Diese Studie wurde in Zusammenarbeit mit dem National BioResource Projekt durchgeführt, das Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie, Japan.

Die allgemeine Systematik des Experiments ist in Abb. dargestellt. 1. 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Machen Sie den Basis-Medium (hier als PB1 bekannt) in einem 100 ml-Glasflasche nach der folgenden Tabelle unten: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td&gt; Glucose </td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na-Pyruvat </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3,6 </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0,9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> Penicillin G </td><td></td><td></td><td> 6,0 (ca.) </td></tr></tbody></table></li><li> Machen Sie das Ficoll-Saccharose (FS)-Lösung: <ol><li> Fügen Sie den folgenden Chemikalien zu 14 ml PB1 Lösung in einer 50 ml Tube. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 3,424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42.0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Mix Ficoll 70 und Saccharose in PB1-Lösung und gut schütteln, bis sie vollständig gelöst ist. </li><li> Nach Prüfung der vollständigen Auflösung vor, fügen BSA auf der Oberfläche der Lösung und hält sie4 ° C bis BSA vollständig gelöst ist (&gt; 4 Stunden oder über Nacht). </li></ol></li><li> Machen Sie den Gleichgewichts-Lösung (EFS20) und die Verglasung Lösung (EFS40) in einem 50 ml-Tube: <ul><li> EFS20: 20% (v / v) Ethylenglykol, 24% (w / v) Ficoll und 0,4 mol / L Saccharose in PB1 mit BSA </li><li> EFS40: 40% (v / v) Ethylenglykol, 18% (w / v) Ficoll und 0,3 mol / L * Saccharose in PB1 mit BSA * Bei Embryonen aus der BALB / c oder ICR-Stamm, erhöhen die Konzentration von Saccharose zu 0,9 mol / L Saccharose, weil sie empfindlicher auf 6 cryodamage sind. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 Lösung </td><td> EFS40 Lösung </td></tr><tr><td> Ethylenglykol </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> FS-Lösung </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Sterilisation der Lösung durch Filtration mit einem 0,45 um filter. Machen Aliquots in 5 ml Polystyrol-Röhrchen und lagern bei 4 ° C. Sie können für ca. 6 Monate verwendet werden. </li><li> Vorbereitung der Embryo Auftauen Lösung mit 0,75 M Saccharose (TS1) <ol><li> Lösen Sie 7,7 g Saccharose in PB1 (hergestellt in Schritt 1,1) und bringen das Gesamtvolumen auf 30 ml. Mix durch leichtes Schütteln, bis Saccharose vollständig gelöst ist. </li><li> Add 90 mg BSA auf die Oberfläche der Lösung und lassen Sie es stehen bis zur vollständigen Auflösung. </li><li> Sterilisation der Lösung durch Filtration. </li><li> Aliquotieren und lagern bei 4 ° C. Sie können für etwa 1 Monat verwendet werden. </li></ol> Hinweis: TS1 kann auch aus kommerziell erhältlichen M2 vorbereitet werden. <ol start="6"><li> Lösen Sie 7,7 g Saccharose in M2 und bringen das Gesamtvolumen auf 30 ml. </li><li> Mix durch leichtes Schütteln, bis Saccharose vollständig gelöst ist. </li><li> Sterilisation der Lösung durch Filtration. </li><li> Aliquotieren und lagern bei 4 ° C. Sie können für etwa 1 Monat verwendet werden. </li></ol></li><li> TS2 (Auftauen Lösungmit 0,25 M Saccharose): <ol><li> 10 ml TS1 mit 20 ml Volumen von PB1 oder M2, als angemessen. </li><li> Aliquotieren und lagern bei 4 ° C. Sie können für etwa 1 Monat verwendet werden. </li></ol></li></ol> 2. Verglasung von 2-Zellen muriner Embryonen <ol><li> Bereiten Sie 2-Zellen-Maus-Embryonen durch natürliche Paarung oder konventionelle In-vitro-Fertilisation. </li><li> Aliquot 50 pl EFS40 in ein Kryoröhrchen. Jenseits, führen den Rest der Verglasung Verfahren bei der Raumtemperatur. </li><li> Aliquot 50 ul EFS20 auf dem Boden einer 35 mm oder 60 mm Kunststoff-Petrischale. </li><li> Übertragen Sie bis zu 30 Embryonen EFS20 mit einer Glaskapillare mit nur den Mindestbetrag des Kulturmediums. Starten Sie einen Timer für 2 min. Hinweis: Legen Embryonen auf der Unterseite des Tropfens. Dies macht eine effiziente Entwässerung von Embryonen. Überprüfen Sie die Morphologie der Embryonen, die durch ein Stereomikroskop. Dehydrated Embryonen zeigen eine geschrumpfte Morphologie, wie in Abb. gezeigt. 2A.Wenn sie nicht dehydriert genug sind, für mehr 1 oder 2 min warten. </li><li> Bei ca. 1,5 min, nehmen Sie den Embryonen aus dem EFS20 Tropfen nur mit der minimalen Menge der Lösung. Übertragen Sie sie auf EFS40 in der Kryoröhrchen in Schritt 2.1 vorbereitet. Hinweis: Für die besten Ergebnisse erzielen Sie, den Zeitpunkt der Abholung Embryonen, so dass alle Embryonen können in EFS40 bei rund 2 min übertragen werden. </li><li> Warten Sie 1 min. </li><li> Legen Sie die Kryoröhrchen direkt in flüssigen Stickstoff (LN 2). </li></ol> 3. Auftauen Vitrified 2-Zellen muriner Embryonen <ol><li> Vor dem Auftauen ein Gericht zubereiten, mit 10 ul Tropfen Embryo Nährboden für aufgefundenen Embryonen (siehe Schritt 3,13). Decken Sie die Schüssel mit Öl und in eine CO 2-Inkubator bis zur Verwendung. Hinweis: Obwohl alle Medien für die Routine Embryokultur in diesem Experiment verwendet werden können, empfehlen wir Medien mit höherer Osmolarität wie M16 Medium. </li><li> Warm TS1 bis 37 ° C. </li><li> Setzen Sie auf eine Gesichtsmaske und Kryo. Öffnen Sie die LN 2 tank und Abrufen einer Kryoröhrchen mit Embryonen. </li><li> Schnelles Öffnen der Spitze der Tube und entsorgen LN 2. Warten Sie 30 Sek. TS1 vor dem Einfrieren zu verhindern um den nächsten Schritt. </li><li> Verwenden Sie ein 1000ul Pipette auf 850 ul von TS1 (37 ° C) in die Röhre hinzu und mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren (etwa zehnmal in 25 Sekunden), bis die Lösung gleichmäßig gelöst ist. </li><li> Übertragen Sie die gesamte Volumen der Röhre zu einem Kunststoff 60 mm Petrischale (oder einem Uhrglas) (Abb. 3A). Hinweis: Die Embryonen sollte bei Raumtemperatur (22-25 ° C) behandelt werden, bis sie in einem CO 2-Inkubator bei Step 3,14 platziert werden. </li><li> Starten Sie einen Timer für 3 min. </li><li> Mit rund 2 min in TS1, schütteln die Schale, bis das Medium mit Embryonen über die Oberfläche der Schale (Abb. 3B) verteilt ist. Hinweis: Dies wird dazu beitragen die Embryonen nach unten gehen, weil sie nahe an der Oberfläche schwimmen, wenn sie TS1 übertragen. </li><li> Legen Sie drei 50 ul Tropfen TS2 auf the-Spiegel (Abb. 3C). </li><li> Nach 3 min in TS1, überprüfen Sie die Morphologie der Embryonen, die durch ein Stereomikroskop, sie sollten leicht geschrumpft sein. Siehe die Morphologie der Embryonen in den früheren (Abb. 2B) und später (Abb. 2C) in TS1. Hinweis: Wenn die Embryonen noch geschwollen, halten sie in TS1 mehr 1 bis 3 min. </li><li> Nehmen Sie den Embryonen und übertragen Sie sie auf den ersten Tropfen TS2 (Abb. 3D). Starten Sie einen Timer für 3 min </li><li> Nach 3 min-Embryonen in die zweite und dann die dritte Tropfen (Abb. 3E). </li><li> Übertragen Sie die Embryonen in das Kulturmedium in Schritt 3.1 vorbereitet. Die Embryonen werden in die Form der Abb.. 2D. </li><li> Legen Gericht in einem CO 2-Inkubator. Etwa 10 min später-Embryonen in die nächste Tropfen Kulturmedium zu waschen Saccharose, übernommen wurde von TS2 durchgeführt. </li><li> Weiter Kultur in einem CO2-Inkubator bis Embryotransfer. Hinweis: Transfer Embryos zu den Eileitern des Empfängers Weibchen am Tag nach dem Auftauen. Lange Kultur in vitro zu einem Rückgang der Lebensfähigkeit der Embryonen in einigen Stämmen von Mäusen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: In vitro - und In-vivo-Entwicklung von Embryonen nach dem Auftauen ist in den Tabellen 1 und 2 dargestellt. Die Vorteile dieses Protokolls sind die hohe Überlebensfähigkeit der Embryonen nach dem Auftauen und der breiten Anwendbarkeit auf verschiedene Stämme von Mäusen. <table border="1"><tbody><tr><td> Belastung </td><td> Gesamtzahl der Röhren </td><td> Anzahl der Embryonen verglaste </td><td> Recovered (Nr. (%)) </td><td> Morphologisch normalen (Nr. (%)) </td><td> Entwicklung zu Blastozysten (Nr. (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / cA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. In vitro-Entwicklung von keramisch aufgetauten Embryonen in gemeinsamen Mausstämme <table border="1"><tbody><tr><td> Zustand von Embryonen </td><td> Anzahl der Empfänger Weibchen </td><td> Anzahl der transferierten Embryonen </td><td> Nidationsstellen (Nr. (%)) </td><td> Live-Nachkommen (Nr. (%)) </td></tr><tr><td> Frisch </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Verglaste </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. In vivo-Entwicklung von keramisch aufgetauten Embryonen in C57BL/6J-Mäuse. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die allgemeine Systematik des Versuchs einschließlich der Äquilibrierung Verglasung und Auftauen von Embryonen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Morphologie der Embryonen bei jedem Schritt nach dem Auftauen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" /> Abbildung 3. Auftauen von Embryonen. Alle Vorgänge werden bei Raumtemperatur durchgeführt. (A), hinzufügen 850 ul von TS1 (37 ° C) in eine Kryoröhrchen und Transfer das gesamte Volumen der Lösung in die Kryoröhrchen auf einer Plastikschale. Zu diesem Zeitpunkt sehen die Embryonen geschwollen wie in Abb. gezeigt. 2B. (B), Spread der Lösung über die Oberfläche der Schale durch leichtes Schütteln. (C), Place drei 50 ul Tropfen TS2 auf der Plastikschale. (D), Transfer der Embryonen in den ersten Tropfen TS2. Nach 3 min, sehen die Embryonen shurunken wie in Abb. gezeigt. 2C. (E), Transfer ihnen seriellely in den verbleibenden TS2 Tropfen und dann in das Kulturmedium.

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	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196&#176;+and+-269&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196&#176; and -269&#176;C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center.">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li><li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species.">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li><li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution,+without+appreciable+loss+of+viability.">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification.">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li><li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method.">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li><li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages.">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li><li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos.">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Seit dem ersten Bericht des Maus-Embryo Verglasung von Rall und Fahy in 1985 2 wurden mehrere technische Verbesserungen vorgenommen, um die Überlebensfähigkeit der Embryonen nach dem Auftauen zu erhöhen. Einer der erfolgreichsten Modifikationen wurde durch Verwendung von Ethylenglykol als Frostschutzmittel wegen ihrer geringen Toxizität und hohe Membran-Permeabilität erreicht. Solche Vorteile ermöglichen es uns, das Einfrieren von Embryonen bei Raumtemperatur 4 Griff, andere Verglasung Methoden erfordern Embryo Übergabe bei kühleren Temperaturen und sind nicht immer für einige Stämme von Mäusen mit BALB / c 6. Die erste Ethylenglykol-Basis Verglasung wurde von Kasai et al. im Jahr 1990 5,7. Da die ursprüngliche Methode für Kunststoff-Strohhalme als Container optimiert wurde, haben wir etwas das Protokoll für Kryoröhrchen, die leichter zugänglich in den Laboratorien und widerstandsfähiger gegen körperliche Schäden sind modifiziert. Daher kann die Verglasung hier beschriebene Methode applicable zu vielen Labors mit Mäusen als wissenschaftlicher Modelle. Die gleiche Methode kann auch für Maus-Embryonen im Morula und Blastozyste Stufen 8 und Rattenembryonen 9 verwendet werden. Allerdings haben wir vor kurzem festgestellt, dass die Qualität der Kryoröhrchen kann die Überlebensrate von Embryonen nach dem Einfrieren und Auftauen zu beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Innenseite der Kryoröhrchen für seine Glätte vor Verglasen Embryonen (z. B., siehe Tabelle auf der spezifischen Reagenzien und Geräte) zu untersuchen. Vitrification Methoden haben viele Vorteile gegenüber herkömmlichen langsamen Einfrieren Methoden, aber sie inhärent haben einen Nachteil in Bezug auf Transport-Zweck. Als verglaste Embryonen bei unter -120 gehalten werden sollten ° C, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten, sind trocken Verlader in der Regel für ihre sicheren Transport verwendet. Dry Verlader sind schwer und sperrig, und ihre Hin-und Rückfahrt ist teuer, vor allem für internationale Transporte. Wir sind jetzt entwickelt derzeit eine neue Verglasung Methodedie verglaste Embryonen können auf Trockeneis gelagert werden (ca. -80 ° C) für mindestens 7 Tage 10. Diese Methode sollte die Verglasung der nächsten Generation werden.

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Ethylenglykol </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sub&gt; O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6 H 2 O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16-Medium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2-Medium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Cryotube </td><td> Sumitomo Bakelite </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Kryo-Vial&quot; </td></tr></table>

cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification

Kryokonservierung von Maus-Embryonen ist eine technologische Basis, die biomedizinischen Wissenschaften unterstützt, da viele Stämme von Mäusen durch genetische Modifikationen hergestellt worden sind und die Zahl ist konstant steigt von Jahr zu Jahr. Seine technische Entwicklung begann mit langsamen Einfrieren Methoden in den 1970er Jahren 1, dann durch Verglasung Methoden in den späten 1980er Jahren 2 entwickelt gefolgt. Im Allgemeinen ist die letztere Technik den Vorteil, ihre Schnelligkeit, Einfachheit und hohe Überlebensfähigkeit der Embryonen gewonnen. Allerdings sind die Frostschutzmitteln enthaltene hochgiftige und können nachfolgende Entwicklung des Embryos beeinflussen. Daher wurde die Technik nicht für bestimmte Stämme von Mäusen, auch wenn die Lösungen bis 4 ° C abgekühlt, um die toxische Wirkung beim Embryo Handling zu mildern. Am RIKEN BioResource Center, sind mehr als 5000 Mausstämme mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen und Phänotypen 3 gehalten, und deshalb haben wir eine Verglasung te optimiertchnique, mit denen wir Embryonen aus vielen verschiedenen Stämmen von Mäusen Kryokonservierung, mit den Vorteilen der hohen Embryo Überleben nach Verglasung und Auftauen (oder Verflüssigung, genauer gesagt) bei Umgebungstemperatur Temperatur 4. Hier präsentieren wir eine Verglasung Methode zur Maus-Embryonen, die erfolgreich an unserem Zentrum eingesetzt. Die Kryokonservierung Lösung enthält Ethylenglykol anstelle von DMSO, um die Toxizität von Embryonen 5 zu minimieren. Es enthält auch Ficoll und Saccharose für die Prävention von Entglasung und osmotische Anpassung, bzw.. Embryonen können bei Raumtemperatur behandelt und übertragen in flüssigen Stickstoff innerhalb von 5 min. Da die ursprüngliche Methode für Kunststoff-Strohhalme als Container optimiert wurde, haben wir etwas das Protokoll für Kryoröhrchen, die leichter zugänglich in den Laboratorien und widerstandsfähiger gegen körperliche Schäden sind modifiziert. Wir beschreiben auch die Verfahren nach dem Auftauen verglaste Embryonen im Detail, weil es eine kritische ste istp für eine effiziente Rückgewinnung von lebenden Mäusen. Diese Methoden wäre es hilfreich, Forscher und Techniker, die Erhaltung der Mausstämme für den späteren Gebrauch müssen in einem sicheren und kostengünstige Weise.

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Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Eine Ethylenglykol-Basis Verglasung Methode zur Maus-Embryonen beschrieben. Es ist vorteilhaft, andere Methoden in ihrer Einfachheit und niedrigen embryonalen Toxizität, und kann daher weitgehend auf viele Stämme von Mäusen, einschließlich Inzucht-und Gen-veränderten Mäusen.

Kryokonservierung von Maus Embryonen durch Ethylen-Glykol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection von 6,5 dpc muriner Embryonen

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Forschung

Biologie

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E15 muriner Embryonen

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Sammlung und Kryokonservierung von Oozyten Hamster und Maus Embryonen

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Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi-Interferenz durch dsRNA Injektion in Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Kryokonservierung von Präimplantationsembryonen von Rindern, Schafen und Ziegen

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Gentransfer in Hühnerembryonen durch Ältere<em&gt; Ex ovo</em&gt; Die Elektroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...