1. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Xylazin-Ketamin-Lösung (Ketamin ist eine kontrollierte Substanz. Detaillierte Aufzeichnungen aufzubewahren und Lösungen in einem sicheren, verriegelten Position gespeichert). </li><li> Reinigen und zu sterilisieren Ausrüstung. </li><li> Bereiten OP-Bereich durch Abwischen mit aseptischen Agent und dann Abdecken mit sterilen Papiertuch, und richten Sie den Mikromanipulator. </li></ol> 2. Vorbereitung der Zellen für die Transplantation <ol><li> Cells zu einer Konzentration von 100.000 Zellen / É l sollte resuspendiert werden, und obwohl nur 250.000 Zellen pro Maus transplantiert werden, ist ein Überschuss von Zellen für die Spritze loading Zwecke (Vorbereitung mindestens 300.000 Zellen pro Maus empfängt Zellen) benötigt. </li><li> Wash Zellen transplantiert 3 mal in HBSS in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zählen Sie die Zellen vor der endgültigen Spin. </li><li> Nach der letzten Spin-Down, dekantieren HBSS und lassen Fläschchen in umgekehrter Lage zu Tröpfchen vom Erreichen der Pellets zu verhindern. </li><li> Dry Innenwände mit einer UV-Bestrahlung, sterile Kimwipe. Lassen Sie die Pellets zu trocknen. </li><li> Halten Sie die Tube aufrecht, langsam und sehr zart die Zellen in die Hälfte der letzten gewünschte Volumen HBSS. </li><li> Messen Sie das Gesamtvolumen durch Pipettieren der Mehrheit der Suspension in einer Pipettenspitze und dann die Anpassung der Regler an der Pipette, bis die gesamte Suspension wird in der Pipettenspitze. Dies wird Ihnen sagen, wie viel mehr HBSS ist für die gewünschte Konzentration benötigt. </li><li> Bringen Sie Lautstärke auf den gewünschten Betrag, indem HBSS. </li><li> Legen Sie wieder auf dem Eis. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit von Zellen, wenn sie auf dem Eis nicht länger als 2 Stunden sein müssen. </li></ol> 3. Vorbereitung der Mäuse für Chirurgie und Transplantation <ol><li> Anesthetize der Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (100mg/kg) und Xylazin (10mg/kg) in ~ 100 ul Dosen oder eine gleichwertige Betäubung. Der gesamte Vorgang von der chirurgischen Vorbereitung auf Nähen dauert 30-40 Minuten. </li><li> (Optional: apply nummeriert, farbiges Klebeband um den Schwanz jeder Maus, um die Identifizierung zu gewährleisten) </li><li> Shave Bereich der Brustwirbelsäule der Maus aus dem unteren Rücken an den Hals, und sich 2 cm bilaterale von der Mittellinie, mit elektrischen Haarschneider. Das Haar sollte so nah wie möglich geschnitten werden (es kann notwendig sein, über den Bereich gehen mehrmals). </li><li> So entfernen Sie das restliche Haar, eine dünne Schicht von Enthaarungscreme (Nair) mit einem Gaze-Applikator. </li><li> Nach 1-2 Minuten, wischen Nair off mit Gaze leicht mit Seifenwasser benetzt. Die vorbereitete Fläche sollte sauber nackte Haut ohne jede streunende Stück Haar, das in die Wunde während der anschließenden Operation konnte. Sterilisieren Sie die vorbereitete Fläche mit Jodid-Lösung. </li></ol> 4. Laminektomie <ol><li> Häufig verändern und / oder sterilisieren Handschuhe während des gesamten Verfahrens. Bewegen Sie die Maus Rückenseite mit Kopf nach links (wenn Sie Rechtshänder sind). Drape Tier, um die Sterilität zu gewährleisten und dass nur die rasierte Fläche ausgesetzt ist. Machen Sie einen vertikalen Schnitt (~ 1.3cm) über die laminecomy site es mit rund Brustwirbel T8 bis T12. </li><li> Mit dem Graefe Zange in der linken Hand gehalten, fest Sicherung der Wirbelsäule bei T9 (Abbildung 1A) und heben Sie die Maus bis zur Krümmung der Wirbelsäule zu übertreiben. </li><li> Verwenden Sie das Skalpell an der Kreuzung zwischen T10 und T11, der Raum zwischen den beiden stacheligen Erhebungen des Gastes. Weitere Setzen Sie die Kreuzung durch eine sorgfältige Verschrottung der Muskelschicht weg bis auf die Knochen freizulegen (siehe Abbildung 1B, C). </li><li> Verwenden Sie die Schere, um klare Muskel vom Lamina und um den Stiel mit kleinen Scheren weiter. Dies eröffnet eine kleine Lücke zwischen den Wirbeln. Langsam und vorsichtig fügen Sie ein Blatt der Schere in diese Lücke und snip den Stiel. Achten Sie darauf, die Krümmung der Schere immer ist seitlich positioniert, weg von der Steckdose. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite. (Siehe Abbildung 1D, E) </li><li> Heben Sie die Lamina, um die Schnur zu entlarven und sorgfältig snip es ab. Achten Sie darauf, keine freie oder gezackte Knochenfragmente hinter sich zu lassen. (Siehe Abbildung 1F) </li><li> Vor der Injektion, sauber kein Blut entfernt mit einem sterilen Wattestäbchen. </li></ol> 5. Die Injektion von Zellen <ol><li> Befestigen Sie die Nadel mit Nadel Mutter, die Hamilton-Spritze und reinigen Sie diese durch Spülen mehrmals mit Wasser, dann 70% Ethanol und schließlich HBSS. Legen Sie nach jedem Kolben mit Wasser füllen, 70% Ethanol oder HBSS. </li><li> Bereiten Sie die Hamilton-Spritze für die Zell-Laden, indem Sie den Kolben und Lösen der Nadel Mutter und zieht die Nadel von der Spritze, um den Gegendruck zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass Ihnen der sorgfältige Umgang mit der Nadel und Mutter mit sterilen Handschuhen erfolgen. </li><li> Legen Sie 15μl der Zellen in Pipettenspitze und drücken Sie die Spitze fest in das hintere Ende der Spritze, um die Zellen in die Spritze zu laden. </li><li> Legen Sie den Kolben etwa 5 mm und ziehen Sie dann die Nadel Mutter. </li><li> Drücken Kolben until einige der Zellsuspension sieht ihn aus der Nadel. </li><li> Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in der Spritze und legen Sie die Spritze in die horizontale Position, um die Zellen aus, einen Gradienten durch die Schwerkraft zu verhindern. </li><li> Schnappen Sie der laminectomized Maus durch die spinalis dorsi verbindet die Stacheln von T8 und T9 (Abbildung 2B, C). </li><li> Klemmen Sie die hemostat nach links (vertikal) Mikromanipulator Arm, so dass die Maus Vorderpfoten in der Luft und an seinem hinteren Pfoten leicht berühren eine Plattform von sterilen Papiertüchern wie in den 2A und 2B. </li><li> Bringen Sie die Spritze mit dem rechten Arm Mikromanipulator (bei einer 70 °-Winkel) und schieben Sie die Spritze in die niedrigste Position möglich vor dem Spannen. </li><li> Stabilisieren Sie die Maus durch Pinning seinen Schwanz gegen die Papierhandtücher und langsam wieder in die Spritze (Abb. 2B). </li><li> Senken Sie die Nadel gegen die Schnur und die Nadel 1mm in der gegenüberliegenden Hemisphäre durch die dorsalen Mittellinie (Abbildung 2C). Die Spitze der Nadel in der grauen Substanz in der Nähe des zentralen Kanals werden. </li><li> Langsam injizieren 2.5μl von Zellen. Inject bei einer Rate von 1μl / 5 Sekunden. Nach der Injektion der Zellen, warten Sie 10 Sekunden und Einfahren der Nadel ein Zehntel wiederum zu einer Zeit, alle 10 Sekunden, bis die Nadel heraus ist der Schnur. Achten Sie auf mögliche Abfluss von Zellsuspension. </li><li> Schnell widerrufen die Spritze und entfernen Sie es aus dem Mikromanipulator Arm. Legen Sie die Spritze horizontal. </li><li> Lassen Sie die Maustaste und Transfer zum Nähen Tisch. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,7-5,14 für jede Maus, bis die Spritze geleert ist. Sterilisieren Instrumente (in den Sterilisator) und die Nadel (durch Abwischen mit Ethanol) zwischen den Tieren. Discard-Zellen und laden, wenn Verklumpung sichtbar ist. </li><li> Reinigen Sie die Spritze, wie in Schritt 5.1 zwischen den Lasten. </li></ol> 6. Nahtmaterial und post-op Pflege <ol><li> Suture den Einschnitt. Suture Nadel in die oberflächliche Faszie auf beiden Seiten des Einschnitts eingefügt. Der Faden wird durch aufgereiht, ziehen Oberflächenfaszie zusammen (Abbildung 3A) und deckt damit die freiliegende Rückenmark an der Stelle entfernt Lamina. Nicht Naht der Hautmuskel an der Haut oder der Skelettmuskulatur des Rückens. Ziehen Sie die gesamte Faden durch, so dass ca. 1 / 2 &quot;. Mit dem Nadelhalter, drei Knoten gebildet und Faden ist so nah an den Knoten wie möglich beschnitten. </li><li> Schließen Sie den Schnitt, indem zwei vor drei Heftklammern (je nach Größe des Einschnitts) auf der Haut (Abbildung 3B). Ziehen Sie die Haut weg von der Maus zu vermeiden Heften die darunter liegende Muskulatur. </li><li> Mit einem 26G3 / 8 Nadel injiziert 0,5 ml Ringer-Laktat-subkutan in den unteren Rücken weg von den Einschnitt. </li><li> Bewegen Sie die Maus zurück in seinen Käfig. Um zu gewährleisten, ist es in der Lage, um bequem atmen, während der Narkose, sollte die Maus auf die Seite in den Käfig gelegt werden, die Vermeidung von Kontakt zwischen der Operationsstelle und Käfig Betten. Käfige sollten auf Heizkissen platziert werden. </li><li> Mäuse überwacht werden nach der Narkose nachlässt, um die Blutung nachlässt gewährleisten, bleiben Nähten verschlossen, und dass Mäuse Rückkehr zur vor der Operation Mobilität. </li><li> Gönnen Mäusen einmal mit der analgetischen Buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg) nach der Operation. </li><li> Stellen Sie sicher, beeinträchtigt Mäuse haben einen ausreichenden Zugang zu Nahrung und Wasser: Wasser-Flaschen sind mit verlängerten 3,5-Zoll-Tüllen und Mäuse, die nicht in der Lage sind Hand gefüttert Wasser und / oder hochkalorische Nahrungsergänzungsmittel (Nutri-Cal, Tomlyn) zu Fuß angebracht sind. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Gewünschte Ergebnisse werden durch den Mangel an Efflux der Zellsuspension während der Injektion und durch die intakte Erscheinungsbild des Rückenmarks nach dem Verfahren identifizierbar. Zu diesem Zweck ist es unerlässlich, hell und direkte Beleuchtung der Maus über den Rücken bei der Laminektomie und während der Injektion zu haben. Optimale Beleuchtung wird durch Glasfaser-Beleuchtung (Abbildung 2A) erleichtert. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1 - Laminektomie (A) Nach Wirbel T9 ist fest mit dem Graefe Zange gehalten, (B, C) ​​Ergebnis der Wirbelsäule mit dem Skalpell zwischen T10 und T11 eine Aufnahme der Mikro-Schere zu erleichtern.. (D) Schieben Sie die Mikro-Schere durch den Raum zwischen T10 und T11 (Pfeile und Einschub, E) und schneiden Sie die Stiele auf jeder Seite (Striche, E) an der dorsalen Lamina frei. (F) Flip der Lamina bis rostral und hau sie ab. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Die Injektion von NSCs. (A) Die allgemeinen Aufbau der Mikromanipulator mit dem hemostat mit der Maus an den linken Arm und der Hamilton-Spritze auf dem rechten Arm in einem 70 Winkel. (B) Die hemostat halten spinalis dorsi verbindet die Stacheln von T8 und T9. (C) Die Nadel wird durch t gesenkter Mittellinie und in der grauen Substanz auf der gegenüberliegenden Hemisphäre, proximal an den zentralen Kanal. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Nahtmaterial und Wundverschluss. (A) Die Fäden werden auf die oberflächliche Faszie auf beiden Seiten des Einschnitts angewendet. (B) Der Schnitt wird mit 2-3 Klammern wie nötig (eine Klammer auf eine Wunde braucht 3 dargestellt) geschlossen.

<ol>
	<li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system:+host-virus+stand-off.">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li><li>Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+multiple+sclerosis:+how+do+we+cure+a+chronic+heterogeneous+disease.">The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease.</a> Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).</li><li>Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+demyelination+induced+by+coronavirus+JHM+(MHV-4):+molecular+identification+of+a+viral+determinant+of+paralytic+disease.">Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease.</a> Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).</li><li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination,+axonal+sparing,+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis.">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).</li><li>Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+engrafted+neural+stem+cells+is+mediated+by+CXCL12+signaling+through+CXCR4+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis.">Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).</li><li>Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+a+viral+model+of+multiple+sclerosis+induces+remyelination+in+the+absence+of+an+attenuated+inflammatory+response.">Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response.</a> Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).</li><li>Blakemore, W. F., Crang, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , (1992).</li><li>Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation.">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).</li><li>Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury.">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).</li><li>Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+patient+enters+trial+to+test+safety+of+stem+cells+in+spinal+injury.">First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury.</a> BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).</li></ol>

Eine gut durchgeführte Transplantation wird in erster Linie davon abhängen, die sorgfältige Laminektomie und Injektion der Zellen. Die primäre Gefahr, die während einer Laminektomie zu vermeiden, ist die Beschädigung des Rückenmarks. Dies kann während des Verfahrens selbst oder durch Schäden, die durch scharfe Knochensplitter hinter nach dem Verfahren nach links auftreten kann. Um diese zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Punkte der gekrümmten Mikro Scheren sind immer abgewandten Schnur und sorgfältig zu prüfen, die laminectomized Wirbelsäule, um sicherzustellen, dass alle Knochenfragmente geräumt sind und dass die restlichen Wirbelkörper Struktur nicht offen hervorstehende oder gezackte Ränder. Wie bereits erwähnt, wird die Erkennung von Efflux möglich sein, wenn das Licht hell und Licht auf die freigelegte Rückenmark während der Injektion. Efflux ist am ehesten mit 30-Gauge-Nadeln (gegenüber 33 Gauge) und wenn die Injektion zu rasch erfolgt passieren. Obwohl dieses Protokoll hat uns gute Ergebnisse, andere haben längere Wartezeiten (bis zu 5 Minuten), bevor das Zurückziehen der Nadel nach der Injektion 8,9 berichtet. Außerdem sind kleinere Gauge-Nadeln vorzuziehen, aber wir haben beobachtet, dass einige Zellen zu leicht werden lysiert, wenn bis 33 Gauge-Nadeln weitergegeben. Um die Effizienz zu maximieren, ist eine Transplantation Team Besatzung der vier verschiedenen Stationen (Maus prep, Laminektomie, Einspritzung und Nähte) wünschenswert. Außerdem sollte der Zeitpunkt für jedes Verfahren optimiert, um die Zeit der Zellen auf Eis warten zu minimieren. Zum Beispiel haben wir unseren Mäusen Transplantation in Gruppen von vier (die Anzahl der Dosen in jedem Laden der Spritze), beginnt die Person die Injektion der Zellen beim Laden der Spritze nach der dritten Maus wurde laminectomized hat und die Person, die die Mäuse sollten die folgenden betäuben Gruppe nach dem zweiten Maus der vorherigen Gruppe wurde laminectomized. Auf diese Weise können wir Zellen (oder Kontrolle media) in 40 Mäuse in ca. 3 Stunden Transplantation, obwohl jeder Maus ca. 30-40 min dauern wird. Zellersatztherapien für die Behandlung einiger Erkrankungen des ZNS befinden sich derzeit in klinischen Studien 10. Es gibt keinen Ersatz für in vivo-Modellen der NSC-Transplantation und unser Protokoll für die Transplantation von NSCs in das Rückenmark von Mäusen, die mit viralen induzierten Demyelinisierung ermöglicht den Einsatz eines wichtigen Modells der MS und kann auch leicht auf andere Modelle angepasst werden.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes / Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Phoenix Parmaceuticals </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazinhydrochlorid </td><td> MP Biomedicals </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Church &amp; Dwight Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10  ul Hamilton Spritze w / Abnehmbare Nadel </td><td> Hamilton Company </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton Needles, 30G oder 33 G, ½ Zoll, 30 °-Schliff </td><td> Hamilton Company </td><td> 7803-077803-05 </td><td> Testen Sie die Wirtschaftlichkeit Ihrer Zellen nach Passage durch Nadeln, die beste Spur zu bedienen identifizieren </td></tr><tr><td> Micro Scissors </td><td> World Precision Instruments </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> Kleine Graefe Zange </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaktischen </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modell 1772 Universal Holder </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaktischen </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modell 1773 Elektrodenhalter </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaktischen </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modell 902 kleines Tier stereotaktischen </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaktischen </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modell 960 links Elektrodenträger </td><td></td></tr><tr><td> Nahtmaterial </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer-Laktat- </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> Staples </td><td> Feine Wissenschaft </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hemostat </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Skalpelle, Größen 10,11 </td><td> Fischer </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> Nahtmaterial </td><td> ETHICON </td><td> 1676G </td><td> Größe 5-0, 3 / 8 &quot;Kreis, 19mm Nadel, 45cm geflochtener Faden </td></tr><tr><td> Reflex 7 gewickelt Clip-Applikator </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7mm Reflex Wundklammern </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Nadelhalter </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus

Mäuse mit dem neurotropen JHM Stamm Maus Hepatitis Virus (MHV) infiziert sind, entwickeln pathologische und klinische Ergebnisse ähnlich wie bei Patienten mit demyelinisierenden Erkrankung Multiple Sklerose (MS). Wir haben die Transplantation von NSCs in das Rückenmark von kranken Mäusen führt zu einer signifikanten Verbesserung sowohl Remyelinisierung und in klinischen Ergebnisse gezeigt. Zellersatztherapien für die Behandlung von chronischen neurologischen Erkrankungen sind heute Realität, und in-vivo-Modelle sind von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen den transplantierten Zellen und Wirtsgewebe Mikroumgebung. Diese Präsentation stellt eine angepasste Methode zur Transplantation von Zellen in das Rückenmark von JHMV-infizierten Mäusen. In Kürze stellen wir ein Verfahren für die i) Vorbereitung der NSCs vor der Transplantation, ii) pre-operative Betreuung von Mäusen, iii) Exposition des Rückenmarks über Laminektomie, iv) stereotaktische Injektion von NSCs und iv) die postoperative Versorgung .

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus at JoVE.com

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Die Transplantation von Maus neurale Stammzellen (NSCs) in das Rückenmark von Mäusen mit etablierten Demyelinisierung ist detailliert. Die Vorbereitung der NSCs, die Laminektomie der Brustwirbel 9 (T9), und die Transplantation von NSCs zusammen mit dem Pre-und post-operative Betreuung der Mäuse dargestellt.

Chirurgische Transplantation von Maus Neural Stem Cells in den Rückenmark von Mäusen mit neurotropen Maus Hepatitis Virus infiziert

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K Aufrufe.  University of California, Irvine. Die Transplantation von Maus neurale Stammzellen (NSCs) in das Rückenmark von Mäusen mit etablierten Demyelinisierung ist detailliert. Die Vorbereitung der NSCs, die Laminektomie der Brustwirbel 9 (T9), und die Transplantation von NSCs zusammen mit dem Pre-und post-operative Betreuung der Mäuse dargestellt.

Serie: Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Forschung

Neurowissenschaften

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic Transplantation von Interneuron Vorstufen in frühen postnatalen Mäusegehirnen

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Transplantation von chemogenetisch hergestellten kortikalen Interneureuren in frühpostnatale Maushirne

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...