Diese Arbeit wurde von der US-Cystic Fibrosis Foundation (CFF) durch ihre Struktur Consortium CFTR 3D finanziert. TR wurde von einem britischen CF Treu Stipendium und NC von einer britischen BBSRC Stipendium finanziert. Wir bekennen uns zu unserer Kollegen in der CFF CFTR 3D-Struktur Konsortium für ihre Hilfe und Beratung und für die Gestaltung der Codon-optimierten Huhn CFTR-Sequenz und Reinigung Tags.

1. Herstellung von Puffern <ol><li> Um den Bestand der 100x-Protease-Inhibitor zu machen (PI) Cocktail auflösen 96 mg AEBSF, 3,5 mg Chymostatin, 10 mg E64, 16,5 mg Leupeptin, Pepstatin 16,5 mg, 348 mg PMSF und 4 mg Bestatin in 20 ml DMSO. Stellen Sie 1 ml Aliquots und bei -20 ° C Um eine 100x Stock Benzamidin zu machen, lösen sich 720 mg in 20 ml Reinstwasser (ddH2O) und Speicher in 1 ml Aliquots bei -20 ° C. Diese Menge reicht für eine Reinigung. In allen Puffern werden PI und Benzamidin Aktien zu einem 1:100-Verdünnung eingesetzt. </li><li> Vorbereiten &quot;mPIB &#39;(0,3 M Tris pH 8, 0,3 M Saccharose, 2 mM DTT) und&quot; CFTR&#39; (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) Glycerin, 1 mM DTT) Puffer und Kälte auf 4 ° C . Vor Gebrauch hinzuzufügen 1:100 der Protease-Inhibitor-Cocktail und 1:100 Benzamidin nach dem Volumen der mPIB verwendet, um die Zellpellet zu resuspendieren (zB Einsatz 3.5 ml PI und 3,5 ml Benzamidin in einem Gesamtvolumen von 350 ml mPIB). </li><li> Bereiten solubilization Puffer. Lyso-Phosphatidyl-Glycerin-14 (LPG)-Lösungspuffer (50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) Glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, Protease-Inhibitoren (PI) und 4% (w / v) LPG) und Dodecylmaltosid (DDM) Lösungspuffer (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) Glycerin, 1 M NaCl, 1 mM DTT, Protease-Inhibitoren, 4% (w / v) DDM). Puffer können in einem Ultraschallbad (35 W, 40 kHz) mit Ultraschall behandelt werden, um mit der Verbreitung von Waschmittel zu erleichtern, aber vermeiden Vortexen des Gemisches, wie dies erzeugt Blasen. Kühle auf 4 º C vor der Verwendung. </li><li> CFTR Reinigungspuffer für den LPG-Reinigung ist 50 mM Tris, 10% (v / v) Glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w / v) LPG-14 und Proteaseinhibitoren. Planen 350 ml dieses Puffers und 150 ml des gleichen Puffers plus 1 M Imidazol. Der pH-Wert der beiden Puffer 8. </li><li> Der Puffer für die Reinigung im DDM besteht aus 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) Glycerin, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w / v) DDM. Planen 350 ml dieses Puffers und 150 ml des gleichen Puffers plus 1 M Imidazole. Der pH-Wert der beiden Puffer 8. </li><li> Für die Gelpermeationschromatographie (GPC)-Puffer LPG enthält, bereiten 50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) Glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,05% (w / v) LPG-14. GPC mit DDM bereiten Puffer von 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) Glycerin, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w / v) DDM. Alle Puffer und ddH 2 O auf der GPC-Säule verwendet wird, sollte gefiltert (0,2 &amp;mgr; m-Filter) und vor der Verwendung entgast. </li><li> SDS-PAGE-Probenpuffer (2 x die Arbeitskonzentration): 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 5% (v / v) Glycerin, 5 mM EDTA, 0,02% (w / v) Bromphenolblau. Stellen Sie 700 ul Aliquots und bei -20 ° C Vor der Verwendung, 200 ul 20% (w / v) Natriumdodecylsulfat (SDS) und 100 ml frisches 0,5 M DTT. Inkubation für mindestens 10 min mit der Probe bei Raumtemperatur vor dem Laden auf Gel. Nicht erhitzen; Dies wird das GFP denaturieren und kann dazu führen CFTR zu aggregieren. </li><li> Um Lipid-Aktien für die Rekonstitution zu machen, lösen eine 4:1 (w / w) Mischung von E. coli Lipide eind Cholesterin in Chloroform und Methanol (2:1 v / v), und trocken in eine Glasampulle unter N 2-Gas für 2 Stunden, um einen Lipidfilm zu bilden. Hinzufügen GPC-Puffer (ohne NaCl) auf eine Lipidkonzentration von 40 mg / ml und nach mit Verwirbelung und Beschallung (35 W, 40 kHz), um die Lösung zu klären. </li><li> Für den ATPase-Assay herzustellen 100x Bestände ATPase-Inhibitoren durch Auflösen SCH28080 bis 1 mM in DMSO, NaSCN bis 1 M in ddH 2 O und Oligomycin bis 2,5 mM in 100% (v / v) Ethanol. Shop bei -20 ° C 100 ml zu der ATPase-Puffer mit 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NH 4 Cl, 5 mM MgSO &amp;sub4; und 0,02% (w / v) NaN 3. Dies kann bei Raumtemperatur gelagert und für mehrere Tests verwendet werden. Eine 5 mM ATP Lager unmittelbar vor der Verwendung und auf Eis zu halten. (NB Verwenden Na 2 ATP zu hohe Hintergrundsignal von Phosphat in dem Test zu verhindern). Vorbereitung der SDS-Stop-Lösung (12% (w / v) SDS in ddH 2 O). </li><li> Für die Erkennung Chifflet vorzubereiten Puffer A (3% (w/ V) Ascorbat, 0,5% (w / v) Ammoniummolybdat, 0,5 M HCl) unmittelbar vor dem Gebrauch und Puffer B (2% (w / v) Natrium-Citrat, 2% (w / v) Natrium-meta-Arsenit, 2% (v / v) Essigsäure). </li></ol> 2. Isolierung von Hefe-Mikrosomen <ol><li> S. cerevisiae Huhn CFTR exprimieren, werden wie in O&#39;Ryan et al (2012) 14 gewachsen.. Speichern das Material aus einer 20 l-Fermentation in zwei Aliquots bei -80 ° C für bis zu 6 Monate. </li><li> Tauen Sie ein Aliquot von Zellen schnell und resuspendieren in 3 ml pro Gramm gekühlt mPIB von Zellen. </li><li> Stören Zellen in einer Kugelmühle mit Glasperlen von 425-600 Mikrometer Durchmesser. Verwenden Sie fünf 1 min Perioden der Zellaufschluss durch 1 min Ruhezeiten getrennt. (Die Ruhezeiten sind wichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht während der Unterbrechung aufgeheizt.) </li><li> Überwachung der Zellaufschluß durch Zentrifugation einer 1 ml-Probe des Zelllysats aus der Kugelmühle. Zentrifuge (12.000 × g, 4 ° C, 5 min) in einer Tisch zentrifuge. Verdünnen Sie den Überstand in 1:50 mit mPIB in einer Küvette und messen Sie die A 380. Wenn A 380&gt; 0.1, oder hat trotz mehrerer wiederholt Wulst-Prügel Zyklen gestoppt zu, mit dem folgenden Schritt fort. Wenn nicht, wiederholen 2,3-2,4. </li><li> Zentrifugieren Sie die Gesamt Zelllysat (12.000 x g, 4 ° C, 20 min). Bewahren Sie den Überstand. Entsorgen Sie die Pellet (mit aufgebrochenen Zellen und Mitochondrien), aber wenn es irgendeinen Zweifel über die Effizienz der Zellbruch (siehe 2.4), dann behalten die Pellet auch. </li><li> Zentrifugieren des Überstands aus dem vorherigen Schritt (200.000 × g, 4 ° C, 1,5 h). Überstand verwerfen und Resuspendieren der pelletiert mikrosomalen Membranen in CFTR-Puffer. Wenn die Mikrosomen werden für die Reinigung unter Verwendung DDM soll, ergänzen das CFTR-Puffer mit 1 M NaCl. </li><li> Wiederholen Sie die Zentrifugation der Membranfraktion suspendiert (100.000 x g, 4 ° C, 1 h), und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der pelletiert Mikrosomen inein Mindestvolumen von CFTR-Puffer (endgültige Volumen 5-15 ml, insgesamt mikrosomalen Protein 70-200 mg). Ein Bradford-Assay kann verwendet werden, um die Gesamtkonzentration der mikrosomalen Proteine ​​25 zu bestimmen. Zusätzlich das Fluoreszenzemissionsspektrum der Membranen sollte gemessen (Anregung = 485 nm, Emission = 500-600 nm) und sollte eine deutliche GFP-Fluoreszenz-Peak (Maximum bei 512 nm) haben. CFTR spezifisch auf einem SDS-PAGE-Gel unter Bedingungen gescannt GFP-Fluoreszenz (Fig. 1) erkannt werden. </li><li> Blitz Einfrieren der resuspendiert Mikrosomen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff und bei -80 ° C, oder fahren Sie mit Schritt 3 fort. </li></ol> 3. Solubilisierung von Mikrosomen <ol><li> Wenn gefroren, auftauen Mikros unmittelbar vor der Verwendung in einem Wasserbad auf 10 ° C eingestellt </li><li> Zur Solubilisierung von Membranen, verdünnt den Mikrosomen mit einem gleichen Volumen des jeweiligen Lösungspuffer (Schritt 1.3), um eine endgültige Konzentration von Waschmittel geben2% (w / v) und eine mikrosomale Proteinkonzentration von 5 mg / ml. Inkubieren dieser Mischung für 1 h bei 4 ° C unter Rühren (Schwenker). Bewahren Sie 200 ul für die Analyse. </li><li> Zentrifugieren der Mischung (100.000 × g, 4 ° C, 45 min). Entfernen Sie den Überstand der solubilisierten Membranproteine ​​enthalten, führt es durch einen 0,45 um Spritzenfilter speichern und auf Eis. Messung der Fluoreszenz des Überstands (wie in Schritt 2.8). </li><li> Resuspendieren der unlöslichen Fraktion in 1% (w / v) SDS-Lösung auf ein Volumen gleich der löslichen Fraktion. Messung der Fluoreszenz in dieser Fraktion und behalten ein Aliquot von 50 &amp;mgr; l SDS-PAGE-Analyse. </li></ol> 4. Nickel-Affinitätsreinigung von CFTR <ol><li> Link-zwei 5 ml Nickel-Sepharose Säulen in Reihe. Waschen mit 2 Säulenvolumina (CV) 20% (v / v) Ethanol, gefolgt von 2 CV ddH 2 O, dann waschen Sie die Säule mit 2 CV Solubilisierungspuffer (Schritt 1,4 bis 1,5), die 1 M Imidazol. Wiederholen Sie mit 2 CV von solubilizatIonen-Puffer fehlt Imidazol. </li><li> Hinzufügen Imidazol bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zu dem solubilisierten Material (Schritt 2.8) und manuell, wenn unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitschromatographievorrichtung das Material auf die Säule oder in eine Probenschleife geladen. </li><li> Laden des gelösten Materials auf die Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min, und wäscht mit 2 CV Imidazol-Puffer fehlen bei der gleichen Fließrate, um ungebundenes Material zu entfernen. Sammeln Fraktionen in 50 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Zum ersten Wäsche mit 3 CV des Reinigungspuffer mit 40 mM Imidazol bei einer Durchflussrate von 1 ml / min. 2 ml Fraktionen. </li><li> Für die zweite Wäsche mit 3 SV Reinigungspuffer mit 100 mM Imidazol. 2 ml Fraktionen. </li><li> Elute CFTR vom HisTrap Säule mit 3 CV von Reinigungspuffer mit 400 mM Imidazol. 2 ml Fraktionen. </li><li> Überwachung der Fluoreszenz in eluierten Fraktionen (Schritt 2.8). </li><li> Bewahren Aliquots der Peak-Fraktionen für die SDS-PAGE-Analyse. Flash-Freeze verbleibenden Spitzen fraction Proben und bei -80 ° C, bzw. den nächsten Reinigungsschritt weiter. </li></ol> 5. Gelpermeationschromatographie (GPC) Reinigung des CFTR <ol><li> Äquilibrieren die Spalte (Superose 6 10/300 GL) mit 1,2 CV ddH 2 O, gefolgt von 1,2 CV GPC-Puffer. </li><li> Während des Schrittes 5.1, konzentrieren die Ni-Affinitäts-gereinigten Fraktionen mit der höchsten GFP-Fluoreszenz unter Verwendung einer 100.000 MWCO Filterzentrifuge bei 4 ° C. Wenn Reinigung in DDM vermeiden Konzentrieren der Probe über einer Proteinkonzentration von 0,3 mg / ml Protein, wie dies signifikante Probenverlust. Entfernen Sie den Rückstand aus dem Konzentrator und Zentrifuge bei 100.000 x g für 30 min bei 4 ° C, um große Partikel zu pelletieren. </li><li> Spritzen Sie dieses Beispiel auf die Säule und Elution mit einem isokratischen Gradienten von 1,2 CV GPC-Puffer. Sammeln Sie 0,5 ml-Fraktionen. </li><li> Messen GFP-Fluoreszenz, wie in Abschnitt 2.8, diese Fraktionen, die CFTR identifizieren. Bewahren Sie eine kleine Menge (zB &lt;/ Em&gt; 50 &amp;mgr; l) von jedem für die Analyse durch SDS-PAGE. </li><li> Frieren Fraktionen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C </li></ol> 6. Rekonstitution von CFTR <ol><li> Hinzufügen Lipide (Schritt 1,8) zu dem gereinigten CFTR an Lipid-zu-Protein-Verhältnis 100:1 (w / w) und Inkubation bei 4 ° C für 1 Stunde. Ebenso eine lipid nur Steuerung eingestellt, und ersetzen Sie das gereinigte Protein mit dem gleichen Volumen GPC-Puffer. </li><li> Entfernen Sie Reinigungsmittel aus dem Protein / Lipid-Mischung mit hydrophoben Adsorbens Perlen. In 5 CV ddH 2 O, 5 CV 70% (v / v) Ethanol, 5 CV ddH 2 O und 5 CV GPC Puffer ohne Waschmittel waschen Adsorbens Perlen. 200 mg Adsorbens gewaschen Perlen pro ml gereinigtem Protein und Inkubieren bei 4 ° C über Nacht unter leichtem Schütteln. </li><li> Sammeln Sie die Rekonstitution Probe aus den Adsorbens Perlen in ein frisches Röhrchen mit einem dünnen-ended Pipettenspitze. </li></ol> 7. Messung der ATPase-Aktivität <ol><li> Bestimmen Sie die Rate der CFTR-spezifische ATPase-Aktivität unter Verwendung eines modifizierten Chifflet Assay 26,27 in einer 96-Well-Plattenformat. Mit Natriumphosphat-Stammlösung (0,65 mM) vorzubereiten 0-20 nmol Phosphat in einem Gesamtvolumen von 50 ul als Standards. Verwenden Sie eine 1:1-Mischung von CFTR-ATPase-Puffer und Puffer, um die Phosphat-Lager zu verdünnen. </li><li> Inkubation sowohl wiederhergestellt CFTR und leere Liposomen mit 1:100 (v / v) ATPase-Inhibitoren (Schritt 1,9) auf Eis für 10 min. Verwenden Sie mindestens 5 ug wiederhergestellt CFTR. </li><li> Hinzufügen ATP (Schritt 1,9) zu einer Endkonzentration von 2 mM und Inkubation bei 25 ° C für 1 Stunde. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 40 ul 10% (w / v) SDS (Schritt 1,9) zu jeder Vertiefung (einschließlich der Standards). </li><li> 100 l Puffer A (Schritt 1.10) und Inkubation für 10 min. Füge 100 &amp;mgr; l Puffer B (1,10) in jede Vertiefung und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 800 nm in einer 96-Well-Platte-kompatible UV / Vis-Spektrophotometers. </li><li> Konvertieren Absorption bei 800 nm in einer Menge an freigesetztem Phosphat mittels derPhosphat-Standards. Berechnen Sie die Geschwindigkeit der ATP-Hydrolyse nach Abzug der Hintergrundsignal (Liposomen nur Brunnen). </li><li> Für nicht wiederhergestellt CFTR folgen dem gleichen Protokoll mit CFTR-Puffer für die Hintergrundwerte. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein:+Application+to+lens+ATPases.">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li><li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence.">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li></ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb noch andere widerstreitenden Interessen in Bezug auf diese Arbeit.

Wir haben zuvor für die Überexpression des murinen CFTR 14 beschriebenen Verfahrens. Seit der Veröffentlichung des Protokolls, haben wir verschiedene Orthologen von CFTR Ausdruck gebracht haben und gereinigt mit dem gleichen System. Orthologe alle bisher getesteten und in dem Flüssiggas-Waschmittel gereinigt, während die DDM-Reinigung zeigte mehr Variation in verschiedenen Orthologe (Daten nicht gezeigt). Diese Flexibilität zeigt die Stärke des Hefe-Ansatz: Es ist möglich, viele Konstrukte relativ rasch, um ein für einen bestimmten Zweck zu wählen screenen. Waschen der Hefe-Mikrosomen mit Puffer, enthaltend 1 M NaCl vor der DDM-Ergebnisse in einer Reinigungsmikros Herstellung Solubilisierung und reduziert Verunreinigungen in späteren Phasen. Dieser Schritt ist nicht notwendig in der LPG-Protokoll als die endgültige CFTR Probe&gt; 90% rein, ohne die Mikros waschen. Außerdem, Reinigung im DDM erfordert mehrere Änderungen der Puffer zur Solubilisierung einnd Reinigung, nämlich die zusätzliche Zugabe von Glycerin und Salz. Zusammen stellen diese Zusätze deutlich die Bindung des DDM-solubilisierten Protein an der Säule erhöht. Das DDM Reinigungsmethode hat Raum für Verbesserungen, insbesondere die Entnahme eines 40 kDa großen Verunreinigung, die durch Massenspektrometrie beurteilt, ist aufgrund der Hefe ribosomalen Untereinheit L3, die eine inhärente Affinität für Nickel Harz zu haben scheint. Es gibt keinen offensichtlichen polyHis-Sequenz in der L3-Protein, aber Prüfung der 3D-Struktur, wenn das Ribosom gebunden (PDB = 1FFK) zeigt, dass der gefaltete L3-Untereinheit hat ein Potential polyHis Cluster. Dass diese Band ist in LPG-gereinigte Material weniger problematisch kann aufgrund der härteren LPG Reinigungsmittel sein. Obwohl die Reinigung in DDM scheint schlechter als die in der LPG zu sein, kann milder Detergenzien wie DDM mehr mit funktionellen und strukturellen Analysen kompatibel sein und haben bereits in mehreren Röntgen crystall verwendetographic Studien von Membranproteinen 15-21. Ferner bezeichnet unsere Ergebnisse, dass die Verwendung von LPG führt zum Verlust der ATPase-Funktion in Bezug auf die Reinigung CFTR in DDM. Daher würden wir die LPG-basierte Reinigungsprotokoll für die Erzeugung von CFTR wobei die Reinheit entscheidend empfehlen, beispielsweise in Anwendungen wie der Charakterisierung von posttranslationaler Modifikationen, oder bei der Erzeugung von Antikörpern, die LPG-basiertes Protokoll gewählt werden würde . Auf der anderen Seite in Anwendungen, bei denen die Aktivität und vollständig nativen Zustand des Proteins ist wesentlich, würden wir die DDM-basiertes Protokoll als eine bessere Option vorschlagen. Abschließend Dieses Protokoll beschreibt ein reproduzierbares Verfahren zur Isolierung von CFTR in der zwitterionischen Detergens-LPG 14 oder das nicht-ionische Detergens DDM. Als solche zeigt eine größere Palette von Reinigungsbedingungen für CFTR als zuvor berichtet worden, 10-13. Zusätzlich Milligramm-Mengen von gereinigtem CFTR kannunter Verwendung dieser Verfahren, wenn sie mit einem hohen Volumen Hefewachstum System wie einem 20 L Fermenter und einer hohen Kapazität Zellerntesystem, wie ein 6 L niedriger Geschwindigkeit Zentrifugenrotor in Verbindung erhalten. Das erhaltene CFTR einen spalt GFP-Tag, das eine einfache Überwachung des Proteins in verschiedenen biochemischen und biophysikalischen Untersuchungen ermöglicht. Die in dieser Handschrift (Huhn CFTR-haltige Plasmid oder gefrorene Hefe-Zellen) beschrieben Reagenz kann durch die Cystic Fibrosis Foundation (USA) bezogen werden.

Cystische Fibrose (CF) ist die häufigste genetische Erkrankung in Europa und Nordamerika mit einer Inzidenz von etwa 1 zu 2.500 Lebendgeburten. CF tritt bei Mutationen in der Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR)-Protein zu einem Verlust der Funktion an der Plasmamembran von Epithelzellen 1. Die schwerwiegendste Folge dieses Mangels ist irreversible Lungenschäden, die die Lebenserwartung der Betroffenen bis &lt;40 Jahre 2,3 verkürzt. CFTR ist ein ATP-binding cassette (ABC)-Transporter, die sich entwickelt hat, um ein Ionenkanal 1,4 geworden. Trotz seiner ziemlich veränderte Funktion in der Plasmamembran von Zellen, ist es noch immer eine signifikante Sequenzhomologie mit anderen ABC-Transportern. Interessanter, die Sonderteile von CFTR (dh seine regulatorischen Region und ihre N-und C-Termini) teilen sich keine signifikante Sequenzähnlichkeit mit anderen Metazoen ABC-Transporter, daher gibt es keine Hinweise auf thE Ursprünge dieser Sequenzen in CFTR. Auf der Basis seiner Primärstruktur wird CFTR als C-Familienmitglied der ABC-Transporter-Familie eingestuft, aber es gibt keine starken Beweise für eine Rest funktionellen Verknüpfung zu dieser Unterfamilie. Es wurden für 5-7 CFTR einige Berichte von Glutathion Transportaktivität, das wäre im Einklang mit den Rollen der anderen C-Familienmitglieder 8,9, obwohl auch andere Berichte deuten darauf hin, dass reduzierte Glutathion kann das CFTR-ATPase-Aktivität zu hemmen, statt, die die Substrat-induzierte Stimulation, die der ABC-Transporter 10 charakterisieren. Messung der Ionenleitfähigkeit ist empfindlich genug, damit die Kanalaktivität einzelner CFTR-Moleküle zu unter 1 und CFTR-Kanals Eigenschaften wurden als Funktion der Zeit, der Temperatur, der ATP-Konzentration, Membranpotential und Phosphorylierung als auch in der überwacht Vorhandensein einer Vielzahl von niedermolekularen Inhibitoren, Potentiatoren und Modifikatoren. DieseStudien haben auch wesentlich zu unserem Wissen, wie ABC-Transporter funktionieren aufgenommen. Dennoch Expression von CFTR in signifikanten Mengen und ihre anschließende Reinigung hat sich als besonders anspruchsvoll und Erfolg auf einige wenige Labors 10-13 beschränkt zu sein. Die Notwendigkeit, wirksamere Medikamente zu entwickeln drängt, doch dieser Prozess durch den Mangel an CFTR gereinigt für das Screening kleiner Moleküle behindert. Die Lösung des CFTR-Expression und Reinigung Problem wäre Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening auf eine Korrektur des primären Defekt in CF ausgerichtet und ermöglichen würden zudem eine Route für hochauflösende Strukturuntersuchungen zu Rational Drug Design zu informieren. Selbst relativ grundlegenden biochemischen Eigenschaften des Proteins, wie seine funktionellen oligomeren Zustand, interagierende Proteine ​​und ATPase-Aktivität bleiben schlecht charakterisiert. Wir haben zuvor ein Protokoll für die großtechnische Expression von GFP-und His-markierten murinen CFTR berichtetin S. cerevisiae 14 und nun beschriebenen Protokolle für die Reinigung von CFTR. Wir haben diese Methoden verwendet, um fünf Orthologe von CFTR und Darstellung von Daten für die Reinigung von Hühner CFTR als Beispiel zu reinigen. Die Auswahl von Detergentien zur Solubilisierung und Reinigung ist ein kritischer Schritt bei der Reinigung von jeder Membranprotein. Nachdem die Löslichkeit von CFTR in mehreren Detergenzien gescreent, haben wir zwei kontras Detergenzien zur Verwendung in der Reinigung ausgewählt. Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) ein nicht-ionisches Detergens wurde ausgiebig sowohl für strukturelle und funktionelle Studien von Membranproteinen 15-21 verwendet. Das ionische Detergens 1-Tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerin) (LPG-14) ist bei der Solubilisierung von CFTR hocheffiziente und vorher bei der Reinigung von funktionellen Membranproteine ​​10 verwendet wurde, 22,23, einschließlich Reinigung des CFTR von S. 24 cerevisiae. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:492px;" width="491">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:161px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2&#956;M syringe filter&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sartorius</td>
			<td style="width:161px;">FC121</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane)</td>
			<td style="width:115px;">Vivaspin</td>
			<td style="width:161px;">VS0641</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">72.695</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">40Ti rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;"><a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50ml Sterile Falcon Tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">62.547.254</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A26209&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid chromatography system</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28-4062-64</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A8456</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass bead-beating cell disrupter</td>
			<td style="width:115px;">BioSpec</td>
			<td style="width:161px;">1107900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">HERMLE</td>
			<td style="width:161px;">Z300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5417R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop microfuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">13-100-511</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzamidine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">434760</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">114391</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">357000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">170-808</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chymostatin&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C7268</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">D8418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">43815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">E.coli total lipid extract</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">100500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">E3132</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass beads, acid washed</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8772</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">65017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HisTrap HP columns (5 ml)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5247-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapid Coomassie Stain</td>
			<td style="width:115px;">Novexin</td>
			<td style="width:161px;">ISB1L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge JA-17 rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">369691</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:115px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">108975</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG)</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">858120</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO4</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel tank SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">165-8006</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">n-dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:115px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:161px;">D310S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S6191</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NaN3</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A9434</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">75351</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">392050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prestained protein standards</td>
			<td style="width:115px;">Fermentas</td>
			<td style="width:161px;">SM1811</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Desalting columns (Sephadex G-25)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-0851-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin A</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P4265</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P7626</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sch28080</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S4443</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">L37771</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium thiocyanate (NaSCN)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">251410&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel filtration 10/300 GL column</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5172-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris-base</td>
			<td style="width:115px;">Formedium</td>
			<td style="width:161px;">TRIS01</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">355618</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:115px;">Star Labs</td>
			<td style="width:161px;">N2400-0001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:115px;">Ultrawave</td>
			<td>F0002202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multimode plate reader</td>
			<td style="width:115px;">BioTek</td>
			<td style="width:161px;">BTH1MF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein expressed in saccharomyces cerevisiae

Defekte in der Mukoviszidose-Transmembran Regulator (CFTR)-Protein führen zystischer Fibrose (CF), eine autosomal-rezessive Erkrankung, die derzeit begrenzt die durchschnittliche Lebenserwartung der Erkrankten bis &lt;40 Jahre alt. Die Entwicklung neuer Wirkstoffmoleküle, die Aktivität von CFTR wiederherzustellen, ist ein wichtiges Ziel in der Behandlung CF, und die Isolation von funktionell aktiven CFTR ist ein sinnvoller Schritt zur Erreichung dieses Ziels. Wir beschreiben zwei Verfahren zur Reinigung von CFTR aus einer eukaryotischen heterologen Expressionssystem, S. cerevisiae. Wie prokaryotischen Systemen, S. cerevisiae kann schnell im Labor mit geringen Kosten angebaut werden, kann aber auch Verkehrs-und posttranslational große Membranproteine ​​modifizieren. Die Auswahl von Detergentien zur Solubilisierung und Reinigung ist ein kritischer Schritt bei der Reinigung von jeder Membranprotein. Nachdem die Löslichkeit von CFTR in mehreren Detergenzien gescreent, haben wir zwei Co ausgewähltntrasting Detergenzien zur Verwendung bei der Reinigung, die die endgültige CFTR Vorbereitung auf die später geplanten Experimenten zugeschnitten werden können. Bei diesem Verfahren stellen wir Vergleich der Reinigung von CFTR in Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) und 1-Tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerin) (LPG-14). Protein in DDM mit dieser Methode gereinigt zeigt ATPase-Aktivität in funktionellen Tests. Protein in LPG-14 gereinigt zeigt hoher Reinheit und Ausbeute, kann verwendet werden, um post-translationale Modifikationen zu untersuchen, und für strukturelle Methoden wie Kleinwinkelröntgenstreuung und Elektronenmikroskopie eingesetzt werden. Aber es zeigt deutlich niedriger ATPase-Aktivität.

Das oben beschriebene Protokoll ist ein effizientes Mittel, um CFTR angereicherte Mikros fast vollständige Wiederherstellung der CFTR während des Zellbruch und Herstellung der Roh-Mikrosomen (Fig. 1) zu isolieren. Andere Zellbruchverfahren können auch effektiv verwendet werden. Wir haben eine Druckzelle Französisch und andere high-pressure/cavitation Geräte (auch in Kombination mit Auftreffen auf einem Rubin Ziel) mit gleicher Effizienz eingesetzt. Für Komfort und niedrigen Anschaffungskosten der Geräte, finden wir die Wulst-Verfahren die besten Schläge. Mit LPG um sie zu lösen und zu reinigen CFTR ergab 80 ug Protein / L Kultur bei&gt; 90% Reinheit (Abbildung 2). Die hohe Ausbeute war durch effiziente Solubilisierung von CFTR von LPG (vgl. Abb. 2b, Spuren 2 und 4). Außerdem effizient und feste Bindung an die Säule führte zu einem minimalen Verlust von CFTR in der ungebundenen Fraktion und der Abwesenheit von CFTR in den Waschfraktionen (Fig. 2, Bahnen 3, 5, und6). Das eluierte Protein besaß eine Reinheit von&gt; 90%, durch Coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gelen abgeschätzt und mit Densitometrie des CFTR-und Schadstoff Bands. Gelpermeationschromatographie (GPC) getrennt LPG-CFTR gereinigt von Verunreinigungen Gewicht niedermolekularen (Abbildung 4, unteres Bild). Das Protokoll für die Reinigung unter Verwendung von CFTR DDM gibt Reinheit von etwa 60% und die Ausbeute von etwa 50 ug / l (Fig. 3). Elektronenmikroskopie (EM) von negativ gefärbten Fraktionen, die von der GPC-Elution bei 10 ml (Fig. 4) zeigte, dass DDM-gereinigt CFTR enthält Aggregate von 20-30 nm Durchmesser und kleinere Teilchen von 10 nm Durchmesser (Daten nicht gezeigt). Es ist möglich, dass die kleinen Aggregate reversibel zu verknüpfen und distanzieren wie Ultrafiltration mit einer 1 MDa cut-off Filter war nicht in der EM-nachweisbar Aggregate zu entfernen. LPG-gereinigte Material nicht zu einer Schein-Netz entladen adsorbieren, daher wurde durch Kryo-EM der ungefärbten Fraktionen untersucht. Dies zeigte,eine sehr homogene Kornpopulation einer relativ geringen Größe (6-8 nm Durchmesser, Daten nicht gezeigt). Schließlich wurde die ATPase-Aktivität der gereinigten Proteine ​​(Abbildung 5) gemessen. Als Mitglied der ABC-Protein-Familie, hat CFTR zwei Nukleotid-Bindungsdomänen (NBDs), die zur Bindung und / oder Hydrolyse von ATP. Die Daten zeigen, daß das gereinigte Protein war nicht in der Lage, ATP in der LPG-solubilisierten Zustand hydrolysieren und zeigte schwache ATPase-Aktivität in Gegenwart von DDM (Abbildung 5, ungefüllte Balken). Nach der Zugabe von Lipiden und Entfernen des Detergens wurde die ATPase-Aktivität 4-fach höher für Proben, die in DDM (13 nmol ATP / min / mg Protein) gereinigt worden war. Die Zugabe von Lipiden und Entfernen von LPG ähnlich wiederhergestellt Aktivität CFTR isoliert worden waren, die mit LPG, jedoch mit einer abschließenden Untersatz (1,5 nmol ATP / min / mg Protein) als die DDM-gereinigt und wiederhergestellten Materials. <img alt="Figur 1"fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg&quot; /&gt; 1. Überwachungsebenen Huhn CFTR im Zelllysat (CL), die Überstände (S) und Pellets (P) während der verschiedenen Schritte der Zentrifugation für Mikros Isolierung und Waschen verwendet. SDS-PAGE Gele wurden unter Verwendung des in-Gel-Fluoreszenz des GFP visualisiert -Tag. Der Überstand nach dem Aufbrechen der Zellen und Zentrifugation bei 14000 × g enthält praktisch alle CFTR (einschließlich Abbauprodukte). Ultrazentrifugation bei 200.000 xg Sedimente alle in voller Länge CFTR verlassen einige Fragmente im Überstand. Ultrazentrifugation bei 100.000 × g salz gewaschen Mikros Pellets fast alle CFTR mit dem Entfernen einiger weiterer Fragmente. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" /> 2. Reinigung von Hühner CFTR in LPG durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung (oberes Feld) und Fluoreszenz-Detektion des GFP-Tag (untere Tafel) untersucht. Tracks: (1) Mikrosomen. (2) LPG-Mikrosomen gelöst. (3) Nicht konsolidiert Material. (4) Das unlösliche Material. (5) und (6) 40 bis 100 mM Imidazol-Waschanlagen. (7) Material eluiert mit 400 mM Imidazol. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" /> 3. Reinigung von Hühner CFTR in DDM durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung analysiert. Die Linke Tafel zeigt Fraktionen vor der Elution. Mehrere aufeinanderfolgende Elution Fraktionen werden in der rechten Panel mit CFTR in gezeigtdurch den Pfeil dicated. Später Fraktionen werden in einem 40 kDa Verunreinigung, die durch Massenspektrometrie als ribosomale Protein L3 identifiziert wurde bereichert. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" /> 4. Reinigung von Hühner CFTR durch Gelpermeationschromatographie. CFTR durch Ni-Affinitätschromatographie gereinigt wurde, eingeengt und auf einem GPC-Säule aufgetragen. Das Elutionsprofil für CFTR (oben) in Puffer gereinigt enthalten LPG-14 (durchgezogene Linie) oder DDM (gestrichelte Linie) überlagert werden. SDS-PAGE (unten) ergab, dass CFTR zwischen 8 und 11 ml eluiert. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" /> Abbildung 5. ATPase activity gereinigtes Hühner CFTR Fraktionen. Protein in DDM oder LPG gereinigt wurde unter Verwendung einer modifizierten Chifflet Assay 26 in Gegenwart eines Cocktails von ATPase-Inhibitoren, jede Hintergrund-ATPase-Aktivität von F-, P-und V-Typ-ATPasen (ungefüllte Balken zu entfernen getestet ). Die Rate der ATP-Hydrolyse wurde auch nach Entfernung des Detergens und Lipid-Zugabe (gefüllte Balken) gemessen. Das Diagramm zeigt den Mittelwert und Standardabweichung (n = 3). Unterschiede zwischen den Mittelwerten für die ATPase-Aktivität in Gegenwart und Abwesenheit von Lipid und Differenz-Aktivität in DDM und LPG signifikant für p &lt;0,05.

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Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Die heterologe Expression und Reinigung des Mukoviszidose Transmembran Regulator (CFTR) sind bedeutende Herausforderungen und limitierende Faktoren bei der Entwicklung von Arzneimitteltherapien für Mukoviszidose. Dieses Protokoll beschreibt zwei Verfahren zur Isolierung von Milligramm-Mengen von CFTR für funktionelle und strukturelle Untersuchungen.

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

14.4K Aufrufe.  University of Manchester.  Die heterologe Expression und Reinigung des Mukoviszidose Transmembran Regulator (CFTR) sind bedeutende Herausforderungen und limitierende Faktoren bei der Entwicklung von Arzneimitteltherapien für Mukoviszidose. Dieses Protokoll beschreibt zwei Verfahren zur Isolierung von Milligramm-Mengen von CFTR für funktionelle und strukturelle Untersuchungen. 

Serie: Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR Wachte Redox-Titration der Cofaktoren von<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt

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Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in

EPR Wachte Redox-Titration der Cofaktoren von