Dieses Protokoll hilft, die räumliche und zeitliche Rekrutierung von DNA-Schadensreparaturproteinen unter Berücksichtigung der Zellzyklusphase zu verstehen. Zur Zellzyklusunterscheidung verwenden wir fluoreszierendes Protein-markiertes PCNA als Marker der S-Phase, die Artefakte umgeht, die durch andere Zellzyklus-Synchronisationsmethoden eingeführt wurden. Dies in Kombination mit laserbasierter Mikrobestrahlung ergibt eine beispiellose räumlich-zeitliche Auflösung der Proteinkinetik von DNA-Schäden.
Die erfolgreiche routinemäßige Anwendung unseres Protokolls baut auf Grundkenntnissen der konfokalen Bildgebung auf. 24 Stunden vor der Mikrobestrahlung insgesamt acht mal 10 bis zur vierten Zellen in 500 Mikrolitern zu einem Milliliter Medium auf einem Vier-Brunnen-Deckglas plattieren. Tauschen Sie eine Stunde vor der Mikrobestrahlung das reguläre Wachstumsmedium mit einem Bildmedium aus, das entweder Olaparib oder eine Fahrzeugkontrolle wie DMSO enthält.
Schalten Sie mindestens vier Stunden vor der Bildgebung die Umweltkammer und die Mikroskopkomponenten ein. Schalten Sie die Heizung, die Kohlendioxidversorgung und den Feuchtigkeitsregler ein. Initialisieren Sie Lichtquellen zusammen mit den Laserlinien mindestens eine Stunde, bevor Sie die Zellen auf das Mikroskop übertragen.
Ölen Sie das Mikroskopobjektiv und legen Sie ein Kammerdeckglas unter das Mikroskop. Um S-Phasenzellen in einer asynchronen Population auszuwählen, suchen Sie durch das Okular nach dem einzigartigen Lokalisierungsmuster der mPlum-markierten PCNA in der S-Phase und wählen Sie ein Sichtfeld aus, das genügend S-Phasenzellen für die Mikrobestrahlung aufweist. Legen Sie den für die Mikrobestrahlung interessanten Bereich fest, indem Sie die zugehörige Software zum Einfügen von Binärlinien verwenden.
Um die gewünschte Anzahl von Linien und Abständen festzulegen, klicken Sie auf binär, wählen Sie dann Linie, Kreis und Ellipse einfügen, um die gewünschte Anzahl von Linien zu zeichnen, konvertieren Sie diese binären Linien in Stimulations-ROIs, indem Sie auf ROI klicken, verschieben Sie binär zu ROI, klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf einen der ROIs und wählen Sie als Stimulations-ROI S1 verwenden. Platzieren Sie diese Linien im Sichtfeld, so dass sie durch den Zellkern gehen. Um PCNA-Herde für eine spätere Analyse zu identifizieren, nehmen Sie vor der Mikrobestrahlung ein höher aufgelöstes Bild des Sichtfeldes auf, indem Sie die erforderlichen Parameter in der kompakten A1 LFOV-GUI und den A1 LFOV-Scanbereichsfenstern einstellen, gefolgt von einem Drücken der Erfassungstaste. Um die Mikrobestrahlung einzurichten, öffnen Sie die Registerkarte ND-Stimulation und greifen Sie dann auf das Zeitplanfenster zu, um eine Reihe von Bildern vor der Stimulation und dann eine Reihe von Bildern nach der Stimulation mit den Galvano-Scannern zu erfassen.
Richten Sie drei Phasen im Zeitplanfenster ein. Wählen Sie in der Erfassungs- und Stimulationsspalte Die Option Erfassung, Stimulation und Erfassung für die drei Phasen aus. Legen Sie für die Stimulationsphase S1 als ROI fest.
Stellen Sie im Galvano XY-Fenster 100% Laserleistung für die 405 Nanometer Laserlinie ein und stellen Sie die Verweilzeit für die Mikrobestrahlung ein. Um timelapse imaging für das gewünschte Zeitfenster und die gewünschten Intervalle einzurichten, verwenden Sie den Zeitplan A1 LFOV compact GUI und die A1 LFOV Scanbereichsfenster. Optimieren Sie die Einstellungen für Prozentsatz, Verstärkung und Offset der Laserleistung, um das Bleichen von Fotos während der Bildgebung im kompakten GUI-Fenster von A1 LFOV zu reduzieren.
Verlängern oder verkürzen Sie je nach Kinetik des Proteins das Intervall zwischen den Bildern oder die Dauer des gesamten Zeitraffers, indem Sie das gewünschte Intervall und die gewünschte Dauer für die dritte Phasenerfassungsreihe im Zeitplanfenster einstellen. Drücken Sie jetzt Ausführen, um die Mikrobestrahlung und die anschließende Zeitrafferbildgebung auszuführen. Speichern Sie am Ende der Zeitraffer-Bildgebung die Stimulations-ROIs als separate Bilder, die für die Identifizierung der Koordinaten der Mikrobestrahlung in jeder nachgeschalteten Software, die für die Analyse verwendet wird, nützlich sind.
PCNA hat eine völlig homogene Verteilung im Kern in G1- und G2-Phasen. In der S-Phase lokalisiert PCNA an Stellen der DNA-Replikation, die als helle Flecken im Zellkern visualisiert werden können. In frühen S-Phasenzellen sind die Flecken relativ klein und gleichmäßig im Zellkern verteilt.
Während des Fortschreitens in die mittlere S-Phase verschwimmen die Flecken und lokalisieren sich mehr in Richtung des Umfangs des Kerns und der Nukleoli. In der späten S-Phase verringern sich die Flecken in der Anzahl, werden aber immer größer, da sich PCNA an späten Replikationsstandorten konzentriert. Niedrige Energiedosen, wie 1.000 Mikrosekunden Verweilzeit, induzieren nicht die Rekrutierung von EGFP-FBXL10, einem doppelsträngigen Break-Responder, sondern reichen aus, um die Rekrutierung von NTHL1-mCherry zu induzieren, einem Basenexzisionsreparaturwegprotein, das an Stellen oxidativer DNA-Schäden rekrutiert wird.
Bei einer Verweilzeit von 3.000 Mikrosekunden werden sowohl EGFP-FBXL10 als auch NTHL1-mCherry rekrutiert, was eine Laserleistung demonstriert, die sowohl oxidative Läsionen als auch doppelsträngige Brüche erzeugt. EXO1b erreicht etwa eine Minute lang ein Maximum an Akkumulations- und Mikrobestrahlungsstellen und beginnt sich dann langsam von den DNA-Läsionen zu entknügen. In Gegenwart von Olaparib ist die Akkumulation von EXO1b am Laserstreifen in einer Minute im Vergleich zur Fahrzeugsteuerung deutlich geringer.
Es ist entscheidend, dass dem Mikroskop ausreichend Zeit zum Aufheizen gegeben wird und dass Kultur und Bedingungen für jedes Experiment optimal sind, um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten. Darüber hinaus ist es wichtig, Ihre Lasereinstellungen mit verschiedenen DNA-Schadensreportern zu optimieren, um auf bestimmte DNA-Läsionen zu testen. Erwägen Sie nach der Mikrobestrahlung, die Ergebnisse mit klassischen biochemischen Methoden wie Fraktionierung, Immunpräzipitation oder ChIP zu validieren.
Diese Ansätze beproben eine größere Zellpopulation und liefern so statistische Stärke.
