Name: collection and cryopreservation of hamster oocytes and mouse embryos
Uploaded: 2009-03-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der spanischen Ministerio de Educación y Ciencia (BIO 2006-11792) und der Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437) unterstützt. Autoren möchten Marc Puigcerver und Jonatan Lucas für ihre technische Unterstützung danken, bei der Vorbereitung der Medien. Alle Mitarbeiter aus dem Servei d&#39;Estabulari ist für Tierhaltung anerkannt, und vor allem Juan Jose Martin und Javier Benito für ihre zusätzlichen Beitrag zur Aufzeichnung Teil dieses Video. NZB ist ein Fellow des portugiesischen Fundação para a Ciência e Tecnologia und SG ist ein Fellow des spanischen Ministerio de Educación y Ciencia.

Tierpflege und-verfahren wurden nach den Richtlinien und Vorschriften durch die Ethikkommission für die Tier-und Human Research der Universitat Autónoma von Barcelona, ​​Spanien zugelassen durchgeführt. I. Eizellenentnahme <ol><li> Prüfen Sie, und wählen weiblichen Hamster (Mesocricetus auratus; 8-12 Wochen alte) der Golden Syrian Belastung für das Vorhandensein einer dicken Ausfluss (postovulatorische Entladung). </li><li> Induce ausgewählten Weibchen durch intraperitoneale Injektion von 40 IE PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin), gefolgt von 40 IE hCG (humanes Chorion Gonadotropin) 60 Stunden später superovulate. </li><li> Euthanize weiblichen Hamster 16 Stunden nach der Verabreichung von hCG in einer Kohlendioxid-Kammer. </li><li> Isolieren Eileiter von den Weibchen wie in dem Video gezeigt und sie auf einen Tropfen KSOM-H-Medium. </li><li> Sammeln Oozyten-Cumulus-Komplexe durch Reißen des Eileiters Ampulle unter einem Stereomikroskop in einem Tropfen Hyaluronidase (156 U / ml) bei 37 ° C. Eizellen werden von Cumulus-Zellen in ca. 5 Minuten befreit werden. </li><li> Pick up Oozyten von Hyaluronidase und waschen Sie sie zweimal in KSOM-H-Medium. </li></ol> Für die Sammlung von Maus-Embryonen, weibliche Mäuse (Mus musculus; 6-8 Wochen alten) induziert werden, um durch intraperitoneale Injektion von 5 IU PMSG von 5 IU hCG 48 Stunden später und folgte gepaart mit männlichen Mäusen superovulate. Die Weibchen sind durch Genickbruch bei 24-26 geopfert, 44-46 oder 54-56 Stunden nach der Gabe von hCG zur Gewinnung von pronukleären, 2-Zell-oder 4-Zellen-Stadium eines Embryos beziehungsweise. Sammlung pronukleären Embryonen ist genau so, wie für Hamster-Oozyten beschrieben durchgeführt. Embryonen im 2-Zell-und 4-Zellen-Stadium werden durch Spülung der Eileiter mit KSOM-H-Medium [6] gesammelt. Hinweis: Nach diesem Protokoll etwa 20 bis 30 Eizellen / Embryonen können von jedem weiblichen gesammelt werden. II. Vorbereitung von Einfrieren und Auftauen Lösungen <ol><li> Bereiten Lösung, die ich durch Verdünnung 0,57 ml propilenglycol in 5 ml KSOM-H (1,5 M von propilenglycol). </li><li> Bereiten Auftauen Lösung durch Zugabe von 2 ml KSOM-H zu einem Schlauch mit 0,2052 g Saccharose (0,3 M Saccharose). </li><li> Bereiten Sie das Einfrieren durch Zugabe von 2 ml Lösung, die ich zu einem Schlauch mit 0,0684 g Saccharose (1,5 M von propilenglycol und 0,1 M Saccharose). </li></ol> Hinweis: Lösung I und Einfrieren und Auftauen Lösungen müssen unmittelbar vor ihrer Verwendung hergestellt werden. Allerdings können die angegebenen Mengen an Saccharose, um die Herstellung des Einfrieren und Auftauen Lösungen eingesetzt werden im Vorfeld abgewogen werden und in 3 ml-Röhrchen bei Raumtemperatur für mehrere Monate. III. Freezing-Protokoll <ol><li> Transfer-Oozyten / Embryonen aus der KSOM-H-Medium zu einem Rückgang der Lösung I und Inkubation für 7-15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten eine 90 mm Petrischale die Strohhalme, indem 90 ul Tropfen Einfrieren und Auftauen Lösungen, wie es in dem Video (1 Tropfen jeder Lösung / Stroh) gezeigt wird geladen. </li><li> Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Eizellen / Embryonen auf das Einfrieren Lösung sinkt. Hinweis: Wir in der Regel zwischen 5 bis 30 Eizellen oder Embryonen / Drop übertragen. </li><li> Bringen Sie einen Strohhalm, um einen Mund gesteuert Absaugsystem und laden Sie sie in dieser Reihenfolge: Lösung I-, Luft-, Gefrier-Drop mit der Eizellen-, Luft-, Auftau-drop, Luft. </li><li> Nachdem das Stroh eingelegt ist, halten Absaugen, bis der erste Tropfen eingeführt (Lösung I) erreicht das Polymer am oberen Ende des Strohs und dichtet diese zu beenden. Thermo-Dichtung das andere Ende des Strohs oder Siegel mit einem Kunststoff-Stopfen. </li><li> Schalten Sie die programmierbare Gefrierschrank und wählen Sie das Einfrieren Programm. Das Einfrieren Programm im Sinne dieses Protokolls ist auf der Kühlraten ursprünglich von Lassalle et al veröffentlicht wurde. [7]: <ul><li> 2 ° C / min von Raumtemperatur bis -7 ° C 0 ° C / min für 10 min bis zum Temperaturausgleich und Induktion der Aussaat zu ermöglichen (siehe unten) </li><li> 0,3 ° C / min von -7 ° C bis -30 ° C 0 ° C / min für 2 min zum Temperaturausgleich ermöglichen </li><li> 35 ° C / min von -30 ° C bis -130 ° C </li></ul></li><li> Laden Sie die Strohhalme auf die Schlitze des Inhabers der programmierbaren Gefrierfach, um sicherzustellen, dass der Teil des Strohs mit dem Tropfen Auftauen Lösung ist nach außen. Starten Sie das Einfrieren Programm. </li><li> Wenn Probentemperatur -7 ° C und die Kühlung auf Eis erreicht, eine manuelle Aussaat: Planschbecken der Zange in flüssigen Stickstoff, ziehen Sie den Halter etwas aus der Tiefkühltruhe auf den Teil der Halme mit den Tropfen Auftauen Lösung auszusetzen, und sofort Berühren dieser Teil der Halme mit der Zange. Wiederholen Sie für jeden Halter und jeden Strohhalm in die Halterung, und lassen Sie dann das Einfrieren Programm bis zum Ende laufen. </li><li> Wenn das Programm beendet ist, tauchen die Inhaber in flüssigem Stickstoff. </li><li> Entfernen Sie die Strohhalme aus demInhaber und sie auf ein markiertes gobelet. </li><li> Schließlich speichern Sie die gobelet in einem flüssigen Stickstoff-Tank. </li></ol> IV. Auftauen Protokoll <ol><li> Entfernen Sie das Stroh aus dem flüssigen Stickstoff-Tank. </li><li> Pflegen Sie die Stroh bei Raumtemperatur für 40 Sekunden. </li><li> Weichen Sie das Stroh in einem Wasserbad bei 30 ° C während 40 Sekunden. </li><li> Entfernen Sie den Stecker aus der Stroh oder schneiden Sie die thermo-versiegelte Spitze. </li><li> Leeren Sie den Strohhalm in einer 35-mm-Petrischale und vorsichtig mischen die beiden Tropfen mit dem Einfrieren und Auftauen Lösungen. </li><li> Lassen Eizellen / Embryonen in die Mischung für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Transfer-Oozyten / Embryonen zu einem frischen Tropfen KSOM-H für weitere 15 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Eizellen / Embryonen sind jetzt bereit zur weiteren Bearbeitung. </li></ol> Hinweis: Während der Schritte 6 und 7 sollten Sie sehen, dass die aufgetauten Eizellen / Embryonen langsam durch Rehydratation anschwellen. V. repräsentative Ergebnisse Der Einsatz der Kryokonservierung Protokoll hier berichteten Ergebnisse in eine Überlebensrate von ca. 95% für Hamster-Oozyten und von&gt; 90%, 85% und 80% für Maus B6CBAF1 Embryonen im pronukleären, 2-Zell-und 4-Zellen-Stadium, beziehungsweise. Wenn Mäuse-Embryonen in vitro sind in KSOM nach dem Auftauen kultiviert, sollte mindestens 70 bis 80% der Blastozysten-Stadium in optimalen Kulturbedingungen zu erreichen. Es wird empfohlen, dass Sie mit einer Kontrollgruppe (Stroh) von Oozyten / Embryonen in jedem Einfrieren Experiment und dass auch Sie Tauwetter dieser Gruppe vor dem Rest der Eizellen / Embryonen für weitere Manipulationen genutzt werden. Wenn die Überlebensraten für die Kontrollgruppe niedriger als erwartet sind, Tauwetter ein anderes Stroh aus der gleichen Charge. Wenn die Überlebenschancen für diese zweite Gruppe ebenfalls niedrig sind, werfen Sie die verbleibenden Strohhalme aus diesem Einfrieren viel.

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	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196+and+-269+&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 &#176;C.</a> Science. 178, 411-414 (1972).</li><li>Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cooling+rate,+warming+rate,+cryoprotective+agent+and+stage+of+development+on+survival+of+mouse+embryos+during+freezing+and+thawing.">The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing.</a> Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).</li><li>Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+various+low+temperatures,+cryoprotective+agents+and+cooling+rates+on+the+survival,+fertilizability+and+development+of+frozen-thawed+mouse+eggs.">Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs.</a> J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).</li><li>Schneider, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryobiological+principles+of+embryo+freezing.">Cryobiological principles of embryo freezing.</a> J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).</li><li>Vajta, G., Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cryopreservation+systems.">Improving cryopreservation systems.</a> Theriogenology. 65, 236-244 (2006).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> JoVE. 3, (2007).</li><li>Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryo+features+that+influence+the+success+of+cryopreservation+with+the+use+of+1,2+propanediol.">Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol.</a> Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santal&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+caprine+beta-lactoglobulin+transgenic+mouse+embryos.">Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos.</a> Cryobiology. 35, 290-298 (1997).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freezing+and+thawing+method+of+hamster+oocytes+designed+for+both+the+penetration+test+and+chromosome+assay+of+human+spermatozoa.">A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa.</a> Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).</li><li>Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+and+preimplantation+development+of+the+mouse+in+the+protein-free+KSOM.">Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM.</a> Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).</li></ol>

Mit diesem Protokoll Hamster-Oozyten-und Maus-Embryonen erfolgreich kryokonserviert werden. Einmal gefroren, können Eizellen / Embryonen in flüssigem Stickstoff Tanks auf unbestimmte Zeit gespeichert und wiederhergestellt werden an jedem Ort und Zeit gewünscht. Dies bietet den Vorteil, dass Proben fast einsatzbereit, wann immer erforderlich. Auf der anderen Seite kann dieses Protokoll auch verwendet, um Embryo Kryobanken aus wertvollen Mausstämme (wie transgenen Linien), wie eine kostengünstige und sichere Alternative für die Aufrecht...

<table><tbody><tr><td>Material Name</td><td>Type</td><td>Company</td><td>Catalogue Number</td><td>Comment</td></tr><tr><td>French type mini-straw 0.25 ml</td><td></td><td>Mini-tub</td><td>13407/0010</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td></td><td>Farma-Lepori, Spain</td><td>749036.4</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td></td><td>Sigma</td><td>H-3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOM-H medium</td><td></td><td></td><td></td><td>Ref. [11]</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen </td><td></td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic plugs</td><td></td><td>Mini-tub</td><td>19046</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td></td><td>Intervet, Spain</td><td>1.614/8447</td><td></td></tr><tr><td>Propilenglycol</td><td></td><td>Fluka</td><td>82280</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td>Merck</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td></td><td>Aesculap</td><td>BC-060R; BG-061R</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-sealer</td><td></td><td>SIZ</td><td>220</td><td></td></tr><tr><td>35 and 90 mm culture dishes</td><td></td><td>Nunc</td><td>153066; 150350</td><td></td></tr><tr><td>10 ml tubes</td><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>163160</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen tank</td><td></td><td>MVE, Cryogenics</td><td>XC 43/28</td><td></td></tr><tr><td>Programmable Freezer</td><td></td><td>Planner Products Ltd.</td><td>Kryo-10 Series III</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td>Aesculap</td><td>BD-331R; BD-053R; OC-020R</td><td></td></tr></tbody></table>

collection and cryopreservation of hamster oocytes and mouse embryos

Embryonen und Eizellen wurden zunächst erfolgreich mehr als 30 Jahren, kryokonserviert, wenn Whittingham<i&gt; Et al.</i&gt;<sup&gt; 1</sup&gt; Und Wilmut<sup&gt; 2</sup&gt; Gesondert beschrieben, dass Maus-Embryonen eingefroren konnte und bei -196 ° C gelagert und, ein paar Jahre später, Parkening<i&gt; Et al</i&gt;.<sup&gt; 3</sup&gt; Berichtet die Geburt des lebenden Nachkommen, die aus in-vitro-Fertilisation (IVF) von kryokonservierten Eizellen. Seitdem hat sich die Verwendung von Kryokonservierungstechniken rasch ausbreiten, um eine wesentliche Komponente in der Praxis der menschlichen und tierischen assistierten Reproduktion und in der Erhaltung der tiergenetischen Ressourcen geworden. Derzeit gibt es zwei Methoden verwendet, um Eizellen und Embryonen Kryokonservierung: Langsames Gefrieren und Verglasung. Eine Vielzahl von Ansätzen verwendet wurden, um zu versuchen, beide Techniken und Millionen von Tieren und Tausende von Kindern zu verbessern wurden von kryokonservierten Embryonen geboren worden. Jedoch schwerwiegende Mängel zugeordneten Kryokonservierung noch zu überwinden, da Eis-Kristall-Bildung, Lösung Effekte und osmotischen Schock scheinen mehrere cryoinjuries in post-aufgetaut Eizellen und Embryonen führen. Langsames Gefrieren mit programmierbaren Gefriergeräte hat den Vorteil, mit geringen Konzentrationen von Frostschutzmitteln, die meist mit chemischen Toxizität und osmotischen Schock verbunden sind, aber ihre Fähigkeit, Eis-Kristall-Bildung bei niedrigen Konzentrationen zu vermeiden, ist begrenzt. Langsames Gefrieren induziert auch Unterkühlung Effekte, die vermieden werden durch manuelle oder automatische Aussaat muss<sup&gt; 4</sup&gt;. In die Verglasung Prozess hemmen hohe Konzentrationen von Frostschutzmitteln die Bildung von Eiskristallen und führen zu der Bildung einer glasartigen verglasten Zustand, in dem Wasser verfestigt, aber nicht erweitert. Aufgrund der Toxizität von cyroprotectants bei den verwendeten Konzentrationen können Eizellen / Embryonen nur für die Gefrierschutzmittel Lösung für eine sehr kurze Zeit und in einem minimalen Volumen-Lösung ausgesetzt werden, bevor das Eintauchen der Proben direkt in flüssigem Stickstoff<sup&gt; 5</sup&gt;. In den letzten zehn Jahren hat der Verglasung werden immer beliebter, weil es eine sehr schnelle Methode, in denen keine teure Ausrüstung (programmierbar Tiefkühler) erforderlich ist. Jedoch weiterhin langsamen Einfrieren der am weitesten verbreitete Methode zur Eizelle / Kryokonservierung von Embryonen werden. In diesem Video-Artikel zeigen wir, Schritt-für-Schritt, wie zu sammeln und zu langsam einfrieren Hamster-Oozyten mit hoher post-Tau-Überlebensraten. Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um erfolgreich einfrieren und auftauen Maus-Embryonen in verschiedenen Stadien der Präimplantationsdiagnostik Entwicklung sein.

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Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

In diesem Video-Artikel präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Demonstration von Möglichkeiten zur Sammlung und Kryokonservierung Hamster-Oozyten mit hoher post-Tau-Überlebensraten. Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um erfolgreich einfrieren und auftauen Maus-Embryonen in verschiedenen Stadien der Präimplantationsdiagnostik Entwicklung sein.

Sammlung und Kryokonservierung von Oozyten Hamster und Maus Embryonen

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Aufrufe.  Universitat Autonoma de Barcelona. In diesem Video-Artikel präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Demonstration von Möglichkeiten zur Sammlung und Kryokonservierung Hamster-Oozyten mit hoher post-Tau-Überlebensraten. Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um erfolgreich einfrieren und auftauen Maus-Embryonen in verschiedenen Stadien der Präimplantationsdiagnostik Entwicklung sein.

Serie: Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

Retrieval von Maus-Oozyten

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Forschung

Biologie

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Entwicklungsbiologie

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Genetik

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

Minimale Volumenverglasung von unreifen FelineOozyten

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Kryokonservierung von Maus Embryonen durch Ethylen-Glykol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermatogonien durch ganze Hoden Nadel eingetaucht, ultra-schnelle Abkühlung

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...