Arbeiten in Laboratorium des Autors wird von der Canadian Institutes of Health Research, der Canada Foundation for Innovation, der Natural Sciences and Engineering Research Council und der Concordia University gefördert.

Bau der diploiden Stämme Protokoll für die Herstellung von Diploiden durch Paarung <ol><li> Die ersten Stämme sollte auf YPD oder selektiven Medium getroffen werden, wenn nötig, einzelne Kolonien zu produzieren. Die beiden haploiden Stämmen sollte der entgegengesetzten Paarungstyps (dh Mata und MATα) werden. </li><li> Mit einer sterilen Impföse holen einen kleinen Teil einer Kolonie von einer der beiden haploiden Stämmen. Auf einer neuen YPD Platte Streifen die Schleife einmal in einer geraden Linie über die Platte. Markieren Sie die Richtung der Streifen mit einem Pfeil an der Unterseite der Platte. </li><li> Wiederholen Sie dies für den zweiten Stamm auf dem gleichen YPD Platte. Diesmal Streifen der Kolonie senkrecht zu den ersten, überqueren den ersten Streifen mit dem zweiten. Markieren Sie die Richtung des zweiten Streifen und notieren Sie den Bereich, wo der zweite Streifen kreuzt die erste. Dieser Bereich ist, wo Diploiden produziert werden. </li><li> Inkubieren Sie die YPD Platte bei 30 ° C über Nacht. </li><li> Replica Platte der YPD Platte auf selektiven Medien, die selektiv erlauben wird sich das Wachstum der neu gebildeten Diploiden. </li><li> Wählen Sie eine einzelne Kolonie, falls möglich, einen kleinen Teil der diploiden Streifen und Streifen auf dem gleichen selektiven Medium, um einzelne Kolonien zu erzeugen. </li></ol> Sporulation und Verdauung von Asci Protokoll <ol><li> Wählen Sie einzelne Kolonien von der Platte oben und kleine (1cm x 1cm) Flecken auf Sporulation (SPO) Platten und Inkubation bei 30 ° C für 3-7 Tage zur Sporulation. </li><li> Sporulation kann anhand der Zellen, die aus jedem Patch unter einem Lichtmikroskop überprüft werden. Legen Sie die Zellen auf einem Objektträger in 5-10 l Wasser, legen Sie ein Deckglas auf den Tropfen, und schauen auf das Vorhandensein von Asci. Wenn Asci nicht leicht zu finden sind dann legte zurück in den Inkubator. </li><li> Wenn es einen wirksamen Sporulation in einer der Patches, bereiten ein steriles 15 ml konische Röhrchen mit 100 &amp;mgr; l der Tetrade Saft. </li><li> Pick-Zellen aus diesem Sporulation Patch mit einer sterilen Impföse 3mm (Zellen sollten ¼ der Schleife Abdeckung) und in der Tetrade Saft. Vorsichtig schwenken die Schleife, damit die Zellen zu fallen die Schleife und vermischen sich mit der Lösung. </li><li> Lassen Sie in Tetrade Saft (mit Zymolyase) für 4-10 Minuten (abhängig von der Konzentration und Aktivität von Zymolyase und der Stamm selbst). Dies ermöglicht für die Verdauung der Zellwand umgibt die Ascosporen. </li><li> Markieren Sie die Ober-und Unterseite des Inokulums Region auf einer YPD Platte. </li><li> Optional. Reaktion kann durch Zugabe von 1 ml eiskaltem sterilen dH 2 O gestoppt werden Lassen Sie die Zellen für 5 Minuten zu begleichen. Entfernen 1ml aus dem Überstand anschließend leicht mischen mit der Hand und halten Sie auf dem Eis. </li><li> Nehmen 5μL der verdauten Zellen aus Schritt 5 und sanft Ort fällt in eine Linie in das Inokulum Region des vorgezeichneten YPD Platte. </li><li> Verwenden Sie eine sterile 3mm Impföse sehr vorsichtig die Tropfen 1-3 mal in einer Linie verteilt, während kaum Kontakt mit dem Agar. </li><li> Lassen Sie die Flüssigkeit in den Agar aufnehmen (Wenn Schritt 7 angegeben ist, wird dies, wenn die Verdauung der äußeren Zellwand reduziert werden oder zu stoppen). Fahren Sie mit dem Dissektionsmikroskop. </li></ol> Dissection der Asci Protokoll Beachten Sie, dass die folgenden Protokoll für einen Singer MSM System 200 Mikromanipulation Mikroskop beschrieben. Dieses Protokoll kann mit geringfügigen Änderungen, wenn mit einer manuellen Mikromanipulator wie Zeiss Mikromanipulator MR gefolgt werden. <ol><li> Konzentrieren Sie sich auf einen Bereich der Platte, wo die Hälfte des Feldes enthält Zellen und die Hälfte ist leer. Langsam bringen die Nadel in den Fokus, so dass es den leeren Bereich des Feldes berührt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Nadel nicht enthalten Zellen, die aus einer früheren Nutzung. Der Kontakt zwischen der Nadel und der Agar wird als dunkler schwarzer Kreis, der sich langsam rückt in den Fokus zu sehen. </li><li> Gehen Sie auf die Matrix an der Position A1 und markieren durch Durchstechen der Agar wieder. Dies ist zu helfen, die Orientierung der Platte, wenn es ausgeschaltet ist dem Mikroskop vor dem Abschluss übernommen. </li><li> Wechseln Sie in den Suchmodus. Suchen Sie einen Asci. Vorzugsweise wählen Asci, die in Bereichen, in denen die Zellen gut verteilt werden sind. Vermeiden Sie Bereiche mit Zellhaufen. Die vier Ascosporen aus einer Asci sollte noch miteinander verbunden werden. Zwei Ascosporen kann etwas größer sein als die anderen beiden. Vermeiden Sie Kommissionierung Asci, wo man Ascosporen ist locker und nicht auf den Rest der Ascosporen verbunden. </li><li> Pick up Ascus mit der Nadel. Langsam bringen die Nadel bis auf den Teller. Wenn der Schatten des Mikronadel gesehen wird, säumen diese mit dem Ascus, gepflückt zu werden. Wieder Ansatz der Nadel bis zum schwarzen Umriss eines Kreises (die Spitze der Nadel) zu sehen ist. Berühren Sie die Tetrade mit diesem Kreis und dann schnell ziehen Sie die Nadel entfernt. Achten Sie darauf, alle vier Ascosporen aus einem Ascus haben, um die Nadel eingehalten und dass keine weiteren Zellen wurden auf der Mikronadel, die nicht Teil dieser Ascus versammelt. </li><li> Ziehen Sie die Mikronadel weit weg von der Platte und gehen Sie zu der Matrix (für die ersten Ascus, gehen Sie zuPosition A1). Beachten Sie jede Position, wo ein Ascus ist umgezogen. Legen Sie die Ascus sich durch Berühren der Platte mit der Mikronadel und wegziehen, bis alle vier Ascosporen kommen aus dem Mikronadel. Leichtes Ausschlagen der Nadel Arm oder die Plattform Halten der YPD Platte ist oft bei diesem Schritt hilfreich. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3-5 und Platz Asci sich an aufeinander folgenden Positionen in der Matrix, bis die gewünschte Anzahl von Asci haben abgeholt worden. </li><li> Gehen Sie zurück zu jedem Ascus und brechen die vier Zellen abgesehen von Hänseleien mit der Nadel, tippen die Plattform sanft oder eine Kombination aus beidem. Pick-up die Zellen verlassen hintereinander in eine neue Position in der Matrix, bis jeder Ascosporen in jedem Ascus in Viererreihen getrennt ist. </li><li> Legen Sie die YPD Platte in einem Brutschrank bei 30 ° C für mehrere Tage, um das Wachstum Muster zu beobachten. </li><li> Replica Platte der sezierten Zellen selektiven Medium, wenn nötig. </li></ol> Umzug von Zygoten Protokoll <ol><li> Streak aus zwei haploiden Stämme mit entgegengesetzten Paarungstypen auf das entsprechende Medium, einzelne Kolonien zu erhalten. </li><li> Mate diesen beiden Stämmen wie oben beschrieben und lassen von 4 bis 6 Stunden (oder über Nacht, wenn notwendig) zu wachsen. </li><li> Prüfen Sie, ob Zygoten unter einem Lichtmikroskop. Zygoten als hantelförmige Zellen entweder mit oder ohne eine Knospe erscheinen. </li><li> Pick-Zellen mit einem 3mm Impföse (Zellen sollten ¼ der Schleife Abdeckung) und platzieren Sie sanft in 100 &amp;mgr; l sterilem dH 2 O. </li><li> Markieren Sie die Ober-und Unterseite des Inokulums Region auf einer YPD Platte. </li><li> Nehmen 5μL und sanft Ort fällt in eine Linie in das Inokulum Region des vorgezeichneten YPD Platte. </li><li> Verwenden Sie einen 3mm Impföse die Tropfen in einer Linie sehr sanft verteilen, während kaum Kontakt mit dem Agar. </li><li> Lassen Sie die Flüssigkeit in den Agar zu absorbieren. Fahren Sie mit dem Dissektionsmikroskop. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf einen Bereich der Platte, wo die Hälfte des Feldes enthält Zellen und die Hälfte ist leer. Langsam bringen die Nadel in den Fokus, so dass es den leeren Bereich des Feldes berührt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Nadel nicht enthalten Zellen, die aus einer früheren Nutzung. Der Kontakt zwischen der Nadel und der Agar wird als dunkler schwarzer Kreis, der sich langsam rückt in den Fokus zu sehen. </li><li> Gehen Sie auf die Matrix an der Position A1 und markieren durch Durchstechen der Agar wieder. Dies ist zu helfen, die Orientierung der Platte, wenn es ausgeschaltet ist dem Mikroskop vor dem Abschluss übernommen. </li><li> Wechseln Sie in den Suchmodus. Suchen Sie eine Zygote. </li><li> Pick-up eine Zygote mit der Nadel. </li><li> Legen Sie Zygoten individuell auf die Matrix. </li><li> Lassen Zygoten für mehrere Tage wachsen. </li><li> Replica Platte die Zygoten auf die entsprechenden selektiven Medium. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> Abbildung 1: Die Paarung von zwei haploiden Stämme gegenüber Paarungstypen erzeugt eine diploide Stamm. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> Abbildung 2: (A) A YPD-Platte mit thre Ergebnisse einer Paarung zwischen einer Temperatur sensiblen Stamm (mit einem leu2 Auxotrophie) und einem Wildtyp-Stamm (LEU2). Aufgeschlossenen Zellen sind in der Inokulum Region auf der linken Seite, wo dicke Wachstum zwischen den beiden schwarzen Linien gesehen zu verbreiten. Asci, die seziert haben zu wachsen gleichmäßig in der Matrix auf der rechten Seite angeordnet. (B) Die Platte in (A) wurde auf eine SD-Leucin Drop-out-Platte repliziert. Beachten Sie das 2:2 Wachstum für die LEU2 Marker zeigt ein validiertes Ascosporen seziert wurde. (C) Die Platte in (A) wurde auf eine YPD Platte repliziert und bei 37 ° C. Beachten Sie das 2:2 Wachstum, das eine weitere Bestätigung, dass ein Ascosporen seziert wurde.

<ol>
	<li>Sherman, F., Hicks, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+and+Dissection+of+Asci.">Micromanipulation and Dissection of Asci.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 21-37 (1991).</li></ol>

Hefe Dissektion ist ein nützliches Werkzeug, um neue Sorten mit den gewünschten Marker auszuwählen. Bei der Ermittlung des theoretischen Wachstumsmuster von vier Ascosporen ist es wichtig, bei der Genotyp des vegetativen Zelle aussehen. Wenn ein Plasmid vorhanden ist, muss man wissen, wenn es einzelne, niedrige oder hohe Kopie ist, da dies Auswirkungen auf die Ascosporen (s) das Plasmid erhalten und wird Prognosen und Schlussfolgerungen in Bezug auf die Stämme manipuliert zu beeinflussen. <p class="jove_content"...

<table><tbody><tr><td>Singer MSM System 200</td><td>Microscope</td><td>Singer Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>SOR508</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Reagent</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>PEP 403</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Yeast nitrogen base</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>YNB406</td><td></td></tr><tr><td>Bio-tryptone</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>POA 301</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003</td><td></td></tr><tr><td>Adenine sulfate</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>ADS201</td><td></td></tr><tr><td>L-uracil</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>URA 241</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptophan</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP 100</td><td></td></tr><tr><td>L-histidine</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>HIS 200</td><td></td></tr><tr><td>L-arginine</td><td>Reagent</td><td>Amresco</td><td>0877-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>MET 222</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrosine</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>TYR 333</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucine</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>ISO 910</td><td></td></tr><tr><td>L-valine</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>VAL 201</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>LYS 101</td><td></td></tr><tr><td>L-phenylalanine</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>PHA 302</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamic acid</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU 202</td><td></td></tr><tr><td>L-threonine</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>THR002</td><td></td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>Reagent</td><td>BioShop Canada</td><td>LEU 222</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of saccharomyces cerevisiae asci

Hefe ist ein sehr praktische Zwecke geeigneten Modells, das verwendet werden, um viele verschiedene zelluläre Prozesse zu studieren. Das gemeinsame Labor-Stamm<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Gibt es entweder in einer haploiden oder diploiden Zustand. Die Fähigkeit, Allele von zwei Haploiden kombinieren und die Möglichkeit, Änderungen an dem Genom einzuführen erfordert die Herstellung und Präparation von Asci. Asci Produktion von haploiden Zellen beginnt mit der Paarung von zwei Hefe haploiden Stämmen mit kompatiblen Paarungstypen eine diploide Stamm zu produzieren. Dies kann in eine Reihe von Möglichkeiten entweder auf einem festen Medium oder in flüssiger erreicht werden. Es ist vorteilhaft, für den Diploiden in Medium, das selektiv fördert ihr Wachstum im Vergleich zu entweder der haploiden Stämme auszuwählen. Die Diploiden sind dann erlaubt, auf nährstoffarmen Medium sporulieren zu Asci, ein Bündel von vier haploide Tochterzellen, die aus meiotischen Reproduktion der diploiden Form. Eine Mischung aus vegetativen Zellen und Asci wird dann mit dem Enzym Zymolyase zu verdauen entfernt die Membran sac um die Ascosporen der Asci behandelt. Mit Mikromanipulation mit einem Mikronadel unter einem Dissektionsmikroskop ein aufzuheben können einzelne Asci und trennen und verlagern die vier ascopores. Dissected Asci sind für mehrere Tage gewachsen und getestet für die Marker oder Allele von Interesse durch Replika-Plattierung auf geeigneten selektiven Medien.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Mikromanipulation von Hefezellen ist für meiotischen genetische Analyse oder diploiden Zygoten wählen erforderlich. Diese Mikromanipulationen werden mit dem Mikronadel einer Dissektionsmikroskop durchgeführt. Die Mikronadel wird verwendet, um Zellen zu verlagern und wird durch einen Mikromanipulator, die mit verschiedenen Graden der Automatisierung gesteuert werden.

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

18.5K Aufrufe.  Concordia University. Mikromanipulation von Hefezellen ist für meiotischen genetische Analyse oder diploiden Zygoten wählen erforderlich. Diese Mikromanipulationen werden mit dem Mikronadel einer Dissektionsmikroskop durchgeführt. Die Mikronadel wird verwendet, um Zellen zu verlagern und wird durch einen Mikromanipulator, die mit verschiedenen Graden der Automatisierung gesteuert werden.

Serie: Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Forschung

Biologie

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by homologous recombination (HR). In addition, HR represents an important mechanism of replication fork rescue following stalling or collapse. The regulation of the many reversible and irreversible steps of this complex pathway promotes its fidelity. The physical analysis of the recombination intermediates formed during HR enables the characterization of these controls by various nucleoprotein factors and their interactors. Though there are well-established methods to assay specific events and intermediates in the recombination pathway, the detection of D-loop formation and extension, two critical steps in this pathway, has proved challenging until recently. Here, efficient methods for detecting key events in the HR pathway, namely DNA double-stranded break formation, D-loop formation, D-loop extension, and the formation of products via break-induced replication (BIR) in Saccharomyces cerevisiae are described. These assays detect their relevant recombination intermediates and products with high sensitivity and are independent of cellular viability. The detection of D-loops, D-loop extension, and the BIR product is based on proximity ligation. Together, these assays allow for the study of the kinetics of HR at the population level to finely address the functions of HR proteins and regulators at significant steps in the pathway.

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

The D-loop capture (DLC) and D-loop extension (DLE) assays utilize the principle of proximity ligation together with quantitative PCR to quantify D-loop formation, D-loop extension, and product formation at the site of an inducible double-stranded break in Saccharomyces cerevisiae.

Nachweis homologer Rekombinationszwischenprodukte mittels Proximityligation und quantitativer PCR in Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

Genetik

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in situ. Owing to the strong interaction of an electron with the matter, high-resolution cryo-ET studies are limited to specimens with a thickness of less than 200 nm, which restricts the applicability of cryo-ET only to the peripheral regions of a cell. A complex workflow that comprises the preparation of thin cellular cross-sections by cryo-focused ion beam micromachining (cryo-FIBM) was introduced during the last decade to enable the acquisition of cryo-ET data from the interior of larger cells. We present a protocol for the preparation of cellular lamellae from a sample vitrified by plunge freezing utilizing Saccharomyces cerevisiae as a prototypical example of a eukaryotic cell with wide utilization in cellular and molecular biology research. We describe protocols for vitrification of S. cerevisiae into isolated patches of a few cells or a continuous monolayer of the cells on a TEM grid and provide a protocol for lamella preparation by cryo-FIB for these two samples.

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

We present a protocol for lamella preparation of plunge frozen biological specimens by cryo-focused ion beam micromachining for high-resolution structural studies of macromolecules in situ with cryo-electron tomography. The presented protocol provides guidelines for the preparation of high-quality lamellae with high reproducibility for structural characterization of macromolecules inside the&#160;Saccharomyces cerevisiae.

Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Biochemie

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Hefekolonie Embedding-Methode

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system has facilitated advanced genetic modification of Saccharomyces cerevisiae, a model organism and workhorse in industrial biotechnology. CRISPR-associated protein 12a (Cas12a), an RNA-guided endonuclease with features distinguishable from Cas9 is applied in this work, further extending the molecular toolbox for genome editing purposes. A benefit of the CRISPR/Cas12a system is that it can be used in multiplex genome editing with multiple guide RNAs expressed from a single transcriptional unit (single CRISPR RNA (crRNA) array). We present a protocol for multiplex integration of multiple heterologous genes into independent loci of the S. cerevisiae genome using the CRISPR/Cas12a system with multiple crRNAs expressed from a single crRNA array construct. The proposed method exploits the ability of S. cerevisiae to perform in vivo recombination of DNA fragments to assemble the single crRNA array into a plasmid that can be used for transformant selection, as well as the assembly of donor DNA sequences that integrate into the genome at intended positions. Cas12a is pre-expressed constitutively, facilitating cleavage of the S.&#160;cerevisiae genome at the intended positions upon expression of the single crRNA array. The protocol includes the design and construction of a single crRNA array and donor DNA expression cassettes, and exploits an integration approach making use of unique 50-bp DNA connectors sequences and separate integration flank DNA sequences, which simplifies experimental design through standardization and modularization and extends the range of applications. Finally, we demonstrate a straightforward technique for creating yeast pixel art with an acoustic liquid handler using differently colored carotenoid producing yeast strains that were constructed.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

The CRISPR/Cas12a system in combination with a single crRNA array enables efficient multiplex editing of the S.&#160;cerevisiae genome at multiple loci simultaneously. This is demonstrated by constructing carotenoid producing yeast strains which are subsequently used to create yeast pixel art.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genom Bearbeitung von Saccharomyces cerevisiae und die Schaffung von Hefe Pixel Kunst

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Biotechnik

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Microbes typically live in communities. The spatial organization of cells within a community is believed to impact the survival and function of the community1. Optical sectioning techniques, including confocal and two-photon microscopy, have proven useful for observing spatial organization of bacterial and archaeal communities2,3. A combination of confocal imaging and physical sectioning of yeast colonies has revealed internal organization of cells4. However, direct optical sectioning using confocal or two-photon microscopy has been only able to reach a few cell layers deep into yeast colonies. This limitation is likely because of strong scattering of light from yeast cells4.
Here, we present a method based on fixing and cryosectioning to obtain spatial distribution of fluorescent cells within Saccharomyces cerevisiae communities. We use methanol as the fixative agent to preserve the spatial distribution of cells. Fixed communities are infiltrated with OCT compound, frozen, and cryosectioned in a cryostat. Fluorescence imaging of the sections reveals the internal organization of fluorescent cells within the community.
Examples of yeast communities consisting of strains expressing red and green fluorescent proteins demonstrate the potentials of the cryosectioning method to reveal the spatial distribution of fluorescent cells as well as that of gene expression within yeast colonies2,3. Even though our focus has been on Saccharomyces cerevisiae communities, the same method can potentially be applied to examine other microbial communities.

We present a protocol for freezing and cryosectioning yeast communities to observe internal patterns of fluorescent cells. The method relies on methanol-fixing and OCT-embedding to preserve the spatial distribution of cells without inactivating fluorescent proteins within a community.

Kryoschneiden Hefe Gemeinschaften für die Prüfung Fluoreszenzmuster

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Effiziente Sporulation von<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; In einer 96-Multiwell-Format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Dissektion des endolymphatischen Sacks von Mäusen

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Dissektion des endolymphatischen Sacks von Mäusen

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

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