Wir danken Mitglieder der Wingert-Labor für hilfreiche Diskussionen des AKI Biologie und Zebrafisch-Techniken und C. Diep für die gemeinsame Nutzung seiner Methylcellulose Rezept. Die Autoren möchten auch unseren Dank an die Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter der Notre Dame-Zentrum für Zebrafisch Forschung für eine ausgezeichnete laufenden Tierhaltung Betreuung unserer Zebrafisch Kolonie auszudrücken. Mittel aus dem NIH-NIDDK Zuschussvergabe DK083512 und großzügige Labor Anschubfinanzierung von der University of Notre Dame, unterstützt diese Arbeit.

1. Mikroinjektion Verfahren, um die Zebrafisch-Label Vorniere proximalen Tubulus Epithel Für dieses Verfahren verwenden wir eine Mikroinjektion System (Harvard Appartus, PLI90), mit Druckluft durch einen Kompressor (Jun-Air, Modell 6-4), und Mikromanipulator Geräten (Narishege Teile MN151, IP3, und gji) geliefert, die montiert auf einem Stereomikroskop Bahnhof (Nikon, SMZ-Zoom 645) nach den Herstelleranweisungen. Dextran-Konjugate werden leicht durch das Nephron proximalen Tubulus Endozytose, so dass bevorzugte Kennzeichnung dieser epithelialen Zell-Population 9. <ol><li> Die Exposition gegenüber Methylenblau kann akzentuieren die Autofluoreszenz der Dottersack und macht die Visualisierung der Nephron Tubuli erschwert. </li><li> Heben Sie die befruchteten Embryonen bei 28,5 ° C zu einem Entwicklungs-Zeitpunkt zwischen 48-55 Stunden nach der Befruchtung (HPF). Dies ist die ideale Bühne, um Larven microinjections wegen der Leichtigkeit, mit der intramuskulären Mikroinjektion durchgeführt werden durchführen können, und weil die Nierenfunktion beginnt zu diesem Zeitpunkt. </li><li> Entfernen Sie das Chorion von jedem unhatched Zebrafisch mit einer feinen Pinzette. Spülen Sie das Chorion Schutt aus der Petrischale und füllen die Schale mit 30 ml modifizierte E3 Lösung. </li><li> Bereiten Sie eine Injektion Fach für die Embryonen. Unsere bevorzugten Spritzgießwerkzeug ist von 1,5% agarose/E3 gemacht, in dem dreieckigen Vertiefungen gebildet sind, dass der Embryo im Inneren kann zur Injektion positioniert werden. Um das Spritzgießwerkzeug, float wir eine Kunststoff-Form mit keilförmigen Vorsprünge (beschrieben im Detail bisher 11) in einer Petrischale mit einer Grundfläche von 1,5% Agarose gefüllt. </li><li> Bereiten Glas Mikroinjektion Nadeln durch Ziehen Kapillaren mit einer Nadel Abzieher, wie in der Zebrafisch-Buch 10 beschrieben. In kurzen, ziehen Sie den Glaskapillaren dann feinen Metall-Pinzette an der Spitze der Mikroinjektionsnadel geschnitten, um eine Spitze mit einer scharfen Spitze bei der Betrachtung der Nadelspitze unter einem Stereomikroskop. Bewahren Sie den Schnitt Nadeln in einer Petrischale abgedeckt und flach auf Modelliermasse auf der Schnittkante zu schützen und zu verhindern Staubansammlung. </li><li> Vorbereiten der Injektionslösung mit dem proximalen Tubulus-Label. Lösen Sie 40 kD Dextran-Fluorescein-Konjugat (Invitrogen, D1845) bei einer Konzentration von 1 mg / mL in destilliertem Wasser. </li><li> Um die Fische zu betäuben, mit 5 ml 0,2% Tricaine pH 7,0 bis der Petrischale mit dem Zebrafisch-Larven in 30 ml E3. Die Fische werden betäubt, wenn sie zeigen nicht mehr die Touch-Reaktion. Es ist wichtig, dass der Fisch vollständig narkotisiert werden, oder sie werden beim Versuch, sie zu spritzen zucken. </li><li> Übertragen Sie die betäubten Fische ein Spritzgießwerkzeug Tablett mit einem Kunststoff-Transfer-Pipette. Position des Tieres mit dem Kopf in den tiefsten Teil des dreieckigen Depression gut, und auf seiner Seite, so dass der Stamm entlang der abgewinkelten Seite der gut ruhen. </li><li> Führen Sie die intramuskuläre Mikroinjektion. Legen Sie einen Schnitt Nadel mit 2-3 ul von Dextran Fluorescein, und injizieren das Tier in einem Koffer Somiten mit ca. 1 nL Lösung. Ziel für den oberen Teil des Somiten, und vermeiden Sie den Dottersack Erweiterung. Dies gewährleistet, dass das Nephron Tubuli nicht mechanisch durch die Mikroinjektion Prozess gestört. </li><li> Transfer injiziert Zebrafisch, um eine saubere Petrischale und fügen geändert E3 Lösung. Spülen Sie die Tiere 3 mal mit frischen E3, um alle Spuren von Tricaine entfernen. Bedecken Sie den Deckel der Petrischale mit Alufolie, um Licht-Schutz für die Dextran bieten, und kehren die Tiere an die 28 ° C Inkubator über Nacht. </li></ol> 2. Gezielte Laserablation von proximalen Tubuluszellen Für dieses Verfahren, verwenden wir ein Stereomikroskop mit Epifluoreszenz Tiere mit Dextran Fluorescein hell markierten proximalen Tubuli der Gäste und wählen Sie diese für die Laser-Ablation. Dann verwenden wir eine gepulste MicroPoint Lasersystem (Photonic Instruments, Inc.), die zu einem zusammengesetzten Mikroskop (Nikon Eclipse 80i mit epifluoreszenten Attachment) angehängt wurde, und kalibriert für den Einsatz nach den Herstelleranweisungen, um Nephron Zellablation durchzuführen. Wir haben den größten Erfolg in Zellablation mit einem FITC-Filter, dass der Forscher ermöglicht, die fluoreszierende Tubulus Regionen unter Hellfeld-Beleuchtung zu sehen. Im Vorfeld dieses Verfahrens vorzubereiten Immobilisierung Medien für die Ablation durch Auflösen von 1,5% Methylcellulose in 0,02% tricaine/E3. Shop Aliquots von Methylcellulose für den sofortigen Einsatz bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C für eine langfristige Lagerung. <ol><li> Anesthetize der 72 hpf Zebrafisch durch Zugabe von 5 ml 0,2% Tricaine pH 7,0 bis der Petrischale mit dem Zebrafisch-Larven in 30 ml E3. Die Fische werden betäubt, wenn sie zeigen nicht mehr die Touch-Reaktion. Es ist wichtig, dass der Fisch vollständig narkotisiert werden, oder sie werden auf dem Versuch, die Laser-Ablation führen zucken. </li&gt; <li> Untersuchen Sie die injizierten Tiere unter den entsprechenden fluoreszierenden Einstellung und wählen Tieren, bei denen Sie auf einfache Weise kann der proximalen Tubuli. </li><li> Transfer ausgewählter Embryonen in eine separate Schüssel mit Tricaine. Tiere können bis zu 30 Minuten narkotisiert, bevor Zellablation. Wenn Sie&gt; 15 Tiere Punktzahl geben diese in eine separate Schüssel mit frischem geändert E3 in Erwartung Ablation als jede Zelle Ablation dauert einige Minuten. </li><li> Zur Durchführung der Ablation, Transfer ein narkotisierten Zebrafisch zu einer kleinen Petrischale mit 1,5% methylcellulose/0.02% Tricaine für 2 Minuten auf den Embryo in Immobilisierung Medien zu waschen. </li><li> Anschließend Transfer des Embryos zu einem Glas Depression Folie mit einem Rückgang von 1,5% methylcellulose/0.02% Tricaine. Gently Position das Tier mit einer feinen Sonde, dass seine Bauchseite des Schiebers und dorsalen Seite nach oben weist. </li><li> Legen Sie die Folie auf der compund Mikroskoptisch, und konzentrieren sich auf der Rückenseite des Tieres. Führen Ablation des Nephron Zellen unter Fokus durch Drücken des Pedals. Sie werden sehen, Zerstreuung der Fluoreszenz als die renale Epithelzellen abgetragen werden (Abbildung 1A). </li><li> Gently übertragen abgetragen Tier zu einem gut in einer 12-Well-Schale für die spätere Kultivierung. Spülen Sie den E3 2-3 mal abzuwaschen der Methylcellulose. </li><li> Nach der Injektion erhöhen das Tier auf die gewünschte Zeitpunkt und führen gewünschte Analyse nach etablierten histologischen und molekularbiologischen Techniken für junge Zebrafischembryonen (Abbildung 2). </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Die Daten, die in Abbildung 1 dargestellt sind, zeigen die Ablation Zeitverlauf. Nach intramuskulären Injektion mit Dextran-Konjugate, die proximalen Tubulus bevorzugt gekennzeichnet. Die Injektion von Dextran-FITC wurde verwendet, um die Niere für die Laser-Ablation-Label, und abgetragen Tiere wurden mit Dextran-Rhodamin an einem zusätzlichen Zeitpunkt folgende Ablation injiziert, um den proximalen Tubulus Bevölkerung reimage. Expression-Analyse-Techniken wie in-situ-Hybridisierung können Änderungen in festen Proben, die bei einzelnen Zeitpunkten folgenden Zellablation, wie in Abbildung 2 gezeigt, zu analysieren. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1: Laser Ablation wird durch eine schnelle Regeneration des Röhrchens Epithel gefolgt (AC) Zeitverlauf der zellulären Veränderungen während und nach Laser-Ablation von Zebrafischlarve proximalen Tubuli zum Zeitpunkt der Ablation (Tag 3, Teil A), oder einer oder drei. Tage nach der Ablation (Tag 4, Teil B, Tag 7, Teil C). (Top) Schaltpläne zeigen Position des Nephron mit Dextran-FITC (grün) und Dextran-Rhodamin (rot), und (unten) Live-Bilder von Kontroll-und Laser-Ablation (LA) Nephronen. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2:. Analyse der Genexpression nach Laserablation Nach Laserablation am Tag 3 wurden die Embryonen fixiert und durch whole mount in situ Hybridisierung an Transkripten für slc20a1a, die den proximalen Tubulus-Segment des Nephrons Markierung zu erkennen. (A) die Kontrolle Embryos, die nicht auf Laser-Ablation unterzogen wurde, (B) ein Embryo, in denen eine große Strecke des Tubulus Epithel abgetragen wurde und (C) ein Embryo, in denen ein kurzes Intervall von Tubulus Epithel wurde abgetragen. Schwarze Linie zeigt das Ausmaß des proximalen Tubulus in A Referenz darstellen, zeigen blaue Linien das Ausmaß der Laser-Ablation in Platten BC und * zeigt die Steuerung (nicht abgetragen) kontralateralen Nephron in Platten BC.

<ol>
	<li>Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure.">Acute renal failure.</a> New Eng. J. Med. 334, 1448-1460 (1996).</li><li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+and+proliferation+of+surviving+epithelial+cells+in+acute+renal+failure.">Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure.</a> J Am. Soc. Nephrol. 14, 55-61 (2003).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+kidney+development.">The cellular basis of kidney development.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 509-529 (2006).</li><li>Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney Int. 73, 1120-117 (2008).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervos, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, 923-9229 (2005).</li><li>Cosentino, C. i. a. n. c. i. o. l. o., Roman, C., Drummond, B. L., A, I., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+to+Study+Acute+Kidney+Injury.">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), e2079-e2079 (2010).</li><li>Drummond, I. A., Majumdar, A., Hentschel, H., Elger, M., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C. F., Stemple, D. L., Zwartkruis, F., Rangini, Z., Driever, W., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+zebrafish+pronephros+and+analysis+of+mutations+affecting+pronephric+function.">Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function.</a> Development. 125, 4655-4657 (1998).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394-e1394 (2009).</li><li>Humphreys, B. D., Valerius, M. T., Kobayashi, A., Mugford, J. W., Soeng, S., Duffield, J., McMahon, A. P., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+epithelial+cells+repair+the+kidney+after+injury.">Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.</a> Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).</li><li>Bussolati, B., Hauser, P. V., Carvalhosa, R., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+stem+cells+to+kidney+repair.">Contribution of stem cells to kidney repair.</a> Curr. Stem Cell Res. Therapy. 4, 2-8 (2009).</li><li>Devarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+mechanisms+of+ischemic+acute+kidney+injury.">Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1503-1520 (2006).</li><li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity:+an+integrative+point+of+view.">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kid. Int. , (2010).</li><li>Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Zebrafisch ist ein weit verbreitetes Modell-Organismus in vielen Aspekten von Wissenschaft, sind die Anwendungen, von denen immer 6. Der Einsatz des Zebrafisch-Modell-System in der Studie von Nierenerkrankungen wie der AKI hat wichtige Beobachtungen geführt und wird auch weiterhin ein gutes Modell, um Nierenschäden 7,8 studieren. Mit einem Genom, das sequenziert wurde und viele molekulare Protokolle vorhanden, wird es immer einfach zu hoch Zebrafisch-Forschung, dass transgene Modelle, Gen-Knockdown und misexpression Studien nutzt durchzuführen. Der Zebrafisch hat einen kurzen Lebenszyklus mit großen Generation Größen und gut definierten Entwicklungsstadien. Darüber hinaus sind die Zebrafisch-Embryonen und Larven weitgehend transparent, so dass bildgebende Verfahren möglich, ohne Dissektion des Organismus. Während embryonale und Larvenstadien, hat der Zebrafisch ein pronephric Niere von zwei Nephronen, die sichtbar in diesen Entwicklungs-Zeitpunkten bleiben bestehen. Zebrafisch pronephric Nephrone sind analog der Struktur und Funktion, um ihre Kollegen von Säugetieren, so dass es ein gutes Modell für akutes Nierenversagen Studien 4,5. Die Niere ist entscheidend für das Überleben von Menschen und anderen Wirbeltieren, die als das Organ, das dem Körper Flüssigkeit Stoffwechselschlacken reinigt. Dieses reinigende Funktion beruht auf der Fähigkeit der Niere Nephronen, um das Blut filtern, und ändern Sie dann das Filtrat stickstoffhaltigen Abfälle für die Sekretion zu sammeln und gleichzeitig pflegen Flüssigkeits-und Elektrolythaushalt. Nephron sind von einer Blut-Filter-, Epithel-Tubulus, und Drain in einen Kanal zusammen. Die strukturelle und funktionelle Integrität aller drei Teile ist ein integraler Bestandteil Nephron Funktion. Verschiedene Beleidigungen auf die Niere, einschließlich der Exposition gegenüber nephrotoxins, Ischämie oder Verschluss der ableitenden Abfluss Verträge können in AKI 1 Ergebnis. Die Pathologie der AKI wird oft mit akuter tubulärer Nekrose 1,2 verbunden. Klinische Studien haben gezeigt, dass daraus Nierenversagen hat eine Sterblichkeitsrate, die irgendwo im Bereich von 7 bis 80% kann je nach Ursache und Kontext der Niereninsuffizienz. Allerdings ist eine schnelle Diagnose und Umkehr der zugrunde liegende Ursache der AKI zunehmend mit Rückgewinnung über die Regeneration der nekrotischen Nephron Tubuli assoziiert. Aktuelle Schicksal Mapping-Studien haben gezeigt, dass die großen Zellpopulation, die beschädigt Nephron Tubuli füllt Epithelzellen, die von benachbarten, unverletzten Bereichen 12 stammen, werden. Diese Erkenntnisse haben nicht die Möglichkeit, dass die renale Stammzellen / Vorläuferzellen können in dem Prozess zu beteiligen eliminiert und unabhängige Berichte lassen vermuten, dass Knochenmark-abgeleiteten Zellen kann zu einer Niereninsuffizienz Regeneration 13 zu fördern. Es ist klar, dass die weitere Untersuchungen erforderlich sind, um besser zu lösen zellulären Quellen der renalen epithelialen Regeneration. Beide Nephron Regeneration und Entwicklung teilen sich die Erscheinung der Schalter in der zellulären Zustand zwischen mesenchymalen und epithelialen Phänotyp. Während Nephron Entwicklung, mesenchymalen Vorläuferzellen in eine stationäre Phänotyp differenzieren, Befestigung an einer Basalmembran, die Tubulusepithel 3 zu bilden. Die Spekulationen Migrationsphänomen von Epithelzellen folgenden akutem Nierenversagen erfordert eine Dedifferenzierung zu einem mesenchymalen Phänotyp. Interessanterweise deuten neuere Studien, dass mesenchymale Zellen in geschädigten Nieren ein Expressionsprofil ähnlich einer mesenchymalen Zellen während der Entwicklung 14 weisen. Verschiedene Berichte wurden Änderungen in Zelladhäsionsmoleküle, Matrixproteine, Cytokine und Chemokine entdeckt. Nach der geplanten mesenchymalen zu epithelialen Übergangs-Zellen auf einer Basalmembran wieder zusammenbauen und reinitiate tubulären Epithelzellen Aktivitäten. Bestimmen die Gene wichtig in diesem Prozess weiterhin ein Thema der Forschung für unser Labor und andere. Ein Großteil der Arbeit auf die wichtigsten Faktoren in diesem Prozess klären bleibt noch zu tun, aber deutliche Fortschritte auf dem Gebiet wurde durch die Untersuchung der Auswirkungen von Gentamicin angekündigt worden. AKI und Nierenversagen durch Gentamicin verursacht wird relevant in Anbetracht der Prävalenz von nephrotoxischen Verbindungen in der Medizin 15 verwendet. Wird als eine Behandlung für gram-negative bakterielle Infektionen, führt die Verwaltung von Aminoglykosiden zu akuten Verletzungen in 10-25% der Fälle. Das Medikament führt zu einer Fülle von negativen zelluläre Effekte zusammen was in Apoptose oder Nekrose in vielen Tubuluszellen. Studien haben das Medikament bevorzugt an ein komplexes durch Megalin und cubulin, dass in der Endozytose beteiligt ist gebildet gefunden. Diese Moleküle sind in Hülle und Fülle in den Epithelzellen des proximalen Tubulus gefunden, obwohl sie nicht darauf beschränkt, um die Expression in diesen Zellen sind. Durch zelluläre Signalwege führt die Induktion von oxidativem Stress, Freisetzung von Vasokonstriktoren, die Erschöpfung des zellulären ATP, Hypoxie, Hemmung der Phospholipasen bewirken Gentamicin und ähnliche AntibiotikaApoptose und Nekrose in Epithelzellen. Darüber hinaus auslösen Antibiotika mesangialen Kontraktion im Nephron Blutfilter (Glomerulus), was zu einem Abfall der glomerulären Filtrationsrate und negativ verändern die Fähigkeit der Niere in den Blutkreislauf zu filtern. Die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, immunstimulierende Moleküle, und die Aktivierung von Phospholipasen haben diffuse Effekte in das Nephron, die Schaffung eines katastrophalen Pathologie, die zu akutem Nierenversagen führt. Während Gentamicin und ähnliche Antibiotika Studien wurden und werden auch weiterhin wichtige Werkzeuge für die Nieren Regeneration Forschung, fehlt es ihnen an einer Präzision, die nützlich für die Behebung bestimmter Fragen können. Unser System für die Verwendung der Zebrafisch in Verbindung mit einem Laser-Ablation-Verfahren in diesem Protokoll beschriebenen Antworten die Notwendigkeit einer solchen präzisen Recherche-Tool. Laser-Ablation können die Forscher Zellzerstörung in Schwerpunkte der Nierentubuli zu induzieren, die von einem kleinen (2-3) bis groß (&gt; 50-100) Populationen, mit unerreichter Präzision. In diesem Protokoll, nutzen wir eine zuvor entwickelte Methode der Exposition gegenüber Dextran-Konjugate bevorzugt Label proximalen Tubulus epithelialen Populationen. Alternativ könnte transgenen Zebrafisch Linien, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren in einer oder mehreren Regionen des Röhrchens verwendet werden. Zum Beispiel, cadherin17: Ausstellung eGFP transgenen Zebrafisch starke Fluoreszenz im distalen Tubulus Regionen (obwohl schwach in proximalen Populationen) und könnte wertvoll sein für das Studium der Regeneration in anderen Tubulus Segmente 16. Die Sichtbarkeit des Nephron ermöglicht Zeitraffer-Video-Aufzeichnung von zellulären Veränderungen über die Zeit. Wenn es mit der Genexpression Studien wie whole mount in situ Hybridisierung oder Immunhistochemie gekoppelt, können die Forscher molekulare Veränderungen in das Nephron im Laufe der Zeit zu erkennen. Zusammen genommen können solche Strategien zu beginnen, um ein dynamischeres Verständnis der Ereignisse, die bei Nieren-Epithelzellen zerstört werden transpire formulieren. Die großen Vorbehalt unserer Laser-Ablation-Modell ist, dass sie Teilaspekte der physiologischen Bedingungen, die im menschlichen AKI transpire rekapitulieren. Der Zelltod durch sofortige physische Schädigung induzierte unterscheidet sich von der Kaskade von Ereignissen, die zur Nekrose führt in den Zellen, und als solche die humoralen Faktoren in den verschiedenen Mikroumgebungen dürfen nicht identisch sein. Darüber hinaus gibt es Beweise für Apoptose bei Nierenversagen induziert wird, und es ist nicht bekannt, ob solche Folgen nach Beleidigung transpire mit einem Laser. Aber ebenso, wie der Zellkultur ist ein Werkzeug, bessere Antworten auf einige Fragen, die ein sehr kontrollierter Umgebung erfordern, Laser-Ablation wird als hoch in-vivo-Modell des AKI gesteuert dienen. Als solcher sammelte die Erkenntnisse aus Nierenepithelzellen Ablation Studien im Zebrafisch wird wahrscheinlich zu fördern Entdeckung der fundamentalen Erkenntnisse, die auf Untersuchungen von anderen renalen Verletzungen angewendet werden und können potenziell genutzt werden, um eine bessere Diagnostik in den Menschen zu schaffen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Embryo Gerichte </td><td> Falke </td><td> 35-1005 </td></tr><tr><td> Dissektionszangen </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Injektionsnadeln </td><td> Sutter Intruments </td><td> BF100-50 bis 10 </td></tr><tr><td> Ultrapure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 40 Kilodalton (kD) Dextran-Fluorescein </td><td> Invitrogen </td><td> D1845 </td></tr><tr><td> Plastic Transfer-Pipette </td><td> Samco Scientific, Fisher </td><td> 204, 13-711-23 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> Sigma </td><td> M0262 </td></tr><tr><td> Depression schieben </td><td> Fischer </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> 12-well Schale </td><td> Corning </td><td> 3512 </td></tr></tbody></table>

laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration

Akute Nierenschädigung (AKI) ist durch eine hohe Sterblichkeitsrate von einer Verschlechterung der Nierenfunktion über einen Zeitraum von Stunden oder Tagen, bei Nieren-Fehler 1 gipfelt aus. AKI kann durch eine Reihe von Faktoren, einschließlich Ischämie, medikamentöse Toxizität oder obstruktiver Körperverletzung 1 verursacht werden. Dies führt zu einer Unfähigkeit, Flüssigkeits-und Elektrolyt-Homöostase aufrecht zu erhalten. Während AKI ist seit Jahrzehnten beobachtet, über wirksame klinische Therapien erst noch entwickelt werden. Interessanterweise wieder einige Patienten mit AKI Nierenfunktion im Laufe der Zeit, eine mysteriöse Phänomen, das nur ansatzweise hat 1,2 charakterisiert. Forschung mit Säugetieren Modelle der AKI hat gezeigt, dass ischämische oder Nephrotoxin-verletzten Nieren Epithelzelle Todeserfahrung in Nephron Tubuli 1,2, die funktionellen Einheiten der Niere, die sich aus einer Reihe von spezialisierten Regionen (Segmente) der epithelialen Zelltypen 3 sind gemacht . Innerhalb Nephrone ist epithelialen Zelltod höchsten in proximalen Tubuluszellen. Es gibt Hinweise darauf, dass Zellzerstörung durch Dedifferenzierung, Proliferation und Migration von umgebenden Epithelzellen, die das Nephron regenerieren kann ganz 1,2 befolgt wird suggeriert. Allerdings gibt es viele unbeantwortete Fragen über die Mechanismen der renalen epithelialen Regeneration, angefangen von den Signalen, die diese Ereignisse modulieren, die Gründe für die breite Variation der Fähigkeiten von Mensch zu Mensch verletzt Nieren regenerieren. Die Larven Zebrafisch bietet ein hervorragendes Modell, um Nieren Epithelregeneration Studie als pronephric Niere Nephronen, dass bei höheren Wirbeltieren, einschließlich Säugetieren 4,5 konserviert sind zusammengesetzt ist. Die Nephrone mit Zebrabärblingembryonen visualisiert werden können mit der Fluoreszenz-Techniken wegen der relativen Transparenz des jungen Zebrafisch 6. Dies bietet eine einzigartige Gelegenheit, Bildzelle und molekularen Veränderungen in Echtzeit, im Gegensatz zu Säugetieren Modelle, bei denen Nephrone sind unzugänglich, weil die Nieren strukturell komplexen Systemen innerhalb des Tieres internalisiert werden. Jüngste Studien haben das Aminoglykosid Gentamycin als toxische Erreger für das Studium der AKI und anschließende Nierenversagen eingesetzt: Gentamicin und andere Antibiotika haben gezeigt, dass AKI beim Menschen verursachen, und Forscher haben Methoden entwickelt, um dieses Anbieters nutzen, um Nierenschäden im Zebrafisch 7 auslösen , 8. Allerdings sind die Effekte von Aminoglykosid-Toxizität in Zebrafisch-Larven katastrophal und tödlich, die eine Schwierigkeit stellt bei der Untersuchung epithelialen Regeneration und Funktion im Laufe der Zeit. Unsere Methode stellt der Einsatz von gezielten Zellablation als neuartiges Werkzeug für die Untersuchung von epithelialen Verletzungen im Zebrafisch. Laser-Ablation gibt Forschern die Möglichkeit, den Zelltod in einer begrenzten Population von Zellen zu induzieren. Unterschiedliche Bereiche der Zellen können auf der Basis morphologischer Standort, Funktion, oder sogar die Expression eines bestimmten zellulären Phänotyp ausgerichtet sein. So werden Laser-Ablation Erhöhung der Spezifität von dem, was Forscher studieren können, und kann ein leistungsstarker neuer Ansatz, um Licht auf die Mechanismen der renalen Epithelregeneration vergossen werden. Dieses Protokoll kann im Großen und Ganzen angewendet werden, um Zellpopulationen in anderen Organen im Zebrafisch-Embryos, um Verletzungen und Regeneration in einer beliebigen Anzahl von Zusammenhängen von Interesse Studie Ziel.

Watch this Scientific Journal Video about Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration at JoVE.com

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Akute Nierenschädigung (AKI) in den Menschen ist ein bekanntes klinisches Problem durch eine Schädigung der Epithelzellen, die Nieren Nephrone umfassen verursacht und AKI ist mit hohen Sterblichkeitsraten von 50-70% 1 verbunden. Nach epithelialen Zell-Zerstörung, haben Nephronen eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration, obwohl die Mechanismen und Einschränkungen, die dieses Phänomen Führung schlecht bleiben verstanden. In diesem Video-Beitrag beschreiben wir unsere Technik für die gezielte Laser-Ablation von Nieren Nephron Zellen in der Zebrafisch-Embryos Niere oder Vorniere. Unsere neue Methode kann verwendet werden, um Nephrotoxizität-induzierte Modelle der AKI ergänzen und gewinnen Sie einen hochauflösenden Verständnis der Zell-und molekulare Veränderungen, die mit Epithelregeneration in der Niere Nephron verbunden sind.

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

laser-ablation-zebrafish-pronephros-to-study-renal-epithelial

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Aufrufe.  University of Notre Dame. Akute Nierenschädigung (AKI) in den Menschen ist ein bekanntes klinisches Problem durch eine Schädigung der Epithelzellen, die Nieren Nephrone umfassen verursacht und AKI ist mit hohen Sterblichkeitsraten von 50-70% 1 verbunden. Nach epithelialen Zell-Zerstörung, haben Nephronen eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration, obwohl die Mechanismen und Einschränkungen, die dieses Phänomen Führung schlecht bleiben verstanden. In diesem Video-Beitrag beschreiben wir unser...