Wir danken Mitglieder der Wingert-Labor für hilfreiche Diskussionen des AKI Biologie und Zebrafisch-Techniken und C. Diep für die gemeinsame Nutzung seiner Methylcellulose Rezept. Die Autoren möchten auch unseren Dank an die Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter der Notre Dame-Zentrum für Zebrafisch Forschung für eine ausgezeichnete laufenden Tierhaltung Betreuung unserer Zebrafisch Kolonie auszudrücken. Mittel aus dem NIH-NIDDK Zuschussvergabe DK083512 und großzügige Labor Anschubfinanzierung von der University of Notre Dame, unterstützt diese Arbeit.

1. Mikroinjektion Verfahren, um die Zebrafisch-Label Vorniere proximalen Tubulus Epithel Für dieses Verfahren verwenden wir eine Mikroinjektion System (Harvard Appartus, PLI90), mit Druckluft durch einen Kompressor (Jun-Air, Modell 6-4), und Mikromanipulator Geräten (Narishege Teile MN151, IP3, und gji) geliefert, die montiert auf einem Stereomikroskop Bahnhof (Nikon, SMZ-Zoom 645) nach den Herstelleranweisungen. Dextran-Konjugate werden leicht durch das Nephron proximalen Tubulus Endozytose, so dass bevorzugte Kennzeichnung dieser epithelialen Zell-Population 9. <ol><li> Die Exposition gegenüber Methylenblau kann akzentuieren die Autofluoreszenz der Dottersack und macht die Visualisierung der Nephron Tubuli erschwert. </li><li> Heben Sie die befruchteten Embryonen bei 28,5 ° C zu einem Entwicklungs-Zeitpunkt zwischen 48-55 Stunden nach der Befruchtung (HPF). Dies ist die ideale Bühne, um Larven microinjections wegen der Leichtigkeit, mit der intramuskulären Mikroinjektion durchgeführt werden durchführen können, und weil die Nierenfunktion beginnt zu diesem Zeitpunkt. </li><li> Entfernen Sie das Chorion von jedem unhatched Zebrafisch mit einer feinen Pinzette. Spülen Sie das Chorion Schutt aus der Petrischale und füllen die Schale mit 30 ml modifizierte E3 Lösung. </li><li> Bereiten Sie eine Injektion Fach für die Embryonen. Unsere bevorzugten Spritzgießwerkzeug ist von 1,5% agarose/E3 gemacht, in dem dreieckigen Vertiefungen gebildet sind, dass der Embryo im Inneren kann zur Injektion positioniert werden. Um das Spritzgießwerkzeug, float wir eine Kunststoff-Form mit keilförmigen Vorsprünge (beschrieben im Detail bisher 11) in einer Petrischale mit einer Grundfläche von 1,5% Agarose gefüllt. </li><li> Bereiten Glas Mikroinjektion Nadeln durch Ziehen Kapillaren mit einer Nadel Abzieher, wie in der Zebrafisch-Buch 10 beschrieben. In kurzen, ziehen Sie den Glaskapillaren dann feinen Metall-Pinzette an der Spitze der Mikroinjektionsnadel geschnitten, um eine Spitze mit einer scharfen Spitze bei der Betrachtung der Nadelspitze unter einem Stereomikroskop. Bewahren Sie den Schnitt Nadeln in einer Petrischale abgedeckt und flach auf Modelliermasse auf der Schnittkante zu schützen und zu verhindern Staubansammlung. </li><li> Vorbereiten der Injektionslösung mit dem proximalen Tubulus-Label. Lösen Sie 40 kD Dextran-Fluorescein-Konjugat (Invitrogen, D1845) bei einer Konzentration von 1 mg / mL in destilliertem Wasser. </li><li> Um die Fische zu betäuben, mit 5 ml 0,2% Tricaine pH 7,0 bis der Petrischale mit dem Zebrafisch-Larven in 30 ml E3. Die Fische werden betäubt, wenn sie zeigen nicht mehr die Touch-Reaktion. Es ist wichtig, dass der Fisch vollständig narkotisiert werden, oder sie werden beim Versuch, sie zu spritzen zucken. </li><li> Übertragen Sie die betäubten Fische ein Spritzgießwerkzeug Tablett mit einem Kunststoff-Transfer-Pipette. Position des Tieres mit dem Kopf in den tiefsten Teil des dreieckigen Depression gut, und auf seiner Seite, so dass der Stamm entlang der abgewinkelten Seite der gut ruhen. </li><li> Führen Sie die intramuskuläre Mikroinjektion. Legen Sie einen Schnitt Nadel mit 2-3 ul von Dextran Fluorescein, und injizieren das Tier in einem Koffer Somiten mit ca. 1 nL Lösung. Ziel für den oberen Teil des Somiten, und vermeiden Sie den Dottersack Erweiterung. Dies gewährleistet, dass das Nephron Tubuli nicht mechanisch durch die Mikroinjektion Prozess gestört. </li><li> Transfer injiziert Zebrafisch, um eine saubere Petrischale und fügen geändert E3 Lösung. Spülen Sie die Tiere 3 mal mit frischen E3, um alle Spuren von Tricaine entfernen. Bedecken Sie den Deckel der Petrischale mit Alufolie, um Licht-Schutz für die Dextran bieten, und kehren die Tiere an die 28 ° C Inkubator über Nacht. </li></ol> 2. Gezielte Laserablation von proximalen Tubuluszellen Für dieses Verfahren, verwenden wir ein Stereomikroskop mit Epifluoreszenz Tiere mit Dextran Fluorescein hell markierten proximalen Tubuli der Gäste und wählen Sie diese für die Laser-Ablation. Dann verwenden wir eine gepulste MicroPoint Lasersystem (Photonic Instruments, Inc.), die zu einem zusammengesetzten Mikroskop (Nikon Eclipse 80i mit epifluoreszenten Attachment) angehängt wurde, und kalibriert für den Einsatz nach den Herstelleranweisungen, um Nephron Zellablation durchzuführen. Wir haben den größten Erfolg in Zellablation mit einem FITC-Filter, dass der Forscher ermöglicht, die fluoreszierende Tubulus Regionen unter Hellfeld-Beleuchtung zu sehen. Im Vorfeld dieses Verfahrens vorzubereiten Immobilisierung Medien für die Ablation durch Auflösen von 1,5% Methylcellulose in 0,02% tricaine/E3. Shop Aliquots von Methylcellulose für den sofortigen Einsatz bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C für eine langfristige Lagerung. <ol><li> Anesthetize der 72 hpf Zebrafisch durch Zugabe von 5 ml 0,2% Tricaine pH 7,0 bis der Petrischale mit dem Zebrafisch-Larven in 30 ml E3. Die Fische werden betäubt, wenn sie zeigen nicht mehr die Touch-Reaktion. Es ist wichtig, dass der Fisch vollständig narkotisiert werden, oder sie werden auf dem Versuch, die Laser-Ablation führen zucken. </li&gt; <li> Untersuchen Sie die injizierten Tiere unter den entsprechenden fluoreszierenden Einstellung und wählen Tieren, bei denen Sie auf einfache Weise kann der proximalen Tubuli. </li><li> Transfer ausgewählter Embryonen in eine separate Schüssel mit Tricaine. Tiere können bis zu 30 Minuten narkotisiert, bevor Zellablation. Wenn Sie&gt; 15 Tiere Punktzahl geben diese in eine separate Schüssel mit frischem geändert E3 in Erwartung Ablation als jede Zelle Ablation dauert einige Minuten. </li><li> Zur Durchführung der Ablation, Transfer ein narkotisierten Zebrafisch zu einer kleinen Petrischale mit 1,5% methylcellulose/0.02% Tricaine für 2 Minuten auf den Embryo in Immobilisierung Medien zu waschen. </li><li> Anschließend Transfer des Embryos zu einem Glas Depression Folie mit einem Rückgang von 1,5% methylcellulose/0.02% Tricaine. Gently Position das Tier mit einer feinen Sonde, dass seine Bauchseite des Schiebers und dorsalen Seite nach oben weist. </li><li> Legen Sie die Folie auf der compund Mikroskoptisch, und konzentrieren sich auf der Rückenseite des Tieres. Führen Ablation des Nephron Zellen unter Fokus durch Drücken des Pedals. Sie werden sehen, Zerstreuung der Fluoreszenz als die renale Epithelzellen abgetragen werden (Abbildung 1A). </li><li> Gently übertragen abgetragen Tier zu einem gut in einer 12-Well-Schale für die spätere Kultivierung. Spülen Sie den E3 2-3 mal abzuwaschen der Methylcellulose. </li><li> Nach der Injektion erhöhen das Tier auf die gewünschte Zeitpunkt und führen gewünschte Analyse nach etablierten histologischen und molekularbiologischen Techniken für junge Zebrafischembryonen (Abbildung 2). </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Die Daten, die in Abbildung 1 dargestellt sind, zeigen die Ablation Zeitverlauf. Nach intramuskulären Injektion mit Dextran-Konjugate, die proximalen Tubulus bevorzugt gekennzeichnet. Die Injektion von Dextran-FITC wurde verwendet, um die Niere für die Laser-Ablation-Label, und abgetragen Tiere wurden mit Dextran-Rhodamin an einem zusätzlichen Zeitpunkt folgende Ablation injiziert, um den proximalen Tubulus Bevölkerung reimage. Expression-Analyse-Techniken wie in-situ-Hybridisierung können Änderungen in festen Proben, die bei einzelnen Zeitpunkten folgenden Zellablation, wie in Abbildung 2 gezeigt, zu analysieren. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1: Laser Ablation wird durch eine schnelle Regeneration des Röhrchens Epithel gefolgt (AC) Zeitverlauf der zellulären Veränderungen während und nach Laser-Ablation von Zebrafischlarve proximalen Tubuli zum Zeitpunkt der Ablation (Tag 3, Teil A), oder einer oder drei. Tage nach der Ablation (Tag 4, Teil B, Tag 7, Teil C). (Top) Schaltpläne zeigen Position des Nephron mit Dextran-FITC (grün) und Dextran-Rhodamin (rot), und (unten) Live-Bilder von Kontroll-und Laser-Ablation (LA) Nephronen. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2:. Analyse der Genexpression nach Laserablation Nach Laserablation am Tag 3 wurden die Embryonen fixiert und durch whole mount in situ Hybridisierung an Transkripten für slc20a1a, die den proximalen Tubulus-Segment des Nephrons Markierung zu erkennen. (A) die Kontrolle Embryos, die nicht auf Laser-Ablation unterzogen wurde, (B) ein Embryo, in denen eine große Strecke des Tubulus Epithel abgetragen wurde und (C) ein Embryo, in denen ein kurzes Intervall von Tubulus Epithel wurde abgetragen. Schwarze Linie zeigt das Ausmaß des proximalen Tubulus in A Referenz darstellen, zeigen blaue Linien das Ausmaß der Laser-Ablation in Platten BC und * zeigt die Steuerung (nicht abgetragen) kontralateralen Nephron in Platten BC.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Zebrafisch ist ein weit verbreitetes Modell-Organismus in vielen Aspekten von Wissenschaft, sind die Anwendungen, von denen immer 6. Der Einsatz des Zebrafisch-Modell-System in der Studie von Nierenerkrankungen wie der AKI hat wichtige Beobachtungen geführt und wird auch weiterhin ein gutes Modell, um Nierenschäden 7,8 studieren. Mit einem Genom, das sequenziert wurde und viele molekulare Protokolle vorhanden, wird es immer einfach zu hoch Zebrafisch-Forschung, dass transgene Modelle, Gen-Knockdown und misexpression Studien nutzt durchzuführen. Der Zebrafisch hat einen kurzen Lebenszyklus mit großen Generation Größen und gut definierten Entwicklungsstadien. Darüber hinaus sind die Zebrafisch-Embryonen und Larven weitgehend transparent, so dass bildgebende Verfahren möglich, ohne Dissektion des Organismus. Während embryonale und Larvenstadien, hat der Zebrafisch ein pronephric Niere von zwei Nephronen, die sichtbar in diesen Entwicklungs-Zeitpunkten bleiben bestehen. Zebrafisch pronephric Nephrone sind analog der Struktur und Funktion, um ihre Kollegen von Säugetieren, so dass es ein gutes Modell für akutes Nierenversagen Studien 4,5. Die Niere ist entscheidend für das Überleben von Menschen und anderen Wirbeltieren, die als das Organ, das dem Körper Flüssigkeit Stoffwechselschlacken reinigt. Dieses reinigende Funktion beruht auf der Fähigkeit der Niere Nephronen, um das Blut filtern, und ändern Sie dann das Filtrat stickstoffhaltigen Abfälle für die Sekretion zu sammeln und gleichzeitig pflegen Flüssigkeits-und Elektrolythaushalt. Nephron sind von einer Blut-Filter-, Epithel-Tubulus, und Drain in einen Kanal zusammen. Die strukturelle und funktionelle Integrität aller drei Teile ist ein integraler Bestandteil Nephron Funktion. Verschiedene Beleidigungen auf die Niere, einschließlich der Exposition gegenüber nephrotoxins, Ischämie oder Verschluss der ableitenden Abfluss Verträge können in AKI 1 Ergebnis. Die Pathologie der AKI wird oft mit akuter tubulärer Nekrose 1,2 verbunden. Klinische Studien haben gezeigt, dass daraus Nierenversagen hat eine Sterblichkeitsrate, die irgendwo im Bereich von 7 bis 80% kann je nach Ursache und Kontext der Niereninsuffizienz. Allerdings ist eine schnelle Diagnose und Umkehr der zugrunde liegende Ursache der AKI zunehmend mit Rückgewinnung über die Regeneration der nekrotischen Nephron Tubuli assoziiert. Aktuelle Schicksal Mapping-Studien haben gezeigt, dass die großen Zellpopulation, die beschädigt Nephron Tubuli füllt Epithelzellen, die von benachbarten, unverletzten Bereichen 12 stammen, werden. Diese Erkenntnisse haben nicht die Möglichkeit, dass die renale Stammzellen / Vorläuferzellen können in dem Prozess zu beteiligen eliminiert und unabhängige Berichte lassen vermuten, dass Knochenmark-abgeleiteten Zellen kann zu einer Niereninsuffizienz Regeneration 13 zu fördern. Es ist klar, dass die weitere Untersuchungen erforderlich sind, um besser zu lösen zellulären Quellen der renalen epithelialen Regeneration. Beide Nephron Regeneration und Entwicklung teilen sich die Erscheinung der Schalter in der zellulären Zustand zwischen mesenchymalen und epithelialen Phänotyp. Während Nephron Entwicklung, mesenchymalen Vorläuferzellen in eine stationäre Phänotyp differenzieren, Befestigung an einer Basalmembran, die Tubulusepithel 3 zu bilden. Die Spekulationen Migrationsphänomen von Epithelzellen folgenden akutem Nierenversagen erfordert eine Dedifferenzierung zu einem mesenchymalen Phänotyp. Interessanterweise deuten neuere Studien, dass mesenchymale Zellen in geschädigten Nieren ein Expressionsprofil ähnlich einer mesenchymalen Zellen während der Entwicklung 14 weisen. Verschiedene Berichte wurden Änderungen in Zelladhäsionsmoleküle, Matrixproteine, Cytokine und Chemokine entdeckt. Nach der geplanten mesenchymalen zu epithelialen Übergangs-Zellen auf einer Basalmembran wieder zusammenbauen und reinitiate tubulären Epithelzellen Aktivitäten. Bestimmen die Gene wichtig in diesem Prozess weiterhin ein Thema der Forschung für unser Labor und andere. Ein Großteil der Arbeit auf die wichtigsten Faktoren in diesem Prozess klären bleibt noch zu tun, aber deutliche Fortschritte auf dem Gebiet wurde durch die Untersuchung der Auswirkungen von Gentamicin angekündigt worden. AKI und Nierenversagen durch Gentamicin verursacht wird relevant in Anbetracht der Prävalenz von nephrotoxischen Verbindungen in der Medizin 15 verwendet. Wird als eine Behandlung für gram-negative bakterielle Infektionen, führt die Verwaltung von Aminoglykosiden zu akuten Verletzungen in 10-25% der Fälle. Das Medikament führt zu einer Fülle von negativen zelluläre Effekte zusammen was in Apoptose oder Nekrose in vielen Tubuluszellen. Studien haben das Medikament bevorzugt an ein komplexes durch Megalin und cubulin, dass in der Endozytose beteiligt ist gebildet gefunden. Diese Moleküle sind in Hülle und Fülle in den Epithelzellen des proximalen Tubulus gefunden, obwohl sie nicht darauf beschränkt, um die Expression in diesen Zellen sind. Durch zelluläre Signalwege führt die Induktion von oxidativem Stress, Freisetzung von Vasokonstriktoren, die Erschöpfung des zellulären ATP, Hypoxie, Hemmung der Phospholipasen bewirken Gentamicin und ähnliche AntibiotikaApoptose und Nekrose in Epithelzellen. Darüber hinaus auslösen Antibiotika mesangialen Kontraktion im Nephron Blutfilter (Glomerulus), was zu einem Abfall der glomerulären Filtrationsrate und negativ verändern die Fähigkeit der Niere in den Blutkreislauf zu filtern. Die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, immunstimulierende Moleküle, und die Aktivierung von Phospholipasen haben diffuse Effekte in das Nephron, die Schaffung eines katastrophalen Pathologie, die zu akutem Nierenversagen führt. Während Gentamicin und ähnliche Antibiotika Studien wurden und werden auch weiterhin wichtige Werkzeuge für die Nieren Regeneration Forschung, fehlt es ihnen an einer Präzision, die nützlich für die Behebung bestimmter Fragen können. Unser System für die Verwendung der Zebrafisch in Verbindung mit einem Laser-Ablation-Verfahren in diesem Protokoll beschriebenen Antworten die Notwendigkeit einer solchen präzisen Recherche-Tool. Laser-Ablation können die Forscher Zellzerstörung in Schwerpunkte der Nierentubuli zu induzieren, die von einem kleinen (2-3) bis groß (&gt; 50-100) Populationen, mit unerreichter Präzision. In diesem Protokoll, nutzen wir eine zuvor entwickelte Methode der Exposition gegenüber Dextran-Konjugate bevorzugt Label proximalen Tubulus epithelialen Populationen. Alternativ könnte transgenen Zebrafisch Linien, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren in einer oder mehreren Regionen des Röhrchens verwendet werden. Zum Beispiel, cadherin17: Ausstellung eGFP transgenen Zebrafisch starke Fluoreszenz im distalen Tubulus Regionen (obwohl schwach in proximalen Populationen) und könnte wertvoll sein für das Studium der Regeneration in anderen Tubulus Segmente 16. Die Sichtbarkeit des Nephron ermöglicht Zeitraffer-Video-Aufzeichnung von zellulären Veränderungen über die Zeit. Wenn es mit der Genexpression Studien wie whole mount in situ Hybridisierung oder Immunhistochemie gekoppelt, können die Forscher molekulare Veränderungen in das Nephron im Laufe der Zeit zu erkennen. Zusammen genommen können solche Strategien zu beginnen, um ein dynamischeres Verständnis der Ereignisse, die bei Nieren-Epithelzellen zerstört werden transpire formulieren. Die großen Vorbehalt unserer Laser-Ablation-Modell ist, dass sie Teilaspekte der physiologischen Bedingungen, die im menschlichen AKI transpire rekapitulieren. Der Zelltod durch sofortige physische Schädigung induzierte unterscheidet sich von der Kaskade von Ereignissen, die zur Nekrose führt in den Zellen, und als solche die humoralen Faktoren in den verschiedenen Mikroumgebungen dürfen nicht identisch sein. Darüber hinaus gibt es Beweise für Apoptose bei Nierenversagen induziert wird, und es ist nicht bekannt, ob solche Folgen nach Beleidigung transpire mit einem Laser. Aber ebenso, wie der Zellkultur ist ein Werkzeug, bessere Antworten auf einige Fragen, die ein sehr kontrollierter Umgebung erfordern, Laser-Ablation wird als hoch in-vivo-Modell des AKI gesteuert dienen. Als solcher sammelte die Erkenntnisse aus Nierenepithelzellen Ablation Studien im Zebrafisch wird wahrscheinlich zu fördern Entdeckung der fundamentalen Erkenntnisse, die auf Untersuchungen von anderen renalen Verletzungen angewendet werden und können potenziell genutzt werden, um eine bessere Diagnostik in den Menschen zu schaffen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Embryo Gerichte </td><td> Falke </td><td> 35-1005 </td></tr><tr><td> Dissektionszangen </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Injektionsnadeln </td><td> Sutter Intruments </td><td> BF100-50 bis 10 </td></tr><tr><td> Ultrapure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 40 Kilodalton (kD) Dextran-Fluorescein </td><td> Invitrogen </td><td> D1845 </td></tr><tr><td> Plastic Transfer-Pipette </td><td> Samco Scientific, Fisher </td><td> 204, 13-711-23 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> Sigma </td><td> M0262 </td></tr><tr><td> Depression schieben </td><td> Fischer </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> 12-well Schale </td><td> Corning </td><td> 3512 </td></tr></tbody></table>

laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration

Akute Nierenschädigung (AKI) ist durch eine hohe Sterblichkeitsrate von einer Verschlechterung der Nierenfunktion über einen Zeitraum von Stunden oder Tagen, bei Nieren-Fehler 1 gipfelt aus. AKI kann durch eine Reihe von Faktoren, einschließlich Ischämie, medikamentöse Toxizität oder obstruktiver Körperverletzung 1 verursacht werden. Dies führt zu einer Unfähigkeit, Flüssigkeits-und Elektrolyt-Homöostase aufrecht zu erhalten. Während AKI ist seit Jahrzehnten beobachtet, über wirksame klinische Therapien erst noch entwickelt werden. Interessanterweise wieder einige Patienten mit AKI Nierenfunktion im Laufe der Zeit, eine mysteriöse Phänomen, das nur ansatzweise hat 1,2 charakterisiert. Forschung mit Säugetieren Modelle der AKI hat gezeigt, dass ischämische oder Nephrotoxin-verletzten Nieren Epithelzelle Todeserfahrung in Nephron Tubuli 1,2, die funktionellen Einheiten der Niere, die sich aus einer Reihe von spezialisierten Regionen (Segmente) der epithelialen Zelltypen 3 sind gemacht . Innerhalb Nephrone ist epithelialen Zelltod höchsten in proximalen Tubuluszellen. Es gibt Hinweise darauf, dass Zellzerstörung durch Dedifferenzierung, Proliferation und Migration von umgebenden Epithelzellen, die das Nephron regenerieren kann ganz 1,2 befolgt wird suggeriert. Allerdings gibt es viele unbeantwortete Fragen über die Mechanismen der renalen epithelialen Regeneration, angefangen von den Signalen, die diese Ereignisse modulieren, die Gründe für die breite Variation der Fähigkeiten von Mensch zu Mensch verletzt Nieren regenerieren. Die Larven Zebrafisch bietet ein hervorragendes Modell, um Nieren Epithelregeneration Studie als pronephric Niere Nephronen, dass bei höheren Wirbeltieren, einschließlich Säugetieren 4,5 konserviert sind zusammengesetzt ist. Die Nephrone mit Zebrabärblingembryonen visualisiert werden können mit der Fluoreszenz-Techniken wegen der relativen Transparenz des jungen Zebrafisch 6. Dies bietet eine einzigartige Gelegenheit, Bildzelle und molekularen Veränderungen in Echtzeit, im Gegensatz zu Säugetieren Modelle, bei denen Nephrone sind unzugänglich, weil die Nieren strukturell komplexen Systemen innerhalb des Tieres internalisiert werden. Jüngste Studien haben das Aminoglykosid Gentamycin als toxische Erreger für das Studium der AKI und anschließende Nierenversagen eingesetzt: Gentamicin und andere Antibiotika haben gezeigt, dass AKI beim Menschen verursachen, und Forscher haben Methoden entwickelt, um dieses Anbieters nutzen, um Nierenschäden im Zebrafisch 7 auslösen , 8. Allerdings sind die Effekte von Aminoglykosid-Toxizität in Zebrafisch-Larven katastrophal und tödlich, die eine Schwierigkeit stellt bei der Untersuchung epithelialen Regeneration und Funktion im Laufe der Zeit. Unsere Methode stellt der Einsatz von gezielten Zellablation als neuartiges Werkzeug für die Untersuchung von epithelialen Verletzungen im Zebrafisch. Laser-Ablation gibt Forschern die Möglichkeit, den Zelltod in einer begrenzten Population von Zellen zu induzieren. Unterschiedliche Bereiche der Zellen können auf der Basis morphologischer Standort, Funktion, oder sogar die Expression eines bestimmten zellulären Phänotyp ausgerichtet sein. So werden Laser-Ablation Erhöhung der Spezifität von dem, was Forscher studieren können, und kann ein leistungsstarker neuer Ansatz, um Licht auf die Mechanismen der renalen Epithelregeneration vergossen werden. Dieses Protokoll kann im Großen und Ganzen angewendet werden, um Zellpopulationen in anderen Organen im Zebrafisch-Embryos, um Verletzungen und Regeneration in einer beliebigen Anzahl von Zusammenhängen von Interesse Studie Ziel.

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Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Akute Nierenschädigung (AKI) in den Menschen ist ein bekanntes klinisches Problem durch eine Schädigung der Epithelzellen, die Nieren Nephrone umfassen verursacht und AKI ist mit hohen Sterblichkeitsraten von 50-70% 1 verbunden. Nach epithelialen Zell-Zerstörung, haben Nephronen eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration, obwohl die Mechanismen und Einschränkungen, die dieses Phänomen Führung schlecht bleiben verstanden. In diesem Video-Beitrag beschreiben wir unsere Technik für die gezielte Laser-Ablation von Nieren Nephron Zellen in der Zebrafisch-Embryos Niere oder Vorniere. Unsere neue Methode kann verwendet werden, um Nephrotoxizität-induzierte Modelle der AKI ergänzen und gewinnen Sie einen hochauflösenden Verständnis der Zell-und molekulare Veränderungen, die mit Epithelregeneration in der Niere Nephron verbunden sind.

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

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Biology

15.2K Aufrufe.  University of Notre Dame. Akute Nierenschädigung (AKI) in den Menschen ist ein bekanntes klinisches Problem durch eine Schädigung der Epithelzellen, die Nieren Nephrone umfassen verursacht und AKI ist mit hohen Sterblichkeitsraten von 50-70% 1 verbunden. Nach epithelialen Zell-Zerstörung, haben Nephronen eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration, obwohl die Mechanismen und Einschränkungen, die dieses Phänomen Führung schlecht bleiben verstanden. In diesem Video-Beitrag beschreiben wir unser...

Serie: Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Murine Renal Transplantation

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Methoden zur Untersuchung des Zebrafisch Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Mit der optokinetischen Reaktion auf visuelle Funktion des Zebrafisch-Studie

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

Anwendung von Retinsäure zu Osteozyten Kulturen aus primären Maus-Osteoblasten erhalten

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both endogenous and exogenous sources such as metabolic activities or UV radiation. Without DNA repair, the cell's genetic code becomes compromised, undermining the structures and functions of proteins and potentially causing disease. 
Understanding the spatiotemporal dynamics of the different DNA repair pathways in various cell cycle phases is crucial in the field of DNA damage repair. Current fluorescent microscopy techniques provide great tools to measure the recruitment kinetics of different repair proteins after DNA damage induction. DNA synthesis during the S phase of the cell cycle is a peculiar point in cell fate regarding DNA repair. It provides a unique window to screen the entire genome for mistakes. At the same time, DNA synthesis errors also pose a threat to DNA integrity that is not encountered in non-dividing cells. Therefore, DNA repair processes differ significantly in S phase as compared to other phases of the cell cycle, and those differences are poorly understood. 
The following protocol describes the preparation of cell lines and the measurement of dynamics of DNA repair proteins in S phase at locally induced DNA damage sites, using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Tagged PCNA (with mPlum) is used as a cell cycle marker combined with an AcGFP-labeled repair protein of interest (i.e., EXO1b) to measure the DNA damage recruitment in S phase.

This protocol describes a non-invasive method to efficiently identify S-phase cells for downstream microscopy studies, such as measuring DNA repair protein recruitment by laser micro-irradiation.

Laser-Mikrobestrahlung zur Untersuchung der DNA-Rekrutierung während der S-Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Nitroreduktase/Metronidazol-vermittelte Ablation und eine MATLAB-Plattform (RpEGEN) zur Untersuchung der Regeneration des Zebrafisch-Netzhautpigmentepithels

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...