Name: imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
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This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

Wir stellen detaillierte Verfahren zur Abbildung lokalen Ca 2+ Ereignisse in menschlichen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen. Diese Verfahren können zur Bild intrazellulärem Ca 2+ Signale in vielen Zelltypen 8-10 anpassen. 1. Herstellung der Zellen <ol><li> Kultur die Zellen gemäß den Anweisungen auf der Website ihren Lieferanten aufgeführt abgebildet werden. </li><li> Einige Tage vor der Bilderzeugung, Ernten der Zellen in einem Gewebekulturkolben unter Verwendung von 1 ml 0,25% Trypsin / EDTA (2-3 min) gezüchtet. Nach Ablösung, dasselbe Volumen der Kulturmedien, um das Trypsin zu inaktivieren. </li><li> Führen Sie eine Zellzahl mit einer Zählkammer und Samenzellen in Glasboden Bildgebung Schalen in einer Dichte von 3-7 × 10 4 Zellen pro Schale. Wählen Sie die Zellen, die für Imaging-Experimente, wenn sie erreichen 60% Konfluenz (2-3 Tage). </li></ol> 2. Herstellung von Lösungen und Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie eine Ca 2+ -haltige HEPES gepuffertSalzlösung (Ca 2+ -HBSS) von (mM) aus: 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES und 10 Glucose; pH = 7,4 bei Raumtemperatur (RT) mit NaOH. Bereiten Ca 2+ -HBSS ohne die Zugabe von Glucose und bei 4 ° C; Zugeben von Glukose zu der Lösung unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Löslich membrangängige Form des fluoreszierenden Ca 2+ Indikator Cal-520 (1 mM), CI-IP 3 (200 uM) und EGTA (100 mM) in Dimethylsulfoxid (DMSO), die 20% Pluronic F-127. Aliquot dieser Reagenzien in Eppendorf-Röhrchen und lagern, vor Feuchtigkeit und Licht geschützt, bei -20 ° C. </li></ol> 3. Loading-Zellen mit membrangängige Cal-520, ci-IP 3 und EGTA <ol><li> Bereiten Sie die &quot;Ladepuffer&quot; durch Verdünnen Stammlösungen von membrangängige Cal-520 und ci-IP 3 bis zu einer Endkonzentration von 5 uM und 1 &amp; mgr; M, in Ca 2+ -HBSS. </li><li> Saugen Sie culture Medien und spülen Zellen durch Ersatz von Medien mit Ca 2+ -HBSS dreimal. </li><li> Entfernen Ca 2+ -HBSS inkubieren Zellen in Ladepuffer für 60 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Entfernen Ladepuffer und spülen Zellen durch Ersatz von Medien mit Ca 2+ -HBSS dreimal. <ol><li> Falls gewünscht, kann in diesem Schritt, Wägezellen mit EGTA / AM durch Verdünnen der Stammlösung auf eine Endkonzentration von 5 &amp; mgr; M Ca 2+ -HBSS und dann inkubieren Zellen 30-60 min bei RT im Dunkeln. Im Anschluss an diese Inkubation spülen Zellen dreimal mit Ca 2+ -HBSS bevor Sie mit Schritt 3.5. </li></ol></li><li> Zellen in Ca 2+ -HBSS Inkubation 30 min zur Entesterung von belasteten Reagenzien ermöglichen. </li><li> Unmittelbar vor der Abbildungs ​​Ersetzen Ca 2+ -HBSS mit &quot;frischen&quot; Ca 2+ -HBSS um jeden Farbstoff, der in der letzten Inkubation in das Bad ausgetreten sind, beseitigt werden. </li></ol> 4. Ca 2+ </sup&gt; Image Acquisition <ol><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl auf die 100X APO TIRF Ziel (NA 1,49). </li><li> Montieren Sie die Bildform auf der Bühne des inversen Mikroskop und bringen die Zellen in den Fokus im Durchlicht. Es ist wichtig, um die Abbildungsschale, um eine Bewegung während der Aufnahme zu verhindern sichern. </li><li> Beleuchten Zellen mit einem 488 nm Laser, um Cal-520 erregt und sammeln emittierte Fluoreszenz (λ&gt; 510 nm) unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits EMCCD- Kamera. HINWEIS: Die Software, die das Mikroskop arbeitet erlaubt dem Benutzer, eine Fokussierlinse ermöglicht den Laserstrahl eingebracht werden, entweder an der äußersten Kante der Objektivrücköffnung (für TIRF Anregung) oder mehr in der Mitte (bei &quot;WF&quot; Anregung) zu übersetzen. </li><li> Mit der EMCCD-Software, reduzieren Sie die Bildfeld aus den vollen 512 x 512 Pixel, um Daten in der erforderlichen zeitlichen Auflösung zu sammeln, um lokalen Ca 2+ Ereignisse zu erfassen. HINWEIS: Zum Beispiel Zentrum QuadErwerb von 256 x 256 Pixel beschleunigt die Erfassungsrate bis 66 fps. Es ist auch möglich, die Bildrate des EMCCD Kamera zu 500 Bildern pro Sekunde weiter zu erhöhen mit einem Isolated Crop-Modus-Funktion. </li><li> Konfigurieren Sie die Software, um automatisch ein paar Sekunden der Grundaktivität, liefern einen UV-Blitz, um die Zellen und fährt mit der Aufnahme für ein weiteres 10 bis 30 sec. HINWEIS: Ein UV-Blitz wird mit einer durch eine UV-reflektierenden dichroitischen Spiegel in den rückseitigen Anschluss des Mikroskops eingeführt Xenon-Bogenlichtquelle geliefert. Die Dauer und Intensität der UV-Blitz wird empirisch eingestellt, um eine gewünschte Frequenz des lokalen Ca 2+ Ereignisse hervorrufen. </li><li> Speichern von Dateien als Bildstapel für die Offline-Analyse. </li></ol> 5. Automatische Ca 2+ Bildanalyse HINWEIS: Es ist möglich, zu sehen, zu verarbeiten und zu analysieren, die erfassten Daten mit vielen kommerziellen Softwarepaketen. Jedoch haben wir einen Algorithmus, um schnell zu automatisieren Identifikations eine entwickelted Analyse der lokalen Ca2 + Signale. Eine detaillierte Beschreibung der räumlichen und zeitlichen Filter in diesem Algorithmus verwendet wird, kann die Erzeugung von &amp; Dgr; F / F 0 und Identifizierung / Auswerteroutinen in 11 gefunden werden. Dieser Algorithmus wurde entwickelt, um auf dem Open-Source-Software-Plattform Python ausführen und erhalten werden, zusammen mit Beispiel experimentellen Daten und ausführliche Gebrauchsanweisung, per E-Mail an den entsprechenden Autor (ismith@uci.edu). <ol><li> Konvertieren von Dateien in das speziell geschriebenen Algorithmus, um die Mehrebenen-TIFF-Datei-Format importiert werden. </li><li> Suchen Sie den Ordner mit der Analyse-Algorithmus und doppelklicken Sie auf die run.exe. </li><li> Wählen Sie das TIFF-Datei analysiert werden. </li><li> Wählen Sie Analyseparameter im offenen Dialog. Siehe 2A für Standardwerte für die Probendaten. </li><li> Bestimmen Sie den Schwarzwert aus dem Bildstapel entweder durch Bewegen des Cursors auf einen Teil des Sichtfeldes, die n tut ausgeglichen werdenot enthalten eine Zelle (siehe Abbildung 2B) oder durch manuelle Eingabe eines Schwarzwert mit dem &quot;Schwarzpegel einstellen&quot; prompt. </li><li> Beobachten vier Fenster auf dem Bildschirm folgende Analyse durch die Software (2C-F). C ist ein monochromes Bild still Fluoreszenz von Zellen analysiert. Weiße Quadrate auf diesem Bild überlagert sind Veranstaltungsorte, wie die Schwerpunktpositionen der zweidimensionalen Gauß-Funktionen ausgestattet, um Ereignisse bestimmt. </li><li> Klicken Sie auf jedes Veranstaltungsortes, oder drücken Sie die Cursor-Tasten, um zwischen den Veranstaltungen. Daraufhin wird der Hintergrund subtrahiert, Gaussian geglättet Fluoreszenzverhältnis ändert (AF / F 0) auf jeder dieser Sites Update im Fenster D. HINWEIS: Rot markierte Ereignisse von &quot;Durchschlagen&quot; von Aktivität zu benachbarten Stellen lokalisiert entschlossen, von diesem bestimmten Ort stammt und nicht. Die untere blaue Linie zeigt an, wo das Fluoreszenzsignal an der ausgewählten Stelle über dem ErkennungsSchwelle, während die schwarze Linie kennzeichnet Events von diesem bestimmten Ort Ursprung (entspricht dem rot hervorgehoben Ereignisse). </li><li> Klicken Sie auf einen rot unterlegt Veranstaltung Fenster E, die die zeitliche Entwicklung der Veranstaltung zeigt, und Fenster F, zeigt das räumliche Profil der Veranstaltung, gemittelt über seine Zeit, natürlich zusammen mit der Raumprofil der angepassten Gaußfunktion aktualisieren. </li><li> Manuelles Überprüfen Sie die Ereignisse, die identifiziert wurden, so dass Artefakte von der Analyse abgelehnt. Löschen Sie solche Ereignisse durch Rechtsklick auf das rot markierte Veranstaltungen. HINWEIS: In unseren Händen, Ca 2+ Fluss durch einzelne IP 3 R-Kanäle erinnert Signale mit AF / F 0 etwa 0,11, so dass alle erkannt &quot;Ereignisse&quot; wesentlich kleiner als diese wahrscheinlich mit Fehlmeldungen rechnen. </li><li> Exportieren von Daten, indem Sie durch Ziehen um die Zelle von Interesse und Auswählen von »Save CellR&quot; Save to Excel &#39;oder Exportieren von Daten auf eine Basis pro Zelle17 ;. HINWEIS: Die Daten werden in den gleichen Ordner wie das Originalbild Stack gespeichert. </li></ol>

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	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. 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S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Wir beschreiben hier Protokolle zur Abbildung lokalen Ca 2+ Ereignisse in kultivierte Säugerzellen unter Verwendung von fluoreszierenden Ca 2+ Indikatoren. Darüber hinaus beschreiben wir einen Algorithmus mit einer intuitiven Benutzeroberfläche, die Identifikation und Analyse von erfassten Daten automatisiert. Das hier beschriebene Verfahren nutzen die fluoreszierenden Ca 2+ Anzeige Cal-520, aber viele andere Ca 2+ empfindlichen Farbstoffe wie Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 und Ore...

Calciumionen (Ca 2+) ubiquitär regulieren ein breites Spektrum von biologischen Prozessen, einschließlich Genexpression, Sekretion und dauerhafte Veränderungen in der synaptischen Plastizität 1. Ein Weg, durch welche Ca 2+ in einer vielfältigen Art und Weise wirken, ist durch die unterschiedliche räumliche und zeitliche Muster von Ca 2+ signalisiert eine Zelle erzeugen kann. Zum Beispiel globale Erhebungen in zytosolischen [Ca 2+] Trigger Kontraktion in glatten Muskulatur 2 während kleinere, lokale vorübergehende Erhöhung (lokalen Ca 2+ Mikrodomänen) zu stimulieren Genexpression essentiell für Lernen und Gedächtnis 3. Freien cytosolischen [Ca 2+] liegt bei ~ 100 nM in Ruhe gehalten wird, kann jedoch schnell zu mehreren Mikro molaren nach der Einstrom von Ca 2+ in das Cytosol steigen durch Ca 2+ durchlässige Ionen-Kanäle in der Plasmamembran und befindet die Freisetzung von Ca2 + aus intrazellulären stores. Unser Labor konzentriert sich auf den Inositol-1,4,5-triphosphat-Rezeptor (IP 3 R), das eine Ca 2+ -Freisetzung Kanal im endoplasmatischen Retikulum (ER) membran bildet. Bei der Bindung von sowohl IP 3 und Ca 2+ auf die cytosolische Aktivierung Stellen des Rezeptors, öffnet das IP 3 R-Kanal zu befreien Ca 2+ in das ER-Lumen sequestriert. Die Freisetzung von Ca 2+ räumlich auf eine kleine Gruppe von IP 3 Rs begrenzt bleiben, um eine lokale Mikrodomäne cytosolischen Ca 2+ zu erzeugen (Ca 2+ puff 4) oder, abhängig von der Nähe der benachbarten Clustern von IP 3 R, kann verbreiten sich eine Zelle durch die Rekrutierung von mehreren puff Websites durch einen Prozess der Ca 2+ -induzierte Ca 2+ -Freisetzung (CICR) 5,6. Die Einführung von Kleinmolekül-Fluoreszenz-Ca 2+ Indikatorfarbstoffe von Roger Tsien entwickelte 7, verbunden mit modernster Mikroskopie imaging Techniken hat erheblich erleichtert unser Verständnis von Ca 2+ Signalisierung. Jüngste Fortschritte in der Kameras für die Mikroskopie verwendet nun zur Abbildung vorübergehenden lokalen Ca 2+ Ereignisse wie Windbeutel mit beispielloser räumlicher und zeitlicher Auflösung zu ermöglichen. Derzeit verfügbare EMCCD-Kameras ermöglichen Bildgebung mit 128 x 128 Pixeln bei&gt; 500 Bilder sec -1 (fps) und die neue Generation der komplementären Metall-Oxid-Halbleiter (CMOS) Kameras bieten eine höhere Pixel-Auflösung und sogar höhere Geschwindigkeit auf Kosten etwas höher Geräuschpegel. In Verbindung mit der Totalreflexion (TIRF) Mikroskopie ist es nun möglich, einzelne Bild Ca 2+ Kanalereignisse 8,9. Dieser Ansatz ermöglicht die Abbildung von Hunderten von Kanälen / Ereignisse gleichzeitig, während die Erzeugung von großen Datenmengen (ca. 1 GB pro Minute), die manuelle Bearbeitung, visuelle Identifizierung und Analyse machen unpraktikabel und setzen Sie eine Last auf die Entwicklung von automatisierten Algorithmen. 2+ Signale in intakten Säugerzellen unter Verwendung von fluoreszierenden Ca 2+ Indikatoren präsentieren wir. Wir zeigen ferner einen Algorithmus in der Open-Source-Umfeld Python, die Identifikation und Analyse von lokalen Ca 2+ Ereignisse sowohl von TIRF und konventionellen Weitfeld-Auflicht-Fluoreszenz (WF) Mikroskopie abgebildet automatisiert entwickelt. Obwohl wir beschreiben diese Ansätze im Zusammenhang mit der IP 3 -generated Ca 2+ Signalen leicht zu einer lokalen Veränderung in cytosolische [Ca 2+] aus einer Vielzahl von Ca 2+ ausgeh -durchlässigen Ionenkanäle entweder in der Oberfläche angeordnet zu untersuchen sind Membran oder intrazellulären Organellen 8-10.

<table><tbody><tr><td>Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520/AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;(D-23-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-Isopropylidene-6-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20% pluronic F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom imaging dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

Zytosolischen Ca 2+ -Ionen regulieren zahlreiche Aspekte der Zellaktivität in fast allen Zelltypen, Kontrollprozesse, wie vielfältig wie Gen-Transkription, elektrischen Erregbarkeit und Zellproliferation. Die Vielfalt und Besonderheit der Ca 2+ Signal leitet sich von Mechanismen, durch die Ca 2+ Signale erzeugt werden, um über verschiedene Zeit- und Raumskalen wirken, von der Zelle weiten Schwingungen und Wellen über die Perioden von Minuten, um lokale transiente Ca 2+ Mikrodomänen auftreten (Ca 2+ Hauche) anhalt Millisekunden. Jüngste Fortschritte in der Elektronen multipliziert CCD (EMCCD) Kameras jetzt Bildgebung von lokalen Ca 2+ Signale mit einem 128 x 128 Pixel Ortsauflösung ermöglichen mit Raten von&gt; 500 Bilder sec -1 (fps). Dieser Ansatz ist sehr parallel und ermöglicht die gleichzeitige Überwachung von Hunderten von Kanälen oder Blätterteig Stellen in einem einzigen Experiment. Doch die große Datenmengen generiert (ca. 1 GB per min) machen visuelle Identifizierung und Analyse der lokalen Ca 2+ Ereignisse nicht praktikabel. Hier beschreiben und zeigen die Verfahren für die Erfassung, Erkennung und Analyse der lokalen IP 3 vermittelte Ca 2+ Signale in intakten Säugerzellen mit Ca 2+ Indikatoren sowohl mit Weitfeld-Auflicht-Fluoreszenz (WF) und Totalreflexion geladen Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie. Darüber hinaus beschreiben wir einen Algorithmus in der Open-Source-Software-Umgebung Python, die die Identifizierung und Analyse dieser lokalen Ca 2+ Signale automatisiert entwickelt. Der Algorithmus lokalisiert Websites von Ca 2+ Freisetzung mit Subpixel-Auflösung; ermöglicht dem Benutzer Überprüfung der Daten; und gibt Zeitsequenzen der Fluoreszenzverhältnissignale mit Amplituden und kinetische Daten in einer Excel-Tabelle kompatibel.

1A zeigt eine WF Bild ruhender Cal-520-Fluoreszenz in menschlichen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen ebenfalls mit ci-IP 3 geladen. Exposition dieser Zellen in einen 100 msec UV-Blitz, um foto Freisetzung i-IP 3 ausgelöste Ca 2+ Transienten Quasten an diskreten Stellen (durch die weißen Kreise in 1A angegeben). Fluoreszenz Spuren gemessen an diesen Stellen zeigten eine schnelle Anstiegsphase aufgrund transienter Öffnungen der IP 3 R, gefolgt von ...

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Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K Aufrufe.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Serie: Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Entwicklungsbiologie

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Calcium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monoschichten

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der viralen Störung der intestinalen Epithelsignalisierung – Forschungseinblicke und zukünftige Richtungen 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Immunologie und Infektion

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral (dorsal root ganglia) and central tissues (cortex, subventricular zone, organoid) that are dynamically studied in terms of calcium shifts. The model chosen to illustrate the results is the retina, a simple tissue with complex cellular interactions. Calcium is a universal messenger involved in most of the important cellular roles. We explain in a step-by-step protocol how retinal neuron-glial cells in culture can be prepared and evaluated, envisioning calcium shifts. In this model, we differentiate neurons from glia based on their selective response to KCl and ATP. Calcium permeable receptors and channels are selectively expressed in different compartments. To analyze calcium responses, we use ratiometric fluorescent dies such as Fura-2. This probe quantifies free Ca2+ concentration based on Ca2+-free and Ca2+-bound forms, presenting two different peaks, founded on the fluorescence intensity perceived on two wavelengths.

Cell calcium imaging is a versatile methodology to study dynamic signaling of individual cells, on mixed populations in culture or even on awakened animals, based on the expression of calcium-permeable channels/receptors that gives unique functional signatures.

Visualisierung von Verschiebungen auf dem Neuron-Glia-Schaltkreis mit der Kalzium-Bildgebungstechnik

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

<meta charset="utf8"></head><body>Hochauflösendes bildgebendes Verfahren zum Nachweis von Ca2+ -Mikrodomänen in T-Zellen

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der anfänglichen Aktivierung der adaptiven Immunantwort für therapeutische Interventionen

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Bildgebung von anfänglichen Ca2+ -Mikrodomänen in primären T-Zellen

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

Imaging Lokale Ca

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Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

Dissektion der lokalen Ca^{2 +} Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca^{2 +} Indikatoren

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Visualisierung von Verschiebungen auf dem Neuron-Glia-Schaltkreis mit der Kalzium-Bildgebungstechnik

Bildgebung von anfänglichen Ca²⁺ -Mikrodomänen in primären T-Zellen