Die Autoren danken insbesondere Deborah Harris und Danielle MacKay. Unterstützung für diese Arbeit wurde von der Fakultät für Biologie und dem College of Arts and Sciences der CWRU Verfügung gestellt und durch HHMI Förderkennzeichen 52005866 zur Unterstützung von Undergraduate-Ausbildung in den biologischen Wissenschaften.

1. Imaging-Methodik <ol><li> Melt Glyzerin-Gelatine in einem 55 ° C Grad Wasserbad für 20-30 Minuten, bis es eine homogene Flüssigkeit wird. Swirl, aber nicht die Flasche schütteln, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. </li><li> Während das Gelee schmilzt, eine dünne Schicht von Glycerin mit einem Kimwipe auf einen sauberen Glasobjektträger (optional). </li><li> Pipette 1 bis 1,5 ml geschmolzenem Glyzerin-Gelatine mit einem Schnitt P1000 Pipettenspitze auf der Oberfläche der Folie, um eine dünne erste Schicht zu erzeugen. Pipette vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. </li><li> Lassen Sie das Gelee erstarren für 5 min auf einer horizontalen Fläche, dann die Folie bei -20 ° C für 5 min und fahren Sie mit Embryo Ausrichtung. Alternativ Abdeckung der Folie mit Saran Wrap und legen Sie sie bei 4 ° C für bis zu 5 Tage. </li><li> Pipette einen kleinen Tropfen gefärbten Embryonen in 70% Glycerin / PBS oder andere Antifade Glycerin-Basis Montage Medien (zB Slowfade oder Vectashield) auf der Seite des Gelee Betten. </li><li> Begin pre-Ausrichtung der Embryonen, die durch individuell ihre Übertragung aus dem Drop auf das Gelee Oberfläche. Übertragen Sie sie mit einer schrägen Injektionsnadel, mit dem schrägen Seite wie ein Löffel. </li><li> Rund Ort des Embryos entlang von 2 bis 3 Spalten. Wenn ein Embryo in die Nadel stecken bleibt, rühren Sie ihn in der Dropdown mit den anderen Embryonen, um sie freizugeben. Verschwenden Sie keine Zeit sorgfältig richtet sie an dieser Stelle. Lassen Sie etwas Platz zwischen den Spalten. </li><li> Richten Sie die Embryonen, indem sie horizontal auf dem Gelee Medium mit Hilfe der Injektionsnadel. Während Sie, richten Sie die Köpfe und Schwänze in die gleiche Richtung. Machen Sie sie parallel zueinander entlang der Spalte. Entfernen Sie überschüssiges PBS Glycerin als einen Weg mit einem Stück gedreht Kimiwipe links. Hinweis: Überschüssige Glycerin verursacht Embryonen zu locker eingeschlossen in Gel, wodurch die Trennung der beiden Gelee Schichten, so dass es schwierig zu schneiden und zu montieren. Umgekehrt wird das Entfernen zu viel Glycerin trocken und flach Embryonen. </li><li> Verwenden Sie einen Schnitt gelber Spitze, eine dünne Schicht von Gelee über die Embryonen (50-150 ul, je nachdem wie viele ausgerichtet wurden) zu verbreiten. </li><li> Legen Sie gleiten in -20 ° C Gefrierschrank für 10-20 min oder lagern Sie es bei 4 ° C über Nacht. Stellen Sie sicher, das Gelee ist völlig starr vor dem Schneiden. Andernfalls wird der Block von Embryonen sehr schwierig sein, Verbrauchsteuern. Die besten Ergebnisse für das Schneiden sind am nächsten Tag erhalten. </li><li> Unter einem Binokular, verwenden Sie eine Rasierklinge vollständig durchschnitten das Gelee auf beiden Seiten der ausgerichteten Embryonen. Halten Sie die Rasierklinge in einem 90 ° Winkel gerade Schnitte zu machen. Die Schnitte sollten sehr nahe an den vorderen und hinteren Pole des Embryos in der Nähe, um überschüssige Gelee, das Bildgebung behindern könnten vermieden werden. </li><li> 100-200 ul kalter PBT (4 ° C, PBS +0,1% Tween 20) neben der Schnitte und sorgfältig abkratzen das Gelee zwischen Embryonen mit einem Spatel. Hinweis: Das Waschmittel in PBT hilft das Entfernen des Gelee aus der Folie ohne Beschädigung des Embryos. </li><li> Mit einer Nadel, übertragen Sie die Block-Gelee mit eingebetteten Embryonen zu einem sauberen Objektträger zur weiteren Schnitt. Cut kleinere Blöcke mit 5-7 Embryos. Verwenden Sie PBT, um leicht die Gelee-Block zu bewegen. Alternativ, setzen Sie den Block auf einer trockenen Glasoberfläche zu lassen, um das Glas, das mehr Stabilität für präzise Beschneiden der Gelee, wenn nötig schafft befestigen. </li><li> Flip aufrechte die Embryonen in die Gelee mit Hilfe einer Rasierklinge und einer Nadel eingebettet. Für die Visualisierung unter dem Mikroskop, die entweder mit einem der beiden unten angegebenen Schritte aus, abhängig von der Art des Stativs verwendet wird. </li><li> Inversen Mikroskop: Platz beendete Embryo Blöcke auf einen langen Deckglas mit Embryonen in eine aufrechte Position. Stellen Sie sicher, dass die Seite des Embryos mit der geringsten Menge von Gelee wird in engeren Kontakt mit Ziel sein. </li><li> Aufrechten Mikroskop: make zwei Stapel mit vier Nr. 1 Deckgläser mit Sekundenkleber verklebt als &quot;unterstützt&quot; verwendet werden und statt der Embryo-Block in Glycerin zwischen den &quot;unterstützt&quot;. Brücke der Stapel mit einem langen Deckglas. </li><li> Für konfokale Analyse, Überprüfung der Arbeitsabstand der Ziele, die verwendet werden, um herauszufinden, ob man sich vorstellen kann den ganzen Weg durch den Embryo oder nur teilweise. Zum Beispiel, D. melanogaster Embryonen ~ 0,55 mm in der Länge und kann vollständig abgebildet werden mit Hilfe eines Zeiss 20x Plan-Apo oder 40x LD Neo-Fluor Ziel. Die folgende Website bietet Informationen zu verfügbaren Zeiss Ziele und gibt Ihnen die Möglichkeit, Ziele nach Arbeitsabstände Suche: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Repräsentative Ergebnisse Da die Embryonen links intakt sind, kann diese Methode verwendet, um präzise Messungen der Embryo Größe und Abstände zwischen Genexpressionsmuster ergreifen. In Abbildung 1 zeigen wir eine Blastodermstadium Embryonen mit der Kernfärbung DAPI (blau), Anti-Dorsal-Protein (rot), sog mRNA (gelb) und sna mRNA (grün) gefärbt. Morphologische Verarbeitungses kann wie Invagination des Mesoderms (Abb. 2A, B) und die Migration von mesodermalen Zellen (Abb. 3 und 4) visualisiert werden mit dieser Methode. Verschiedene Z-Positionen entlang der DV-Achse kann durch Änderung der Fokusebene erhalten werden, wie in den Abbildungen 2-4 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Upright optische Scheibe eines intakten Embryos in Blastodermstadium. Doppelfärbung für mRNA und Protein. Ziel-mRNAs für in situ Sonden (sog und SNA) und Protein, das von primärer Antikörper (anti-Dorsal) gefärbt sind in der Figur angedeutet. DAPI wurde verwendet, um die Kerne Etikett. Beachten Sie, dass die Expression des sog und sna apikal sind im Zytoplasma lokalisiert, während die Expression von Dorsal ist die Kernkraft. Starke Signale aus sog entstehenden Transkripte, die in den Kernen liegen auch bei dieser Vergrößerung zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Upright Bildgebung von einer intakten gastrulating Embryo. MRNA-Sonden verwendet werden und ihre jeweiligen Farben sind in der Figur angedeutet. A) Beachten Sie, dass in dieser Phase drei Gene mit gleicher Fluor (SNA, sog und dpp, in grün), gefärbt sind in räumlich getrennten Bereichen zum Ausdruck gebracht. Die einstülpende Mesoderm drückt sna, drückt die Neuroblasten Schicht ind und dem Ektoderm drückt dpp, während sog Ausdruck ist noch im ventralen Regionen des Nervensystems. B) In einem tieferen konfokalen Ebene des gleichen Embryos, bemerken wir die Basis des einstülpende Mesoderm stark drückt sna, aber die apikale Region drückt unteren Ebenen. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Upright Bildgebung von einer intakten Embryo mit Keimstreifs erweitert sog RNA (gelb);. Schnecke, ind und dpp mRNAs (grün), Dorsal-Protein (rot). Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. A) Focal-plane in der Nähe Embryo Kopf. B) Ein weiterer Schwerpunkt Flugzeug in den Kofferraum Region gleichen Embryos. Hinweis Masse von Mesodermzellen vor seitlichen Migration (vgl. Abbildung 4) liegen in der Nähe der ventralen Mittellinie auf beiden Seiten ein Keim-Band erweitert Embryo. Delaminierenden Neuroblasten sind in grün (ind und SNA) gekennzeichnet. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Upright Bildgebung von einer intakten Embryo während Keimstreifs Erweiterung sog RNA (gelb);. Schnecke, ind und dpp mRNAs (grün), Dorsal-Protein (rot). A) Man beachte die Delamination Neuroblasten aus dem Epithel (Pfeil), gebeizt sowohl für ind und sna in dieser Phase (grün). Beachten Sie auch die beschränkte Expression von sog an der ventralen Mittellinie (gelb). Expression von dpp in diesem Stadium kann bei der lateralen Seite des Embryos (Stern) zu sehen. B) Optische Abschnitt in der gleichen Embryo in A am Ende des Embryos Länge, die bis Mitte hinteren Bereich entspricht gezeigt. Die ventralen Mittellinie Zellen sind für die sog gefärbt.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

Unter Querschnitt Bilder von Drosophila Embryonen kann eine Herausforderung sein, da sie entweder eine sorgfältige Hand Dissektion der Scheiben 2 oder die Verwendung von eingebetteten Medien für Mikrotom Verarbeitung, die in der Regel nachteilig für fluoreszierende Färbungen benötigt. Alternativ können Z-Stapel in einem konfokalen Mikroskop verwendet werden, um 3D-Rekonstruktion von Schnittbildern zu machen. Es ist jedoch zeitaufwendig, mehrere dünne Scheiben Confocal für eine genaue 3D-Rekonstruktion und Bleichen Problematisch wird machen. Ein weiteres Problem bei der Abbildung Embryonen, die in Längsrichtung montiert sind die Lichtstreuung, die bei Erreichen tieferen Abschnitte des Embryos, die auch erschwert unter präzise Messungen der Fluoreszenz-Signale für die Zwecke der Quantifizierung von Proteinen oder mRNA-Expression Level 1 erfolgt ist. Selbst mit einem Zwei-Photonen-konfokalen Mikroskop, ist die Lichtstreuung noch ein Anliegen wegen der Undurchsichtigkeit der Dotter Material in der Mitte des Embryos, die Auswahl der Montage Medien für eine optimale Transparenz der Probe zu begrenzen lässt. Um diese Probleme zu umgehen, eine neue Technik namens &quot;End-on&quot; imaging der Positionierung Embryonen vertikal wurde vor kurzem zum Bild sowohl live als auch feste Proben 4 entwickelt. In diesem Papier haben wir ein neues Protokoll für vertikal montierte Embryonen, die eine einfache Erstellung und Visualisierung von festen Embryonen oder Gewebe von beliebiger Größe und Form, die mit mehreren in-situ-Sonden 3 gefärbt werden können. Unsere Methode besteht in der Verwendung einer Montageplatte Medien mit gelartige Konsistenz, die zur Ausrichtung Embryonen darin einzuhüllen ist. Cut Blöcke dieser Montage Medien mit eingebetteten Embryonen aufrecht vor der Belichtung in jeder Art von konfokalen Mikroskop positioniert werden. Durch die Einbettung der Embryonen in die Gallerte und die Positionierung vertikal, sind wir in der Lage, horizontale Querschnitte nehmen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, in denen die Zellen entlang der dorsal-ventralen Achse des Embryos gleichzeitig dargestellt werden. Dies ist eine deutliche Verbesserung für die Quantifizierung Zwecke, da Probleme der Lichtstreuung und Bleichen der Fluoreszenzfarbstoffe, die in konventionellen Z-Stapel-Rekonstruktion des längs eingebauten Embryonen tritt nun beseitigt. So ist die Quantifizierung der Genexpression oder Protein-Ebene entlang der dorsal-ventralen Achse genau, da die Zellen an den gegenüberliegenden dorsal-ventral Positionen angeordnet gleichzeitig und am gleichen konfokalen Z-Position abgebildet werden. Darüber hinaus ermöglicht das beschriebene Verfahren uns zu einem kompletten 2-D Bild über die dorsal-ventrale Achse von einem 3-D Embryo zu erhalten, ohne komplexe Berechnungen Abrollen Methoden, um Zellen an verschiedenen Positionen entlang der DV-Achse 6 zu visualisieren. Einige der kritischen Schritte umfassen die Beseitigung von überschüssigen Glycerins nach dem Ausrichten Embryonen zu vermeiden, aufgeteilt zwischen den beiden Schichten von Gelee. Allerdings, wenn die Probe zu dehydriert ist, wird das resultierende Bild wird unförmig und haben falsche Morphologie. Darüber hinaus, wenn das Gelee Medium rund um den Embryo in einem Winkel, anstatt gerade geschnitten wird, kann das resultierende Bild erscheint weniger rund und mehr eiförmige Gestalt, wegen einer falschen Positionierung der Embryonen in einem anderen Winkel als 90 Grad. Schließlich, wenn das Gelee ist nicht eng genug geschnitten, um den Embryo auf der vorderen / hinteren Enden, ist es nicht möglich, ein richtiges Bild zu erhalten, weil das Ziel der Arbeitsabstand hauptsächlich verwendet würde, um in das Gelee und nicht den Embryo zu konzentrieren. Ein weiterer wichtiger Schritt, die erforderlich sind, wenn bildgebende späten gastrulating Embryo ist sorgfältig zu sortieren Stufen von Interesse unter den Anwendungsbereich vor deren Ausrichtung. Normalerweise sind Embryonen nach morphologischen Merkmalen, die am leichtesten erkannt werden, wenn in einem Längs-Position kann in Szene gesetzt. Unter alternative Änderungen, die mit dieser Methode gemacht werden kann, ist ein Anti-Fade-Reagenz (z. B. p-Phenylendiamin oder PPD) in die zweite Schicht von Gelee zum Schutz vor Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe gehören.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycerin Jelly mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences Company</td>
<td>17998-10</td>
<td>Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss LSM 700 Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72204-02</td>
<td>Size 1 &frac12; (specific for the objectives used in this work).</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slips (for making supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherfinest</td>
<td>12-544-10</td>
<td>Use four coverslips glued with superglue. </td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td>
<td>M420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Steel back single edge industrial blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>21-401-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hypodermic needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482610</td>
<td>26 Gauge</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

upright imaging of drosophila embryos

Mehrere bekannte morphogenetischen Gradienten und zelluläre Bewegungen treten entlang der dorsal / ventral Achse des<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo. Allerdings sind die aktuellen Techniken verwendet, um solche Prozesse Blick etwas begrenzt. Das folgende Protokoll beschreibt eine neue Technik für die Montage fixiert und beschriftet<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen für koronare Betrachtung mit konfokale Bildgebung. Diese Methode besteht aus Einbettung Embryonen zwischen zwei Schichten aus Glyzerin-Gelatine Montage Medien-und Imaging-Gelee-Streifen positioniert aufrecht. Der erste Schritt für sandwiching der Embryonen ist eine dünne Bettwäsche von Glyzerin-Gelatine auf einer Folie zu machen. Als nächstes werden Embryonen sorgfältig auf dieser Fläche ausgerichtet und mit einer zweiten Schicht von Gelee. Nach der zweiten Schicht verfestigt, sind Streifen von Gelee geschnitten und gespiegelt aufrecht für die Bildgebung. Alternativen sind für die Visualisierung der Embryonen in Abhängigkeit vom Typ des Stativs eingesetzt werden beschrieben. Da alle Zellen entlang der dorsal-ventralen Achse in einem einzigen konfokalen Z-Ebene abgebildet werden, erlaubt unsere Methode eine präzise Messung und Vergleich der Fluoreszenz-Signale ohne Bleichen oder Lichtstreuung gemeinsamen 3D-Rekonstruktionen von längs eingebauten Embryonen.

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Upright Imaging of Drosophila Embryos

Hier präsentieren wir eine Montage-Protokoll für Kirchenfenster<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen in einer aufrechten Position, die Darstellung von Querschnitten durch konfokale Mikroskopie ermöglicht.

Upright Imaging von Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Upright Imaging of Drosophila Embryos

9.2K Aufrufe.  Case Western Reserve University. Hier präsentieren wir eine Montage-Protokoll für Kirchenfenster Drosophila Embryonen in einer aufrechten Position, die Darstellung von Querschnitten durch konfokale Mikroskopie ermöglicht.

Serie: Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Forschung

Biologie

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Ernte und Vorbereitung Drosophila Embryonen für die elektrophysiologische Ableitung und andere Verfahren

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Live-Präparation Drosophila Embryos: Optimierte Verfahren für das Screening Mutant Sammlungen von Antikörper-Färbung

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo-Zentrifugation von Drosophila Embryonen

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi-Interferenz durch dsRNA Injektion in Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...