Arbeiten in Laboratorium des Autors wird von der Canadian Institutes of Health Research, der Canada Foundation for Innovation, der Natural Sciences and Engineering Research Council und der Concordia University gefördert.

Bau der diploiden Stämme Protokoll für die Herstellung von Diploiden durch Paarung <ol><li> Die ersten Stämme sollte auf YPD oder selektiven Medium getroffen werden, wenn nötig, einzelne Kolonien zu produzieren. Die beiden haploiden Stämmen sollte der entgegengesetzten Paarungstyps (dh Mata und MATα) werden. </li><li> Mit einer sterilen Impföse holen einen kleinen Teil einer Kolonie von einer der beiden haploiden Stämmen. Auf einer neuen YPD Platte Streifen die Schleife einmal in einer geraden Linie über die Platte. Markieren Sie die Richtung der Streifen mit einem Pfeil an der Unterseite der Platte. </li><li> Wiederholen Sie dies für den zweiten Stamm auf dem gleichen YPD Platte. Diesmal Streifen der Kolonie senkrecht zu den ersten, überqueren den ersten Streifen mit dem zweiten. Markieren Sie die Richtung des zweiten Streifen und notieren Sie den Bereich, wo der zweite Streifen kreuzt die erste. Dieser Bereich ist, wo Diploiden produziert werden. </li><li> Inkubieren Sie die YPD Platte bei 30 ° C über Nacht. </li><li> Replica Platte der YPD Platte auf selektiven Medien, die selektiv erlauben wird sich das Wachstum der neu gebildeten Diploiden. </li><li> Wählen Sie eine einzelne Kolonie, falls möglich, einen kleinen Teil der diploiden Streifen und Streifen auf dem gleichen selektiven Medium, um einzelne Kolonien zu erzeugen. </li></ol> Sporulation und Verdauung von Asci Protokoll <ol><li> Wählen Sie einzelne Kolonien von der Platte oben und kleine (1cm x 1cm) Flecken auf Sporulation (SPO) Platten und Inkubation bei 30 ° C für 3-7 Tage zur Sporulation. </li><li> Sporulation kann anhand der Zellen, die aus jedem Patch unter einem Lichtmikroskop überprüft werden. Legen Sie die Zellen auf einem Objektträger in 5-10 l Wasser, legen Sie ein Deckglas auf den Tropfen, und schauen auf das Vorhandensein von Asci. Wenn Asci nicht leicht zu finden sind dann legte zurück in den Inkubator. </li><li> Wenn es einen wirksamen Sporulation in einer der Patches, bereiten ein steriles 15 ml konische Röhrchen mit 100 &amp;mgr; l der Tetrade Saft. </li><li> Pick-Zellen aus diesem Sporulation Patch mit einer sterilen Impföse 3mm (Zellen sollten ¼ der Schleife Abdeckung) und in der Tetrade Saft. Vorsichtig schwenken die Schleife, damit die Zellen zu fallen die Schleife und vermischen sich mit der Lösung. </li><li> Lassen Sie in Tetrade Saft (mit Zymolyase) für 4-10 Minuten (abhängig von der Konzentration und Aktivität von Zymolyase und der Stamm selbst). Dies ermöglicht für die Verdauung der Zellwand umgibt die Ascosporen. </li><li> Markieren Sie die Ober-und Unterseite des Inokulums Region auf einer YPD Platte. </li><li> Optional. Reaktion kann durch Zugabe von 1 ml eiskaltem sterilen dH 2 O gestoppt werden Lassen Sie die Zellen für 5 Minuten zu begleichen. Entfernen 1ml aus dem Überstand anschließend leicht mischen mit der Hand und halten Sie auf dem Eis. </li><li> Nehmen 5μL der verdauten Zellen aus Schritt 5 und sanft Ort fällt in eine Linie in das Inokulum Region des vorgezeichneten YPD Platte. </li><li> Verwenden Sie eine sterile 3mm Impföse sehr vorsichtig die Tropfen 1-3 mal in einer Linie verteilt, während kaum Kontakt mit dem Agar. </li><li> Lassen Sie die Flüssigkeit in den Agar aufnehmen (Wenn Schritt 7 angegeben ist, wird dies, wenn die Verdauung der äußeren Zellwand reduziert werden oder zu stoppen). Fahren Sie mit dem Dissektionsmikroskop. </li></ol> Dissection der Asci Protokoll Beachten Sie, dass die folgenden Protokoll für einen Singer MSM System 200 Mikromanipulation Mikroskop beschrieben. Dieses Protokoll kann mit geringfügigen Änderungen, wenn mit einer manuellen Mikromanipulator wie Zeiss Mikromanipulator MR gefolgt werden. <ol><li> Konzentrieren Sie sich auf einen Bereich der Platte, wo die Hälfte des Feldes enthält Zellen und die Hälfte ist leer. Langsam bringen die Nadel in den Fokus, so dass es den leeren Bereich des Feldes berührt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Nadel nicht enthalten Zellen, die aus einer früheren Nutzung. Der Kontakt zwischen der Nadel und der Agar wird als dunkler schwarzer Kreis, der sich langsam rückt in den Fokus zu sehen. </li><li> Gehen Sie auf die Matrix an der Position A1 und markieren durch Durchstechen der Agar wieder. Dies ist zu helfen, die Orientierung der Platte, wenn es ausgeschaltet ist dem Mikroskop vor dem Abschluss übernommen. </li><li> Wechseln Sie in den Suchmodus. Suchen Sie einen Asci. Vorzugsweise wählen Asci, die in Bereichen, in denen die Zellen gut verteilt werden sind. Vermeiden Sie Bereiche mit Zellhaufen. Die vier Ascosporen aus einer Asci sollte noch miteinander verbunden werden. Zwei Ascosporen kann etwas größer sein als die anderen beiden. Vermeiden Sie Kommissionierung Asci, wo man Ascosporen ist locker und nicht auf den Rest der Ascosporen verbunden. </li><li> Pick up Ascus mit der Nadel. Langsam bringen die Nadel bis auf den Teller. Wenn der Schatten des Mikronadel gesehen wird, säumen diese mit dem Ascus, gepflückt zu werden. Wieder Ansatz der Nadel bis zum schwarzen Umriss eines Kreises (die Spitze der Nadel) zu sehen ist. Berühren Sie die Tetrade mit diesem Kreis und dann schnell ziehen Sie die Nadel entfernt. Achten Sie darauf, alle vier Ascosporen aus einem Ascus haben, um die Nadel eingehalten und dass keine weiteren Zellen wurden auf der Mikronadel, die nicht Teil dieser Ascus versammelt. </li><li> Ziehen Sie die Mikronadel weit weg von der Platte und gehen Sie zu der Matrix (für die ersten Ascus, gehen Sie zuPosition A1). Beachten Sie jede Position, wo ein Ascus ist umgezogen. Legen Sie die Ascus sich durch Berühren der Platte mit der Mikronadel und wegziehen, bis alle vier Ascosporen kommen aus dem Mikronadel. Leichtes Ausschlagen der Nadel Arm oder die Plattform Halten der YPD Platte ist oft bei diesem Schritt hilfreich. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3-5 und Platz Asci sich an aufeinander folgenden Positionen in der Matrix, bis die gewünschte Anzahl von Asci haben abgeholt worden. </li><li> Gehen Sie zurück zu jedem Ascus und brechen die vier Zellen abgesehen von Hänseleien mit der Nadel, tippen die Plattform sanft oder eine Kombination aus beidem. Pick-up die Zellen verlassen hintereinander in eine neue Position in der Matrix, bis jeder Ascosporen in jedem Ascus in Viererreihen getrennt ist. </li><li> Legen Sie die YPD Platte in einem Brutschrank bei 30 ° C für mehrere Tage, um das Wachstum Muster zu beobachten. </li><li> Replica Platte der sezierten Zellen selektiven Medium, wenn nötig. </li></ol> Umzug von Zygoten Protokoll <ol><li> Streak aus zwei haploiden Stämme mit entgegengesetzten Paarungstypen auf das entsprechende Medium, einzelne Kolonien zu erhalten. </li><li> Mate diesen beiden Stämmen wie oben beschrieben und lassen von 4 bis 6 Stunden (oder über Nacht, wenn notwendig) zu wachsen. </li><li> Prüfen Sie, ob Zygoten unter einem Lichtmikroskop. Zygoten als hantelförmige Zellen entweder mit oder ohne eine Knospe erscheinen. </li><li> Pick-Zellen mit einem 3mm Impföse (Zellen sollten ¼ der Schleife Abdeckung) und platzieren Sie sanft in 100 &amp;mgr; l sterilem dH 2 O. </li><li> Markieren Sie die Ober-und Unterseite des Inokulums Region auf einer YPD Platte. </li><li> Nehmen 5μL und sanft Ort fällt in eine Linie in das Inokulum Region des vorgezeichneten YPD Platte. </li><li> Verwenden Sie einen 3mm Impföse die Tropfen in einer Linie sehr sanft verteilen, während kaum Kontakt mit dem Agar. </li><li> Lassen Sie die Flüssigkeit in den Agar zu absorbieren. Fahren Sie mit dem Dissektionsmikroskop. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf einen Bereich der Platte, wo die Hälfte des Feldes enthält Zellen und die Hälfte ist leer. Langsam bringen die Nadel in den Fokus, so dass es den leeren Bereich des Feldes berührt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Nadel nicht enthalten Zellen, die aus einer früheren Nutzung. Der Kontakt zwischen der Nadel und der Agar wird als dunkler schwarzer Kreis, der sich langsam rückt in den Fokus zu sehen. </li><li> Gehen Sie auf die Matrix an der Position A1 und markieren durch Durchstechen der Agar wieder. Dies ist zu helfen, die Orientierung der Platte, wenn es ausgeschaltet ist dem Mikroskop vor dem Abschluss übernommen. </li><li> Wechseln Sie in den Suchmodus. Suchen Sie eine Zygote. </li><li> Pick-up eine Zygote mit der Nadel. </li><li> Legen Sie Zygoten individuell auf die Matrix. </li><li> Lassen Zygoten für mehrere Tage wachsen. </li><li> Replica Platte die Zygoten auf die entsprechenden selektiven Medium. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> Abbildung 1: Die Paarung von zwei haploiden Stämme gegenüber Paarungstypen erzeugt eine diploide Stamm. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> Abbildung 2: (A) A YPD-Platte mit thre Ergebnisse einer Paarung zwischen einer Temperatur sensiblen Stamm (mit einem leu2 Auxotrophie) und einem Wildtyp-Stamm (LEU2). Aufgeschlossenen Zellen sind in der Inokulum Region auf der linken Seite, wo dicke Wachstum zwischen den beiden schwarzen Linien gesehen zu verbreiten. Asci, die seziert haben zu wachsen gleichmäßig in der Matrix auf der rechten Seite angeordnet. (B) Die Platte in (A) wurde auf eine SD-Leucin Drop-out-Platte repliziert. Beachten Sie das 2:2 Wachstum für die LEU2 Marker zeigt ein validiertes Ascosporen seziert wurde. (C) Die Platte in (A) wurde auf eine YPD Platte repliziert und bei 37 ° C. Beachten Sie das 2:2 Wachstum, das eine weitere Bestätigung, dass ein Ascosporen seziert wurde.

<ol>
	<li>Sherman, F., Hicks, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+and+Dissection+of+Asci.">Micromanipulation and Dissection of Asci.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 21-37 (1991).</li></ol>

Hefe Dissektion ist ein nützliches Werkzeug, um neue Sorten mit den gewünschten Marker auszuwählen. Bei der Ermittlung des theoretischen Wachstumsmuster von vier Ascosporen ist es wichtig, bei der Genotyp des vegetativen Zelle aussehen. Wenn ein Plasmid vorhanden ist, muss man wissen, wenn es einzelne, niedrige oder hohe Kopie ist, da dies Auswirkungen auf die Ascosporen (s) das Plasmid erhalten und wird Prognosen und Schlussfolgerungen in Bezug auf die Stämme manipuliert zu beeinflussen. <p class="jove_content"...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Singer MSM System 200</td>
<td>Microscope</td>
<td>Singer Instruments</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-sorbitol</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>SOR508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zymolyase 100T</td>
<td>Reagent</td>
<td>Seikagaku Corporation</td>
<td>120493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>YEX401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>PEP 403</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>GLU501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>YNB406</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bio-tryptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRP402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>SOD002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium acetate</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>POA 301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>AGR003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenine sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>ADS201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-uracil</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>URA 241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tryptophan</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRP 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-histidine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>HIS 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-arginine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Amresco</td>
<td>0877-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-methionine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>MET 222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tyrosine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TYR 333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-isoleucine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>ISO 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-valine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>VAL 201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-lysine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>LYS 101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-phenylalanine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>PHA 302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>GLU 202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-threonine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>THR002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-leucine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>LEU 222</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of saccharomyces cerevisiae asci

Hefe ist ein sehr praktische Zwecke geeigneten Modells, das verwendet werden, um viele verschiedene zelluläre Prozesse zu studieren. Das gemeinsame Labor-Stamm<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Gibt es entweder in einer haploiden oder diploiden Zustand. Die Fähigkeit, Allele von zwei Haploiden kombinieren und die Möglichkeit, Änderungen an dem Genom einzuführen erfordert die Herstellung und Präparation von Asci. Asci Produktion von haploiden Zellen beginnt mit der Paarung von zwei Hefe haploiden Stämmen mit kompatiblen Paarungstypen eine diploide Stamm zu produzieren. Dies kann in eine Reihe von Möglichkeiten entweder auf einem festen Medium oder in flüssiger erreicht werden. Es ist vorteilhaft, für den Diploiden in Medium, das selektiv fördert ihr Wachstum im Vergleich zu entweder der haploiden Stämme auszuwählen. Die Diploiden sind dann erlaubt, auf nährstoffarmen Medium sporulieren zu Asci, ein Bündel von vier haploide Tochterzellen, die aus meiotischen Reproduktion der diploiden Form. Eine Mischung aus vegetativen Zellen und Asci wird dann mit dem Enzym Zymolyase zu verdauen entfernt die Membran sac um die Ascosporen der Asci behandelt. Mit Mikromanipulation mit einem Mikronadel unter einem Dissektionsmikroskop ein aufzuheben können einzelne Asci und trennen und verlagern die vier ascopores. Dissected Asci sind für mehrere Tage gewachsen und getestet für die Marker oder Allele von Interesse durch Replika-Plattierung auf geeigneten selektiven Medien.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Mikromanipulation von Hefezellen ist für meiotischen genetische Analyse oder diploiden Zygoten wählen erforderlich. Diese Mikromanipulationen werden mit dem Mikronadel einer Dissektionsmikroskop durchgeführt. Die Mikronadel wird verwendet, um Zellen zu verlagern und wird durch einen Mikromanipulator, die mit verschiedenen Graden der Automatisierung gesteuert werden.

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

dissection-of-saccharomyces-cerevisiae-asci

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

18.4K Aufrufe.  Concordia University. Mikromanipulation von Hefezellen ist für meiotischen genetische Analyse oder diploiden Zygoten wählen erforderlich. Diese Mikromanipulationen werden mit dem Mikronadel einer Dissektionsmikroskop durchgeführt. Die Mikronadel wird verwendet, um Zellen zu verlagern und wird durch einen Mikromanipulator, die mit verschiedenen Graden der Automatisierung gesteuert werden.

Serie: Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Forschung

Biologie

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR Wachte Redox-Titration der Cofaktoren von<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Die Messung der mRNA-Abbau Preise in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Verwenden<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Die Stämme

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Entwicklung Methode Regie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...