maschine für 10 Minuten laufen, bevor sie ab und das Abrufen der Röhre herunter (halten in Folie verpackt vor Licht zu schützen, so lange wie möglich). </li></ol></li><li> Aliquot der jetzt gründlich gemischte Lösung in dunklen Mikrozentrifugenröhrchen (5 ul pro Röhrchen, sollte in der Lage sein, 10 Röhren insgesamt zu machen). </li><li> Wickeln Sie jeden aliquoten Rohr in Folie. Beschriften Sie die Röhrchen und lagern in Trocken bei -20 ° C Bedingungen bis zur Verwendung. </li></ol> 5. Messung der cytoplasmatischen Ca 2+ <ol><li> Führen Sie die Schritte in 1,1-1,12 auf Kulturplatten von Rattenaorta SMCs vorzubereiten. </li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium von der Platte bei 48 Stunden nach der Kultur. </li><li> Entfernen der zuvor hergestellten Aliquot von cytoplasmatischen Ca 2+ Anzeige (5 ul) von -20 ° C Lagerung und Aufrechterhaltung in mobilen Eisbad bis zur Verwendung. </li><li> Waschen der Kulturplatte mit 1 ml warmen physiologischen HEPES-PSS - Puffer , enthaltend (in mmol·L - 1) NaCl 140, Glucose 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl 2 1,5 und MgCl 2 1 (pH 7,4) dreimal. </li><li> Mischen Sie die Anzeige mit 1 ml warmem HEPES-PSS und laden Sie es auf die Kulturplatte. </li><li> Inkubieren SMCs mit dem Indikator für 1 h bei RT (24 ° C). </li><li> Entfernen Sie Anzeige von Kulturplatte und wasche mit 1 ml warmer physiologischer HEPES-PSS-Puffer dreimal. </li><li> 1 ml frisches, warmes HEPES-PSS Puffer unmittelbar vor dem Beginn der Aufzeichnung. </li><li> Erfassen Sie serielle Bilder (512 x 512 Pixel) mit einem 63X oil-Tauchziel des konfokalen inversen Mikroskop. <ol><li> Manuelle Einstellungen zu ändern, so dass die Zellen bei 488 nm angeregt, und die Emissionswellenlängen bei 555 nm mit einer Abtastgeschwindigkeit von 700 Hz gesammelt. </li><li> Eingestellt, die Intensität von Licht bei 15% Transmission bei 150 msec Anregungsbelichtungszeit von Zellen (die Zeit, die die Zellen gegenüber Licht zu bestimmten Zeitintervallen während der Aufzeichnung ausgesetzt sind) und 5 sec Intervallen zwischen den Belichtungen. </li></ol></li><li> Stabilisiert Platte auf dem Mikroskoptisch und starten Sie die Aufnahme. </li><li> Nehmen Sie für mindestens 3 min eine stetige basalen Aufzeichnung des Signals vor der Einführung des Mittels von Interesse zu gewährleisten. </li><li> Einführung Ca 2+ -moving Mittel (zB 2 uM Thapsigargin) als Werkzeug zur Abreicherung SR Ca 2+ (wie in Schritt 3.16 beschrieben) und weiterhin für die gewünschte Menge an Zeit , nach der Behandlung der Aufnahme. </li><li> Nehmen Sie die Signalintensität mit Mikroskop spezifische Software durch Fluoreszenz si durchschnittlichgnale (F / F 0) aus einem Cluster von 5-10 SMCs in jeder Region von Interesse (ROI). Sammeln, das Format und analysieren Daten aus Bilddaten-Analyse-Software. Siehe Schritte 3.18.1-3.18.5 für die Beschreibung der Datenerhebung und Analyse dieser Software. </li></ol>

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	<li>Hennings, H., Michael, D., Cheng, C., Steinert, P., Holbrook, K., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture.">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li><li>Whitfield, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+calcium+and+cyclic+AMP+in+cell+proliferation.">The roles of calcium and cyclic AMP in cell proliferation.</a> Ann N Y Acad Sci. 339 (1), 216-240 (1980).</li><li>Nicotera, P., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcium+in+apoptosis.">The role of calcium in apoptosis.</a> Cell Calcium. 23 (2-3), 173-180 (1998).</li><li>Wei, C., Wang, X., Chen, M., Ouyang, K., Song, L. S., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+flickers+steer+cell+migration.">Calcium flickers steer cell migration.</a> Nature. 457 (7231), 901-905 (2009).</li><li>Ashby, M. C., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+calcium+and+the+functions+of+intracellular+organelles.">ER calcium and the functions of intracellular organelles.</a> Sem Cell Dev Biol. 12 (1), 11-17 (2001).</li><li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+calcium+and+Alzheimer's+disease:+in+a+state+of+flux.">ER calcium and Alzheimer's disease: in a state of flux.</a> Sci signal. 3 (114), (2010).</li><li>Rutkowski, D. T., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trip+to+the+ER:+coping+with+stress.">A trip to the ER: coping with stress.</a> Trends Cell Biol. 14 (1), (2004).</li><li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+and+the+unfolded+protein+response.">ER stress and the unfolded protein response.</a> Mutat Res. 569 (1-2), 29-63 (2005).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Poburko, D., Liao, C. H., van Breemen, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++content+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Mitochondrial regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in vascular smooth muscle cells.</a> Circ Res. 104 (1), 104-112 (2009).</li><li>Esfandiarei, M., Fameli, N., Choi, Y. Y., Tehrani, A. Y., Hoskins, J. G., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waves+of+calcium+depletion+in+the+sarcoplasmic+reticulum+of+vascular+smooth+muscle+cells:+an+inside+view+of+spatiotemporal+Ca2++regulation.">Waves of calcium depletion in the sarcoplasmic reticulum of vascular smooth muscle cells: an inside view of spatiotemporal Ca2+ regulation.</a> PloS one. 8 (2), e55333 (2013).</li><li>Cobbold, P. H., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+bioluminescence+measurement+of+cytoplasmic+free+calcium.">Fluorescence and bioluminescence measurement of cytoplasmic free calcium.</a> Biochem J. 248 (2), 313-328 (1987).</li><li>Park, M. K., Ashby, M. C., Erdemli, G., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear,+perigranular+and+sub-plasmalemmal+mitochondria+have+distinct+functions+in+the+regulation+of+cellular+calcium+transport.">Perinuclear, perigranular and sub-plasmalemmal mitochondria have distinct functions in the regulation of cellular calcium transport.</a> The EMBO journal. 20 (8), 1863-1874 (2001).</li><li>Lovett, J. L., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+stores+in+Toxoplasma+gondii+govern+invasion+of+host+cells.">Intracellular calcium stores in Toxoplasma gondii govern invasion of host cells.</a> J Cell Sci. 116 (14), 3009-3016 (2003).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Palmer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++indicators+based+on+computationally+redesigned+calmodulin-peptide+pairs.">Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs.</a> Chem Biol. 13 (5), 521-530 (2006).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Dieses Protokoll beschreibt die Transfektion von VSMCs mit dem D1SR Adenovirus Ca 2+ -Konzentrationen in dem Lumen des SR zu studieren. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Messung von Ca 2+ in diesem Organell sowie seine Bewegung in den / aus dem SR als Ergebnis der Anwendung von unterschiedlichen Calcium bewegenden Agenten. Diese Methode hat viele Vorteile für die Forscher arbeiten an einem umfassenden Verständnis der Auswirkungen von Änderungen an SR und cytoplasmatischen Ca 2+...

Ca 2+ ist ein sehr wichtiger Ionen im Überfluss in jeder einzelnen Zelle im Körper gefunden. Es hat eine bedeutende Rolle in vielen verschiedenen Zellfunktionen, einschließlich Wachstum, Proliferation, Migration und Apoptose 1-4. Es ist bekannt, dass Ca 2+ diese Prozesse durch direkte und indirekte Aktionen beeinflussen können, und daher Änderungen an den normalen intrazellulären Konzentrationen dieses Ions in negativen Folgen für die betroffenen Zellen leicht zur Folge haben kann. Der SR wird als die größte intrazellulären Ca 2+ Speicher innerhalb der Zelle 5 betrachtet. Steady - State - Niveaus von Ca 2+ sowohl in der SR und Zytoplasma werden in der Regel durch konstanten Fluss in die und aus der 2+ -transportierenden Kanäle dieses Organell Ca gehalten. Die Stressbedingungen auf Zellen auferlegt aufgrund irgendeiner Form von Verletzungen oder Erkrankungen sind häufig mit erheblichen Veränderungen in der SR Ca 2+ zugeordnet , die auf langfristige Auswirkungen auf das zu haben , gehen eralth der Zelle. In der schwersten Fällen die Unfähigkeit eines gestressten Zelle erholen und stetigen Ca Zustand SR halten 2+ -Spiegel auch im Tod durch Apoptose 6-8 gipfeln kann. Die aktuelle Forschung in zelluläre Ca 2+ Dynamik wird durch die Tatsache , dass nur wenige Studien Test Ca 2+ Speicherinhalt direkt 9-11 Organell. Die am weitesten verbreitete Praxis beinhaltet stattdessen Messung der cytoplasmatischen Ca 2+ -Spiegel als indirekte Messungen von Veränderungen in der SR Ca 2+ -Gehalt 12-14. In diesen Experimenten wird 2+ Ca häufig induziert vom SR durch die Verwendung von pharmakologischen Mitteln freigesetzt werden verursacht die Abreicherung des Organell (zB Thapsigargin). Schlussfolgerungen werden dann im Hinblick auf Änderungen an SR Ca 2+ basierend auf Schwankungen der cytoplasmatischen Ca 2+ Konzentrationen gezogen. Trotz der Möglichkeit, für die Ermittler noch auf solche Schlussfolgerungen in einem Kreisverkehr ma ziehennner, diese Methode der SR Ca 2+ -Messung ist eindeutig ein indirekter Weg , solche Informationen zu sammeln, mit vielen Einschränkungen die Interpretation der gesammelten Daten. Um diese Einschränkung zu umgehen klar, ist es notwendig , die Menge an Ca 2+ gefunden direkt innerhalb des SR luminalen Netzwerk zu messen. Entscheidend für das Endergebnis in der Lage, intraluminale SR Ca 2+ -Spiegel direkt aufzuzeichnen sind die Zellkultur - Tools und die Ca 2+ Indikator verwendet. Für die Daten im aktuellen Manuskript Bezug genommen wird, ist es wichtig zu beachten, dass verwendet VSMCs aus einer gefrorenen Zelllinie kam. Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% Serum von neugeborenen Kälbern (NCS) über Durchgänge 22-26 für die skizzierten Versuche bei einer konstanten 37 ° C mit 5% CO 2 -Zufuhr inkubiert. Verwendung der aktuellen Methode, beispielsweise wurden auf einem Proteingemisch Zellen sehr erfolgreich gezüchtet, die die extrazelluläre simuliertUmgebung von vielen verschiedenen Arten von Gewebe 15. Wichtig für den Erfolg entlang der Vene von SR Ca 2+ Forschung ist die Art der Proteinmischung verwendet; in diesem Fall war eine niedrige Wachstumsfaktor Vielfalt notwendigen Komponenten dieses Werkzeugs zu vermeiden , die aus dem regulären Ca 2+ Signalisierung zu beeinflussen und Bewegungen ständig innerhalb der getesteten Zellen auftreten. Nach dem erfolgreichen Wachstum von Testzellen, muss die Ca 2+ Indikator auch wirksam auf diese kultivierten Zellen eingebracht werden. Dies ist möglich geworden durch einen Adenovirus - Vektor verwendet, die die SR-Wohnsitz Ca 2+ trägt Indikator D1SR. Um eine hohe Transfektionseffizienz Zellen erreichen, müssen mit viralen Vektoren für mindestens 36-48 h vor der Bebilderung inkubiert werden. Dieses Präparat stellt ein zuverlässiges Werkzeug Ca 2+ Transienten innerhalb der SR - Lumen mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu messen. D1SR Indikator in diesem Protokoll verwendet eine modifizierte Variante des D1ER Ca 2+ iNDIKATOR , die ursprünglich an der University of California von Dr. Roger Tsien Labor erstellt, San Diego, USA 9,16. Die ursprüngliche D1ER gehört zu einer zweiten Generation von genetisch Ca 2+ codiert Indikatoren genannt Chamäleons , die 9,16 Ca 2+ Empfindlichkeiten über einen viel breiteren Bereich (0,5 bis 160 &amp; mgr; M) im Vergleich zur vorherigen Ca 2+ Indikatoren anzeigen. Die neue Variante D1SR ein freundliches Geschenk von Dr. Wayne Chen (University of Alberta, Canada), trägt jedoch eine mutante Calsequestrin Sequenz (anstelle eines Calreticulin-Sequenz, wie in der ursprünglichen D1ER). Die Mutante Calsequestrin hat Ca 2+ eine reduzierte Bindung , die bei der Bindung an Ca 2+ innerhalb des SR Lumen 11 das Problem der im Wettbewerb mit endogenen Calsequestrin eliminiert. Der D1SR Indikator trägt ein verkürztes verstärkt cyan fluoreszierendes Protein (GFP) und gelb fluoreszierendes Protein (YFP), dass binden durch einen Linker-Protein enthält modifizierte Calmodulin (CaM) und M13 (ter 26-Rest-Peptid von Myosin-Leichtketten-Kinase, die an CaM) Sequenzen bindet. Die CaM-M13-Sequenz wurde modifiziert, M13, um zu verhindern, um endogene Calmodulin binden. Auch, um SR Retentions gewährleisten, ist eine Calsequestrin Sequenz wurde am 5&#39;Ende der CFP 11 hinzugefügt. Wenn gebunden an Ca 2+, geht die CaM-M13 - Domäne durch Konformationsänderungen , die in einer Erhöhung der Energieübertragung zwischen den flankierenden CFP und YFP führen, was als ein Anstieg in der FRET - Signalintensität aufgezeichnet. Auf der anderen Seite, wenn die Konzentration von SR luminalen Ca 2+ abfällt, geht die CaM-M13 - Domäne durch Reverse Konformationsänderungen, was zu einer Verringerung der Energieübertragung zwischen den flankierenden CFP und YFP und einem signifikanten Abfall der Signalintensität FRET .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (high glucose, pyruvate)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Keep at -20&#176;C until right before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Keep at -20&#176;C until right before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass-bottomed plates</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL 0.2 &#956;M vented blue plug seal cap flask</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA Solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Keep at -20&#176;C until right before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1SR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo 4-AM</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>F-23917</td>
			<td>Keep at -20&#176;C until right before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>T7100BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5.0</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of calcium fluctuations within the sarcoplasmic reticulum of cultured smooth muscle cells using fret-based confocal imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

In diesem Abschnitt werden Beispiele für die Ergebnisse , die unter Verwendung der beschriebenen Verfahren erhalten werden kann , SR luminalen Ca 2+ -Konzentration Daten zu erfassen, im Vergleich zu der üblicherweise verwendeten Art indirekt Änderungen Messung Ca 2+ store Konzentrationen Organell durch Schwankungen in cytoplasmatischen Ca 2+ beobachtet . 1A zeigt eine Moment...

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Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

measurement-calcium-fluctuations-within-sarcoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Biology

7.6K Aufrufe.  University of British Columbia. Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Serie: Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Focal Ca 2 + Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Forschung

Biologie

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

Isolierung humaner Nabelschnur arteriellen glatten Muskelzellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Isolation der Lungenarterie glatten Muskelzellen aus neugeborenen Mäusen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

Gleichzeitige pH-Messung in endozytischen und Cytosolic Fächer in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

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Focal Ca^{2 +} Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur