Der Zebrafisch ist einzigartig in seiner intrinsischen Fähigkeit, viele verschiedene Gewebetypen zu regenerieren, einschließlich des RPE. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um molekulare Signalwege zu identifizieren, die die RPE-Regeneration und RPE-Krankheitsmechanismen antreiben. Vielseitigkeit ist ein Hauptvorteil dieser Methodik.
Neben der Untersuchung der RPE-Regeneration kann dieses Protokoll verwendet werden, um degenerative RPE-Prozesse und die Auswirkungen von RPE-Schäden auf benachbarte Gewebe im Auge zu untersuchen. Säugetiere, einschließlich Menschen, sind nicht in der Lage, große RPE-Verletzungen zu reparieren, die auf Traumata oder degenerative Erkrankungen zurückzuführen sind. Die Verwendung von Zebrafischen als Werkzeug zur Entdeckung von RPE-pro-regenerativen Faktoren ist ein wichtiger Schritt zur Förderung der RPE-Regeneration von Säugetieren.
Um eine frische 10-millimolare MTZ-Lösung fünf Tage nach der Düngung herzustellen, fügen Sie MTZ-Pulver zu Systemwasser ohne PTU hinzu und mischen Sie gründlich durch kräftiges Schütteln für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. 10 Millimolar MTZ-Lösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Tischrotator oder -schüttler abkühlen. Um Zebrafischlarven aus dem rpe65a:nsfB-eGFP-Transgen zu screenen, trennen Sie transgene eGFP-positive Larven mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop mit einem 488-Nanometer-Anregungslaser von nicht-transgenen eGFP-negativen Larven.
Wake Screened Larven sofort durch Pipettieren direkt in eine Petrischale mit frischem 1,5X PTU ohne Tricain. Nach Abschluss des Screenings trennen Sie die eGFP-positiven Larven weiter in zwei Gruppen von Petrischalen auf, eine Gruppe, die eine MTZ-Behandlung erhält, und eine Gruppe, die die unverminderte Kontrolle darstellt. Dann das retinale Pigmentepithel abtragen, indem Sie 1,5X PTU aus den abgetragenen Behandlungsschalen entfernen und die frisch hergestellte 10-Millimolar-MTZ-Lösung hinzufügen.
Entfernen Sie auch 1,5X PTU aus den unverminderten Kontrollschalen und fügen Sie frisches Systemwasser ohne PTU hinzu. Entfernen Sie die 10-millimolare MTZ-Lösung nach genau 24 Stunden und fügen Sie frisches Systemwasser ohne PTU hinzu. Wechseln Sie das frische Systemwasser ohne PTU auf den MTZ-Negativschalen.
Screenen Sie eGFP-positive Larven an vier Tagen nach der Befruchtung. Das eGFP ist vier Tage nach der Befruchtung sichtbar, erscheint aber am fünften Tag dunkler als die Signalintensität. Geben Sie eGFP-positive Larven in Six-Well-Platten anstelle von Petrischalen mit einer Dichte von nicht mehr als 10 Larven pro Well für die pharmakologische Behandlung.
Bezeichnen Sie separate Sechs-Well-Platten für abgetragene und unablierte Larven. Bestimmen Sie das Volumen von 15 mikromolaren IWR-1- oder volumenangepassten DMSO-Fahrzeugsteuerungsvorbehandlungen und aliquotieren Sie 1,5-fache PTU entsprechend in konische Röhrchen. IWR-1-Material zu 1,5-facher PTU hinzufügen, um eine Endkonzentration von 15 Mikromolar IWR-1 zu erhalten.
Fügen Sie ein passendes DMSO-Volumen zu 1,5-facher PTU hinzu. Mischen Sie gut durch Vortexing und bestätigen Sie visuell die Auflösung von Verbindungen. Entfernen Sie 1,5-fache PTU aus den eGFP-positiven Larven in Sechs-Well-Platten und fügen Sie fünf Milliliter pro Vertiefung frisch hergestellte 0,06% DMSO- oder 15 mikromolare IWR-1-Behandlungen hinzu.
Setzen Sie die RPE am nächsten Tag ab. Bestimmen Sie fünf Tage nach der Befruchtung das Volumen der pharmakologischen und Vehikelkontrollbehandlungen, die sowohl für unablierte als auch für abgetragene Sechs-Well-Platten erforderlich sind, und aliquot geeignete Mengen an Frischwasser ohne PTU oder 10-Millimol-MTZ-Lösung in konische Röhrchen. Fügen Sie IWR-1- und DMSO-Lagerlösungen zu den jeweiligen konischen Rohren hinzu, wie zuvor durchgeführt.
Mischen Sie gut durch Vortexing und bestätigen Sie visuell die Auflösung von Verbindungen. Entfernen Sie 0,06% DMSO- und 15 mikromolare IWR-1-Vorbehandlungen in 1,5-facher PTU von ausgewiesenen unablierten und abgetragenen Sechs-Well-Platten. Nachfüllen mit dem entsprechenden Frischwasser ohne PTU- und MTZ-Lösungsbehandlungen.
Entfernen Sie 0,06% DMSO- und 15 mikromolare IWR-1-Behandlungen in 10-millimolärer MTZ-Lösung nach genau 24 Stunden und füllen Sie sie mit Behandlungen in frischem Systemwasser ohne PTU auf. Füllen Sie 0,06% DMSO- und 15 mikromolare IWR-1-Behandlungen in frischem Systemwasser ohne PTU auf der unverminderten Sechs-Well-Platte auf. Überwachen Sie den Erfolg und das Ausmaß der Ablation in vivo mit Durchlichtbeleuchtung auf einem Stereomikroskop zur Larvenerhaltung nach der genetischen Ablation.
Um die RPE-Region von Interesse oder ROI mit Fidschi zu generieren, öffnen Sie ein acht-Bit-TIFF-Bild, richten Sie das Bild neu aus, so dass die dorsale Seite oben und distal bleibt, indem Sie Bild, Transformation und horizontales Spiegeln auswählen. Wählen Sie für den letzten Befehl die Option aus, die der für dieses Bild erforderlichen Direktionalität am besten entspricht. Starten Sie den ROI-Manager, indem Sie Analyse, Tools, ROI-Manager auswählen.
Verwenden Sie Bild, Zoom und Umschalten zwischen den DAPI- und Brightfield-Kanälen. Verwenden Sie Tastenkombinationen für Effizienz. Identifizieren Sie den Punkt, an dem die apikale Seite des RPE an die Spitze der äußeren Grenzmembran angrenzt, und verwenden Sie diesen anatomischen Meilenstein als ROI-Ausgangspunkt.
Erstellen Sie den RPE-ROI mit dem Polygonauswahlwerkzeug in der Fidschi-Symbolleiste unter Verwendung der DAPI- und Hellfeld-Bildkanäle sowie der Bildzoomfunktion, um apikale und basale RPE-Grenzen zu identifizieren. Bringen Sie die dorsalen und ventralen Enden des ROI auf einen scharfen Punkt, anstatt abzustumpfen oder abzurunden. Fügen Sie den ROI hinzu, indem Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen klicken.
Speichern Sie die ROI-Datei, indem Sie mehr auswählen, und speichern Sie sie im ROI-Manager. Doppelklicken Sie auf den rpegen. M-Datei zum Öffnen im Editorbereich.
Unter dem benutzerdefinierten Variablenabschnitt des rpegen. m-Datei, geben Sie die Verzeichnisspeicherorte für Ordner ein, die die ROI-Dateien, die TIFF-Image-Dateien enthalten und wo Ausgabedateien gespeichert werden sollen. Geben Sie den Gruppennamen für die zu exportierende MAT-Datei und die Position des Brightfield-Kanals im TIFF-Bildstapel ein.
Führen Sie das Skript aus, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen im Editormenü oben in MATLAB klicken. Nach dem Speichern der MAT-Datei erscheint eine Drei-Panel-Figur und wird auch als PDF im Ausgabeverzeichnis für jeden Bildlauf gespeichert. Warten Sie, bis diese Qualitätskontroll-PDFs im Ausgabeordner gespeichert wurden und die letzte Abbildung verschwunden ist.
Öffnen Sie die einzelnen PDFs und überprüfen Sie, ob alle ROIs mit den Brightfield-Bildern übereinstimmen. Doppelklicken Sie auf die rpegen_permplot. M-Datei zum Öffnen in einem neuen Editor-Tab.
Geben Sie im Abschnitt Ein-Benutzerdefinierte Variablen den Verzeichnisspeicherort für den Ausgabeordner ein, der die MAT-Dateien aus der Ausführung des rpegen enthält. m Skript. Geben Sie jeden zu ladenden MAT-Dateinamen ein.
Führen Sie diesen Abschnitt des Skripts aus, indem Sie im Editormenü auf die Schaltfläche Abschnitt ausführen klicken. Geben Sie in Abschnitt zwei die Namen der beiden Gruppen für einen statistischen Vergleich in die Variablen Daten A und Daten B ein und geben Sie die Anzahl der Wiederholungen der Permutationssimulation in der Variablen reps an. Für diese Demo wurden nur 2.000 Wiederholungen verwendet, um die Verarbeitungszeit zu verkürzen.
Führen Sie diesen Abschnitt des Skripts aus, indem Sie im Editormenü auf die Schaltfläche Abschnitt ausführen klicken. Führen Sie Heatmap-Figuren- und Gruppenergebnisse sowie P-Wert-Abschnitte mithilfe der Schaltfläche Abschnitt ausführen unabhängig voneinander aus. Der gesamte Mount-Schaden einer fünftägigen Larve nach der Befruchtung zeigte zum Zeitpunkt des Screenings auf genetische Ablation eine helle Transgenexpression im RPE.
Die transversale Kryosektion einer unablierten Sechs-Tage-Larve nach der Befruchtung zeigte, dass die Transgenexpression auf reife RPE-Zellen beschränkt war, wobei die hellste Expression auf die zentralen 2/3 der RPE beschränkt war. Pfeilspitzen zeigen apikale Mikrovilli an. Die transversale Kryosektion einer abgetragenen Larve eines Tages nach der Verletzung ergab eine Störung der eGFP-positiven Zellmorphologie.
Pfeile zeigen pyknotische Kerne an. Ganze Mount-Schäden von unverminderten siebentägigen Larven nach der Befruchtung zeigten RPE-Pigmentierung im ganzen Auge und abgetragene Larven zwei Tage nach der Verletzung zeigten eine Ablationszone ohne Pigment im zentralen RPE. Ein mit RpEGEN erstelltes Diagramm zeigte Ähnlichkeiten zwischen den unverminderten DMSO- und IWR-1-Gruppen nach der Befruchtung über die gesamte Länge des RPE.
Die Handlung zeigte eine insgesamt hellere Pixelintensität in den abgetragenen DMSO- und IWR-1-Gruppen nach der Verletzung, die im Vergleich zu jeder anderen Behandlungsgruppe in der abgetragenen IWR-1 am leichtesten erschien. Unterschiede in der zentralen RPE-Pigmentierung waren signifikant, wenn ablatierte IWR-1-behandelte Larven mit ablatierten DMSO-behandelten Kontrollen verglichen wurden. Mit diesem Zebrafisch-Ablationsparadigma konnten wir mehrere molekulare Signalwege identifizieren, wie z.B. die Windsignalisierung, die wir hier gezeigt haben und die kritische Regulatoren der RPE-Regeneration sind.
