Teilfinanzierung aus dem USDA multi-state Forschungsprojekt W-2171 &quot;Germ Cell und Embryo-Entwicklung und Manipulation zur Verbesserung der Tierhaltung&quot; sei herzlich gedankt. Die künstlerische Begabung von Ryan Callahan, der die technische Illustrationen für den Videoteil dieser Artikel hergestellt werden, sind auch dankbar anerkannt.

1. Auswertung Eignung von Embryos für die Kryokonservierung 1 <ol><li> Proben aus der Fortpflanzungsorgane der einzelnen weiblichen Spendertieren geerntet sollte in einer isotonischen Embryo hält Medium für 10 Minuten vor der Auswertung mit einem Stereomikroskop gelegt werden. Seien Sie sicher, Embryonen aus jedem Spender weiblich getrennt voneinander, um die Identifizierung der Herkunft von Embryotransfer Nachkommen ermöglichen zu halten. </li><li> Mit geringer Vergrößerung (≤ 10-fach), Proben von einem einzelnen Spender Weibchen in getrennten Gruppen, bestehend aus unbefruchteten Eizellen sollten getrennt werden, degenerieren Embryonen oder übertragbar Qualität Embryonen. Nur Güteklasse 1 oder 2 Embryonen im kompakten Morula durch erweiterte Blastozyste Stadien der Entwicklung sind für die Kryokonservierung geeignet, und alle anderen zu verwerfen (es sei denn, Synchron-Empfänger Weibchen für die Güteklasse 3 Embryonen und eine Post-Transfer-Schwangerschaftsrate von ca. 25 stehen zur Verfügung -30% ist zulässig). </li><li> Überprüfen Sie Qualitätsstufe 1 und 2 kompakten Morula durch erweiterte Blastozystenstadium Embryonen bei einer Vergrößerung ≥ 50X, um sicherzustellen, dass die Zona pellucida des Embryos intakt ist und dass es kein Material (z. B. Zellen, Schleim) die Einhaltung der Zona pellucida. Jeder Embryo mit einem gerissenen oder fehlenden zona pellucida oder mit einer Glashaut mit Anhänger Material sollte von anderen Embryonen zu trennen und entweder verworfen oder verarbeitet werden getrennt. </li></ol> 2. Washing Embryonen Verringerung der Wahrscheinlichkeit von Krankheit Getriebe 2 <ol><li> Bewegen zona pellucida-intakten Embryonen in einem minimalen Volumen von isotonischen Embryo hält Medium in der ersten Vertiefung Embryo Waschen Medium (zB Phosphat-gepufferte Salzlösung ergänzt mit Antibiotika und Rinderserumalbumin, Neugeborenen Kälberserum, oder Polyvinylalkohol). Keep Embryonen aus jedem Spender weiblich getrennt, und versuchen Sie nicht mehr als 10 Embryonen auf einmal zu waschen. Bewegen Embryonen in einem minimalen Volumen von Medium in jeder nachfolgenden waschen, um eine serielle Verdünnung ≥ 1:100 zu erreichen, und sicher sein, sterile Embryo Handling Tipps, die zwischen zwei aufeinanderfolgenden waschen geändert verwenden. </li><li> Bewegen Embryonen durch 4 weitere Wäschen wie in 2.1 beschrieben. </li><li> Falls die Übertragung von Viruserkrankungen von Belang ist, waschen Embryonen zweimal in einer 0,25% Trypsin-Lösung, für einen gesamten kombinierten Belichtungszeit von nicht mehr als 90 Sekunden Trypsin. </li><li> Nach den beiden Trypsin wäscht, waschen Embryonen 5-mal mehr in Embryo Waschmedium wie in 2.1 beschrieben. </li><li> Nach dem letzten Embryo zu waschen, statt Embryonen in isotonische Embryo hält Medium. </li></ol> 3. Dehydratisierende Embryonen vor der Kryokonservierung 3 <ol><li> Embryonen in einem minimalen Volumen von isotonischen Embryo hält mittelfristig in eine hypertone Lösung (1,4 bis 1,5 Molare Konzentration) eines kryoprotektive Agent (CPA), wie Ethylenglykol oder Glycerin übertragen werden. </li><li> Lassen Embryonen in Einfriermedium (hypertone CPA-Lösung) zu sitzen, bis sie osmotische Gleichgewicht erreicht ist. Da Ethylenglykol durchdringt embryonale Zellen schneller als im Glycerin, sind Zeiten für die Gleichgewichtseinstellung in der Regel weniger für Embryonen in Ethylenglykol (5 min) als in Glycerin (10 min). Ein Teil dieses Gleichgewichts Zeit kann während und nach erreicht werden Embryonen in Strohhalmen (beschrieben in nächster Schritt) geladen werden. </li></ol> 4. Loading Embryonen in einer 0,25 ml Kunststoff-Strohhalm für Kryokonservierung <ol><li> Befestigen Sie den Wattebausch Ende einer 0,25 ml Kunststoff-Strohhalm (11,5 cm Arbeitslänge) zu einem Embryo Ladevorrichtung, und saugen Sie ca. 1,3 cm von hypertoner CPA-Lösung in einen korrekt etikettierten Stroh. Eine Vielzahl von Verfahren zur Kennzeichnung vorhanden ist, einschließlich der Verwendung von Etiketten angebracht, um entweder einen Strohhalm Verschlussstopfen oder zu einem anderen Stroh mit Stroh-Adapter angeschlossen. </li><li> Entfernen Sie das Stroh aus der CPA-Lösung, und saugen ca. 0,15 cm Luft zu einem winzigen Luftblase im Stroh zu schaffen. </li><li> Absaugen eines einzigen Embryos in ca. 0,8 cm von hypertoner CPA-Lösung in das Stroh. </li><li> Entfernen Sie das Stroh aus der CPA-Lösung und saugen ca. 0,15 cm der Luft auf eine zweite kleine Luftblase im Stroh (Luftblasen dienen physisch zu isolieren des Embryos im Stroh) zu schaffen. </li><li> Saugen Sie ca. 9,1 cm von CPA-Lösung vollständig zu füllen das Stroh, dass bestimmte, in einem ausreichenden Volumen von CPA-Lösung zu ziehen, die aus Polyvinylchlorid (PVC)-Pulver, die innerhalb der Wattestopfen Ende des Stroh existiert befeuchten. Die CPA-Lösung bewirkt, dass die PVC-Pulver zu Gel und Siegel, das Ende des Strohs. </li><li> Seal das andere Ende des Strohs mit PVC-Pulver-, Kunststoff-Stroh Verschlussstopfen oder ein Folienschweißgerät. </li></ol> 5. Platzieren Embryonen in einer kontrollierten Geschwindigkeit Embryo Freezing-Maschine <ol><li> Entweder Methanol-Bad oder in flüssigem Stickstoff Dampf Einfrieren Maschinen können für die Kryokonservierung von Präimplantationsembryonen programmiert werden. </li><li> Legen Sie die Halme mit der Embry<html> os zu einem Einfrieren Maschine, deren Temperatur von Raumtemperatur bis -6 ° C abgekühlt worden Legen Strohhalme Wattestopfen landen (es sei denn, Kunststoff-Strohhalm Verschlussstopfen oder Stroh Adapter verwendet wird, in welchem ​​Fall Wattestopfen Ende nach unten platziert ist). </li><li> Lassen Embryonen bei dieser Temperatur für mindestens 2 Minuten, bevor Sie fortfahren sitzen. </li></ol> 6. Seeding <ol><li> Einmal Embryonen bis -6 ° C abgekühlt, verwenden Sie eine Zange in flüssigem Stickstoff (oder ein Wattestäbchen-Stick in flüssigen Stickstoff getaucht) unterkühlt, um die Bildung von Eiskristallen in der CPA-Lösung in das Stroh zu induzieren, indem Sie die Zange (oder Baumwolle Trinkgeld-Stick) auf die Säule der Lösung entweder oberhalb oder unterhalb des Embryos. </li><li> Das Wasser in der CPA-Lösung wird in der Region ausgesetzt flüssigem Stickstoff zu kristallisieren, und Eiskristalle werden, um die Spalte der CPA-Lösung in unmittelbarer Umgebung des Embryos zu verbreiten. </li><li> Halten Embryonen Impftemperatur für 10 Minuten, bevor eine weitere Abkühlung. </li></ol> 7. Continuing Dehydratisierung von Embryonen <ol><li> Coole Embryonen mit einer Rate von 0,5 ° C / min bis zu einer Temperatur von -34 ° C. Diese Abkühlgeschwindigkeit ist wichtig, weiterhin Austrocknung des Embryos zu gewährleisten. </li><li> Halten Embryonen bei -34 ° C für 10 Minuten vor dem Eintauchen Embryonen in flüssigem Stickstoff (-196 ° C). </li><li> Legen Sie kryokonservierten Embryonen in einen entsprechend gekennzeichneten Becher (gefüllt mit flüssigem Stickstoff), die an einem entsprechend gekennzeichnet Zuckerrohr, und setzen Sie den Stock in einen Kanister von einem Flüssig-Stickstoff-Dewar für kurz-oder langfristige Lagerung. </li></ol> 8. Auftauen kryokonservierten Embryonen <ol><li> Ziehen Sie den Kanister in den Hals des flüssigen Stickstoffs Dewar, sicherzustellen, dass die Kanister unten bleibt der Frostgrenze in den Dewar. </li><li> Suchen Sie das Rohr mit dem Embryo aufgetaut werden, und zwar schnell und vorsichtig das Stroh aus dem Kelch, dass bestimmte nicht auf andere Strohhalme in den Becher warm. </li><li> Halten Sie das Stroh in der Luft für 3-5 Sekunden (die Häufigkeit eines gerissenen zona pellucida 4 zu reduzieren), und dann tauchen in eine 37 ° C Wasserbad für weitere 25-30 Sekunden. </li><li> Entfernen Sie das Stroh aus dem Wasserbad, wischen Sie das Stroh (darauf achten, daß der Embryo Identifikation auf dem Stroh wisch), verwenden Sie einen Strohhalm Schneideinrichtung zu snip off der Nicht-Wattestopfen Ende des Strohs (wenn versiegelt mit Wärme-oder PVC-Pulver ), oder entfernen Sie vorsichtig die Kunststoff-Verschlussstopfen, und entweder: <ol type="a"><li> Last das Stroh in einen Embryo-Transfer-Gerät und den Transfer so schnell wie möglich, um eine synchrone Embryo Empfänger (aber nur, wenn der Embryo wurde kryokonserviert mit Ethylenglykol als CPA), oder </li><li> Halten Sie das offene Ende des Strohs über eine Schale mit einer 1,0 molaren Konzentration von Saccharose (ein nicht-durchdringenden Verbindung), und verwenden Sie eine Schere abzuschneiden Wattestopfen Ende des Strohs. Inhalt des Strohs sollte frei in die Saccharose-Lösung fließen, aber schiebt einen kleinen Luftsäule durch das Stroh kann es notwendig sein, wenn alle Reste des Mediums besteht in dem Stroh. Lassen Embryonen in Saccharose-Lösung 10 Minuten lang, und dann-Embryonen in isotonische Embryo hält Medium für 10 Minuten. Bewerten Embryonen nach dem Auftauen, laden Sie in ein neues Stroh, und in einem geeigneten Empfänger Weibchen. </li></ol></li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse: Eine Vielzahl von Faktoren beeinflussen die Schwangerschaft und Lebendgeburt Preise, die sich aus der Übertragung der aufgetauten Präimplantationsembryonen um synchrone Empfänger Weibchen 5. Embryonen im Entwicklungsstadium weniger weit fortgeschritten als kompakte Morula oder weiter fortgeschritten als erweiterte Blastozyste oft nicht überleben die Kryokonservierung Prozess sowie Embryonen im kompakten Morula, Blastozyste früh, Blastozyste und erweiterte Blastozyste Stadien der embryonalen Entwicklung. Embryonen der Güteklasse 1 und 2 höheren Ausbeute nach dem Auftauen Schwangerschaftsraten als sie Güteklasse 3 Embryonen (die typischerweise nicht wegen der geringen nach dem Auftauen Schwangerschaftsraten kryokonserviert). Embryonen misshandelt während der Embryo Einfrieren oder Auftauen Embryo Verfahren sind wahrscheinlich reduziert Schwangerschaftsraten aufweisen. Transferierten Embryonen bis zum Empfänger Weibchen, deren Ovarialzyklen sind nicht mit der des Spenders weiblichen synchronisiert erzeugen typischerweise niedrigeren Schwangerschaftsraten. In vitro produzierten Embryonen oder manipuliert in irgendeiner Weise (zB Biopsie oder halbiert) liefern in der Regel niedrigere Schwangerschaftsraten. Unter optimalen Bedingungen Schwangerschaftsraten nach Transfer von aufgetauten in vivo gewonnene Embryonen ist in der Regel 60-70% bei Rindern 6,7, 65-75% bei Schafen 8,9,10,11, und 60-70% bei Ziegen gewonnen 12,13,14,15. Ebenso Schwangerschaftsraten nach der Übertragung der gewonnenen aufgetauten in vitro erzeugten Embryonen ist in der Regel 40-50% bei Rindern 6,16, 25-35% bei Schafen 17, und 30-40% bei Ziegen 18. belle 1 &quot;/&gt; Tabelle 1. Erwartete Schwangerschaftsraten nach Transfer von aufgetauten Embryonen aus heimischen Wiederkäuern Tierarten, um synchrone Empfänger Weibchen.

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	<li>Lindner, G. M., Wright, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+embryo+morphology+and+evaluation.">Bovine embryo morphology and evaluation.</a> Theriogenology. 20, 407-416 (1983).</li><li>Stringfellow, D. A., Stringfellow, D. A., Givens, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+sanitary+handling+of+in+vivo+derived+embryos.">Recommendations for the sanitary handling of in vivo derived embryos.</a> Manual of the International Embryo Transfer Society. , 65-68 (2010).</li><li>Youngs, C. R., Leibo, S. P., Godke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+cryopreservation+in+domestic+mammalian+livestock+species.">Embryo cryopreservation in domestic mammalian livestock species.</a> CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources. , (2010).</li><li>Rall, W. F., Meyer, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zona+fracture+damage+and+its+avoidance+during+the+cryopreservation+of+mammalian+embryos.">Zona fracture damage and its avoidance during the cryopreservation of mammalian embryos.</a> Theriogenology. 31, 683-692 (1989).</li><li>Spell, A. R., Beal, W. E., Corah, L. R., Lamb, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+recipient+and+embryo+factors+that+affect+pregnancy+rates+of+embryo+transfer+in+beef+cattle.">Evaluating recipient and embryo factors that affect pregnancy rates of embryo transfer in beef cattle.</a> Theriogenology. 56, 287-297 (2001).</li><li>Hasler, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+status+of+oocyte+recovery,+in+vitro+embryo+production,+and+embryo+transfer+in+domestic+animals,+with+an+emphasis+on+the+bovine.">The current status of oocyte recovery, in vitro embryo production, and embryo transfer in domestic animals, with an emphasis on the bovine.</a> J. Anim. Sci. 76, 52-74 (1998).</li><li>Hasler, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+frozen+and+fresh+embryo+transfer+pregnancy+rates+in+cattle.">Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in cattle.</a> Theriogenology. 56, 1401-1415 (2001).</li><li>Heyman, Y., Vincent, C., Garnier, V., Cognie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+frozen-thawed+embryos+in+sheep.">Transfer of frozen-thawed embryos in sheep.</a> Veterinary Record. 120, 83-85 (1987).</li><li>McGinnis, L. K., Duplantis, S. C., Youngs, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+sheep+embryos+using+ethylene+glycol.">Cryopreservation of sheep embryos using ethylene glycol.</a> Anim. Reprod. Sci. 30, 273-280 (1993).</li><li>Shelton, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+viability+of+fresh+and+frozen-thawed+sheep+demi-embryos.">Factors affecting viability of fresh and frozen-thawed sheep demi-embryos.</a> Theriogenology. 37, 713-721 (1992).</li><li>Bettencourt, E. M., Bettencourt, C. M., Silva, J. C. E., Ferreira, P., Matos, C. P., Ram&#227;o, R. J., Rocha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+rates+following+the+transfer+of+ovine+embryos+cryopreserved+using+three+protocols.">Fertility rates following the transfer of ovine embryos cryopreserved using three protocols.</a> Small Ruminant Research. 82, 112-116 (2009).</li><li>Chemineau, P., Procureur, R., Cogni&#233;, Y., Lef&#232;vre, P. C., Locatelli, A., Chupin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+freezing+and+transfer+of+embryos+from+a+bluetongue-infected+goat+herd+without+bluetongue+transmission.+Theriogenology.">Production, freezing and transfer of embryos from a bluetongue-infected goat herd without bluetongue transmission. Theriogenology.</a> 26, 279-290 (1986).</li><li>Baril, B., Casamitjana, P., Perrin, J., Vallet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+production+freezing+and+transfer+in+Angora,+Alpine+and+Saanen+goats.">Embryo production freezing and transfer in Angora, Alpine and Saanen goats.</a> Zuchthyg. 24, 101-115 (1989).</li><li>Guignot, F., Bouttier, A., Baril, G., Salvetti, P., Pignon, P., Beckers, J. F., Touz&#233;, J. L., Cogni&#233;, J., Traldi, A. S., Cogni&#233;, Y., Mermillod, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vitrification+method+allowing+direct+transfer+of+goat+embryos.">Improved vitrification method allowing direct transfer of goat embryos.</a> Theriogenology. 66, 1004-1011 (2006).</li><li>Nowshari, M. A., Holtz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+goat+morulae+to+blastocysts+before+freezing.">In vitro culture of goat morulae to blastocysts before freezing.</a> Theriogenology. 44, 983-988 (1995).</li><li>Machatkova, M., Hulinska, P., Reckova, Z., Hanzalova, K., Spanihelova, J., Pospisil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+embryos+from+high+performance+cows+and+the+development+of+frozen-thawed+embryos+after+transfer:+a+field+study.">In vitro production of embryos from high performance cows and the development of frozen-thawed embryos after transfer: a field study.</a> Veterinarni Medicina. 53, 358-364 (2008).</li><li>Mart&#237;nez, A. G., Valc&#225;rcel, A., Furnus, C. C., de Matos, D. G., Iorio, G., de las Heras, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+in+vitro-produced+ovine+embryos.">Cryopreservation of in vitro-produced ovine embryos.</a> Small Ruminant Research. 63, 288-296 (2006).</li><li>Han, Y., Meintjes, M., Graff, K., Denniston, R., Zhang, L., Ziomek, C., Godke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caprine+offspring+born+from+fresh+and+frozen-thawed+in+vitro-produced+embryos.">Caprine offspring born from fresh and frozen-thawed in vitro-produced embryos.</a> Veterinary Record. 149, 714-716 (2001).</li><li>Leibo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-step+method+for+direct+nonsurgical+transfer+of+frozen-thawed+bovine+embryos.">A one-step method for direct nonsurgical transfer of frozen-thawed bovine embryos.</a> Theriogenology. 21, 767-790 (1984).</li><li>Voelkel, S. A., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ethylene+glycol+as+a+cryoprotectant+for+bovine+embryos+allowing+direct+transfer+of+frozen-thawed+embryos+to+recipient+females.">Use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females.</a> Theriogenology. 37, 687-697 (1992).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Notter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+genetic+diversity+in+livestock+populations+of+the+future.">The importance of genetic diversity in livestock populations of the future.</a> J. Anim. Sci. 77, 61-69 (1999).</li><li>Thibier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+retrieval+committee+statistics+of+embryo+transfer-+year+2008.+The+worldwide+statistics+of+embryo+transfers+in+farm+animals.">Data retrieval committee statistics of embryo transfer- year 2008. The worldwide statistics of embryo transfers in farm animals.</a> Embryo Transfer Newsletter. 27, 13-19 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Da Embryonen überwiegend aus Wasser bestehen, ist es entscheidend, dass Präimplantationsembryonen ausreichend entwässert und langsam in Übereinstimmung mit dem Protokoll gekühlt werden hier beschrieben, um die intrazelluläre Bildung von Eiskristallen zu vermeiden. Nach der Kühlung begonnen hat, ist es wichtig, unidirektionale Temperaturänderung aufrecht zu erhalten und Temperaturschwankungen zu vermeiden. Initiation der Bildung von Eiskristallen (&quot;Seeding&quot;) bei einer geeigneten Temperatur für die spezifischen CPA-Lösung ist von entscheidender Bedeutung. Änderungen an diesem langsamen Abkühlen / Auftauen schnelle Methode zur Präimplantationsdiagnostik Kryokonservierung von Embryonen sind die Ein-Schritt-Methode (wobei die letzte Spalte des Mediums in das Stroh beladenen Saccharose anstelle von CPA-Lösung) 19 und den direkten Transfer-Methode (in dem die Embryonen in Ethylenglykol eingefroren aufgetaut und direkt in die Gebärmutter eines Empfängers Weibchen übertragen, ohne zuerst die Ethylenglykol aus dem Embryo) 20. Zur Reduzierung des Volumens von Ethylenglykol hinterlegt in die Gebärmutter der einen direkten Transfer (DT) Empfänger weiblich, ist es ratsam, die 0,25 ml Stroh mit 6 cm Medium für die Aufbewahrung, bevor Sie fortfahren wie zuvor beschrieben zu füllen. Anzumerken ist, dass ein freiwilliger Standard in der kommerziellen Embryotransfer Industrie, Präimplantationsembryonen für DT kryokonserviert in gelb-bunten Strohhalmen eingefroren werden sollen und in gelben Bechern in den flüssigen Stickstoff-Dewar besteht. Die gewerbliche Wirtschaft hat auch spezifische Kennzeichnungsvorschriften für alle kryokonservierten Embryonen, die befolgt werden sollten. Eine Alternative zu dieser Methode ist, Verglasung 21, ein Nicht-Gleichgewichts-Methode der Kryokonservierung, wo eine höher konzentrierte (6-8 M) CPA Lösung abgekühlt ultra-schnell wodurch die CPA-Lösung von Flüssigkeit zu einem &quot;gläsernen&quot; Staates ohne Eis zu ändern ist Kristallbildung. Vitrification ist wahrscheinlich besser geeignet für die Kryokonservierung von Embryonen, die weniger fortgeschritten als entwicklungspolitisch kompakten Morula aufgrund ihrer erhöhten Temperaturempfindlichkeit sind. Diese Technik hat sich die Anwendung für die Erhaltung der einzigartigen Keimplasma Ressourcen 22, sowie auf die internationalen Handels-Embryo-Transfer-Industrie, wo mehr als 55% der rund 500.000 Rinder Präimplantationsembryonen im Kalenderjahr 2008 übertragen wurden kryokonserviert. 23

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> BioLife einfrieren Medium </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C18, C18A </td><td> 1,5 M Ethylenglykol </td></tr><tr><td> Emcare Ethylenglykol freeze-Lösung </td><td> ICPBio Reproduction </td><td> IC8, IC10 </td><td> 1,5 M Ethylenglykol </td></tr><tr><td> Vigro Ethylenglykol freeze plus </td><td> Bioniche Tiergesundheit </td><td> EVM835 </td><td> 1,5 M Ethylenglykol </td></tr><tr><td> Emcare 10% Glycerin-Lösung einfrieren </td><td> ICPBio Reproduction </td><td> IC12 </td><td> 1,34 m Glycerin </td></tr><tr><td> Emcare 1 M Saccharose Tauwetter </td><td> ICPBio Reproduction </td><td> IC16 </td><td> 1,0 M Saccharose </td></tr><tr><td> Vigro Ein-Schritt-Tau- </td><td> Bioniche Tiergesundheit </td><td> EVM247, EVM847 </td><td> 1,0 M Saccharose </td></tr><tr><td> Vigro Tauwetter 123 plus </td><td> Bioniche Tiergesundheit </td><td> EVM248, EVM848 </td><td> 5%, 2,5%, 0% Glycerin mit 0,5, 0,5, 0,6% Saccharose </td></tr><tr><td> Emcare CSU Auftauset </td><td> ICPBio Reproduction </td><td> IC20 </td><td> 6%, 3%, 0% Glycerin mit 10,3% Saccharose </td></tr><tr><td> BioLife Halten und Übertragungsmedium </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C15, C15A </td><td> modifizierten PBS mit 0,4% BSA (Rinderserumalbumin) </td></tr><tr><td> Emcare Holding-Lösung </td><td> ICPBio Reproduction </td><td> IC2, IC4, IC6 </td><td> 0,4% BSA (Rinderserumalbumin), MOPS-Puffer (inert Zwitterionen) </td></tr><tr><td> Vigro Holding sowie </td><td> Bioniche Tiergesundheit </td><td> EVM024, EVM824 </td><td></td></tr><tr><td> SYNGRO Halten Medium </td><td> Bioniche Tiergesundheit </td><td> ESM024, ESM224, ESM828 </td><td> enthält Hyaluronsäure, keine Erzeugnisse tierischen Ursprungs </td></tr><tr><td> BioLife modifizierten D-PBS </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C06 </td><td> modifizierten Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung </td></tr><tr><td> BioLife BSA Fraktion V </td><td> Agtech, Inc. </td><td> B09 </td><td> lyophilisiert Rinderserumalbumin Fraktion V </td></tr><tr><td> BioLife Antibiotika-Antimykotikum </td><td> Agtech, Inc. </td><td> B01 </td><td> Amphotericin-B, Penicillin G, Streptomycin-Sulfat </td></tr><tr><td> BioLife Trypsin-Kit </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C22A </td><td> 25 g lyophilisierte Trypsin, steriles Wasser, sterile D-PBS </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Bezeichnung des Geräts </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Biol-Cool kontrollierter Geschwindigkeit Gefrierschrank </td><td> FTS-Systeme </td><td> BC-IV -40 </td><td> Methanol Bad Gefrierfach </td></tr><tr><td> Freeze-Control gesteuert Rate Gefrierschrank </td><td> Cryologic </td><td> CL2200 </td><td> Flüssiger Stickstoff Gefrierschrank </td></tr></tbody></table>

cryopreservation of preimplantation embryos of cattle, sheep, and goats

Präimplantationsembryonen von Rindern, Schafen und Ziegen können kurz-oder langfristige Lagerung kryokonserviert werden. Präimplantationsembryonen bestehen überwiegend aus Wasser, und die Vermeidung von intrazellulären Bildung von Eiskristallen während der Kryokonservierung Prozess ist von entscheidender Bedeutung, um Embryo Lebensfähigkeit zu erhalten. Eines kryoprotektive Agent (CPA), wie Ethylenglykol (EG) oder Glycerin (Glycerin) zu einem osmotischen Gradienten, dass zelluläre Dehydratation erleichtert erstellen - Embryonen werden in einer hypertonischen Lösung (1,5 M 1,4) platziert. Nach Embryonen osmotische Gleichgewicht erreicht in der CPA-Lösung, werden sie einzeln in der hypertonischen CPA-Lösung in 0,25 ml Kunststoff-Strohhalme zum Einfrieren eingelegt. Die Embryonen werden in einer kontrollierten Geschwindigkeit Gefrierschrank bei einer Temperatur von -6 ° C platziert Bildung von Eiskristallen in der CPA-Lösung rund um den Embryo induziert, und die Kristallisation bewirkt eine Erhöhung der Konzentration von CPA außerhalb des Embryos, was zu weiteren zellulären Dehydrierung. Die Embryonen werden mit einer Rate von 0,5 ° C / min abgekühlt, so dass weitere Austrocknung, auf eine Temperatur von -34 ° C, bevor sie in flüssigem Stickstoff (-196 ° C) getaucht. Kryokonservierten Embryonen müssen vor aufgetaut werden, um an einen Empfänger (Surrogat-) Frau zu übertragen. Straws mit den Embryonen aus dem flüssigen Stickstoff-Dewar, in Raumtemperatur Luft für 3 bis 5 sec gehalten wird, entnommen und in einem 37 ° C Wasserbad für 25 bis 30 sec. Embryonen kryokonserviert in Glycerin werden in eine 1 M Lösung von Saccharose für 10 min zur Entfernung der CPA vor der Übertragung an einen Empfänger (Surrogat-) Frauen gelegt. Embryonen kryokonserviert in EG, jedoch auch direkt in die Gebärmutter eines Empfängers übertragen werden.

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Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Präimplantationsdiagnostik Embryonen können nach der Platzierung in eine hypertonische Lösung kryoprotektive kryokonserviert werden, um zelluläre Dehydratation führen. Nach Äquilibrierung, ist die Bildung von Eiskristallen in der Lösung um den Embryo induziert. Die weitere Entwässerung erfolgt wie der Embryo wird langsam auf Temperaturen unter Null vor dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff für die Lagerung gekühlt.

Kryokonservierung von Präimplantationsembryonen von Rindern, Schafen und Ziegen

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

cryopreservation-of-preimplantation-embryos-of-cattle-sheep-and-goats

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K Aufrufe.  Iowa State University. Präimplantationsdiagnostik Embryonen können nach der Platzierung in eine hypertonische Lösung kryoprotektive kryokonserviert werden, um zelluläre Dehydratation führen. Nach Äquilibrierung, ist die Bildung von Eiskristallen in der Lösung um den Embryo induziert. Die weitere Entwässerung erfolgt wie der Embryo wird langsam auf Temperaturen unter Null vor dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff für die Lagerung gekühlt.

Serie: Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection von 6,5 dpc muriner Embryonen

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Forschung

Biologie

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Sammlung und Kryokonservierung von Oozyten Hamster und Maus Embryonen

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Upright Imaging von Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Kryokonservierung von Maus Embryonen durch Ethylen-Glykol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierung der Kryokonservierung von Korallenspermien bedrohter Korallenarten

A Semi-Automated Workflow for the Cryopreservation of Coral Sperm to Support Biobanking and Aquaculture

Coral reefs are facing a crisis as the frequency of bleaching events caused by ocean warming increases, resulting in the death of corals on reefs around the world. The subsequent loss of genetic diversity and biodiversity can diminish the ability of coral to adapt to the changing climate, so efforts to preserve existing diversity are essential to maximize the resources available for reef restoration now and in the future. The most effective approach to secure genetics long-term is cryopreservation and biobanking, which permits the frozen storage of living samples at cryogenic temperatures in liquid nitrogen indefinitely. Cryopreservation of coral sperm has been possible since 2012, but the seasonal nature of coral reproduction means that biobanking activities are restricted to just a few nights per year when spawning occurs. Improving the efficiency of coral sperm processing and cryopreservation workflows is therefore essential to maximizing these limited biobanking opportunities. To this end, we set out to optimize cryopreservation processing pathways for coral sperm by building on existing technologies and creating a semi-automated approach to streamline the assessment, handling, and cryopreservation of coral sperm. The process, which combines computer-assisted sperm analysis, barcoded cryovials, and a series of linked auto-datasheets for simultaneous editing by multiple users, improves the efficiency of both sample processing and metadata management in the field. Through integration with cross-cutting research programs such as the Reef Restoration and Adaptation Program in Australia, cryopreservation can play a crucial role in large-scale reef restoration programs by facilitating the genetic management of aquaculture populations, supporting research to enhance thermal tolerance, and preventing the extinction of coral species. The described procedures will be utilized for coral cryopreservation and biobanking practitioners on reefs worldwide and will provide a model for the transition of cryopreservation technologies from research laboratories to large-scale applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Entwicklung effizienter Kryokonservierungs- und Biobanking-Technologien für die globale Wiederherstellung von Riffen

This protocol describes a semi-automated pathway to improve the efficiency and capacity of processing and cryopreservation of sperm from threatened coral species, aiming to secure genetic diversity and support reef restoration efforts.

Ein halbautomatischer Workflow für die Kryokonservierung von Korallenspermien zur Unterstützung von Biobanking und Aquakultur

Coral reefs are facing a crisis as the frequency of bleaching events caused by ocean warming increases, resulting in the death of corals on reefs around ...