Und von der Charles H. Hood Foundation Young Investigator Child Health Research Award (Boston, MA) - Diese Arbeit wurde teilweise durch die Reproduktionsmedizin Abteilung der National Institute of Child Health and Human Development (R21 HD059015 NICHD) finanziert.

1. Die ortsspezifische Mutagenese von hoch GC-reiche KISS1R Gensequenz <ol><li> Vorlage: volle cDNA-Sequenz des menschlichen KISS1R mit einem Myc-tag fusioniert an seinem N-Terminus. Diese Sequenz wird in die pCS2 + Expressionsvektor, der kompatibel mit dem Säugerzelllinien anschließend für Transfektionen verwendet wird geklont. Dieser Expressionsvektor wird hier als pCS2 + Myc KISS1R bezeichnet. </li><li> Primer-Design: Primer sind so konzipiert, gewünschten Mutationen tragen, nach den Anweisungen des Quikchange ortsspezifische Mutagenese-Kit (Stratagene). Zusammengefasst: <ul><li> Beide (vorwärts und rückwärts) Primer müssen die gewünschte Mutation und Glühen auf der gleichen Reihenfolge auf gegenüberliegenden Strängen des Plasmids (zB Vorwärts-und Rückwärts-Primer sind komplementär zueinander) <img src="/files/ftp_upload/2897/step1.jpg" alt="Schritt 1" /></li><li> Grundierungen sollten 25 bis 45 Basen lang und am Ende in einem oder mehreren C-oder G-Basen <img src="/files/ftp_upload/2897/step2.jpg" alt="Schritt 2" /> <img src="files/ftp_upload/2897/step3.jpg" alt="Schritt 3" /></li><li> Eingeführt Mutation (en) sollte in der Mitte der Primer und flankiert von ~ 10-15 Grundlagen der richtigen Reihenfolge auf beiden Seiten </li><li> Schmelztemperatur (Tm) der Primer sollte gleich oder größer als 78 ° C. Verwenden Sie die folgenden Formeln, um Tm Schätzung: <ul><li> Bei der Einführung von Mutationen: Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N -% mismatch (N ist die Grundierung Länge in Basen) </li><li> Bei der Einführung von Insertionen oder Deletionen: Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N (N umfasst nicht die Basen, die als eingefügt oder gelöscht werden) </li><li> Verwenden Sie entsalzt Primer (keine weiteren Reinigungen notwendig). <img src="/files/ftp_upload/2897/step4.jpg" alt="Schritt 4" /></li></ul></li></ul></li><li> Die beste Verstärkung Bedingungen umfassen die Zugabe von PCRx Enhancer-Lösung (Invitrogen) und DMSO. Mindestens 2-Konzentrationen von DMSO, wie z. B. 4% und 8% liegt, sollte geprüft werden. Und Ergebnisse einer repräsentativen PCR-Amplifikation von pCS2 + MycKISS1R in Abbildung 2 dargestellt ist; PCR-Bedingungen sind in Tabelle I und in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Beseitigen Sie die elterliche DNA auf Amplifikationsprodukte durch Verdauung von methylierter DNA mit DpnI für 1h 30min bei 37 ° C: mix in ein Zentrifugenröhrchen 17.5μl von PCR-Produkt mit 2μl 10x NEBuffer 4 und 0.5μl von DpnI (10U, New England Biolabs). </li><li> Mix 2μl der DpnI-behandelten DNA mit 45μl der XL10-Gold Ultracompetent E.: Transform PCR-Produkt DpnI behandelten coli (Stratagene) in vorgekühlte 15 ml Zellkultur Röhre. Add 2μl von β-Mercaptoethanol und folgen Stratagene Anweisungen. Platte 100-400μl der transformierten Bakterien in LB-Agarplatten mit 100μg/ml Ampicillin und bei 37 ° C. </li><li> Miniprep 2 bis 4 einzelne Kolonien zu isolieren Plasmid-DNA. Bestätigen Sie die erfolgreiche Einführung der gewünschten Mutationen durch Sequenzierung und Analyse der isolierten DNA. </li></ol> 2. Transiente Transfektion von MycKISS1R in HEK-293 Zellen <ol><li> Die folgenden Versuche sind in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK-293) in einer CO 2-Inkubator (5% CO 2) bei 37 ° C durchgeführt in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt. </li><li> Seed HEK-293 Zellen in 2.5x10 5 Zellen / ml in 6-Well-Platten und lasse sie wachsen über Nacht bei 37 ° C vor der Transfektion. HINWEIS: (i) Verwendung dreifachen Wells für jede experimentelle Bedingung (ii) ideal Zellkonfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion 30% -50%. </li><li> Transfizieren HEK-293 Zellen unter Verwendung des GenePorter Transfektionsreagenz (Genlantis), nach den Anweisungen des Herstellers: Mix Hälfte des serumfreien DMEM mit 0.5μg pCS2 + MycKISS1R Plus 0.5μg Kontrolle (leer) Vektor summieren 1 g DNA / well. Mix die andere Hälfte mit 10 &amp;mgr; l Transfektionsreagenz pro ug DNA transfiziert. Hinweis: Ideal Plasmid-DNA-Konzentration variieren. </li></ol> 3. Zell-Lyse-Behandlung und <ol><li> 24 Stunden nach der Transfektion ersetzen Zellmedium mit 1 ml DMEM mit 2,5% FBS (den Zellstoffwechsel Abnahme). Hinweis: Dieser Rückgang im Serum kann zu erleichtern und / oder verstärken den Nachweis von Ergebnissen. </li><li> Add Lysosom Inhibitor (100 &amp;mgr; g / Vertiefung Leupeptin) direkt in jede Vertiefung einer gesamten 6-Well-Platte. Bei 37 ° C für 6 oder 16 h (oder anderen gewünschten Zeiten) </li><li> Fügen Sie frisch zubereitete Proteasom-Inhibitor (10 um / Vertiefung MG132) direkt in alle Vertiefungen von zwei ganzen 6-well Platten. Bei 37 ° C für 2, 4, 6 oder 16 Uhr (oder gewünschten Zeiten). Add Fahrzeug in alle Vertiefungen der vierten 6-Well-Platte (0 Zeit-Punkt) und bei 37 ° C für 16h </li><li> Als Inkubationszeit vorbei ist, bewegen Platten zu Eis, und führen Sie diese ganze Lyseverfahren auf Eis zu Proteinabbau zu verhindern: <ul><li> Zur Erhöhung der Ausbeute an Protein, verbinden die dreifach auf 6-well Platten in einer einzigen centrifuge Rohr </li><li> Saugen Sie mittel-und waschen Sie die Zellen einmal mit 1 ml eiskaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) </li><li> Add 100 &amp;mgr; eiskaltem Lysepuffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,25% Natriumdeoxycholat) mit Protease-Inhibitoren (1x Cocktail mit 100 mM AEBSF-HCl, 80 um Aprotinin, 5 mM Bestatin, 1,5 mM E-64, 0,5 M EDTA, 2 mM Leupeptin und 1 mM Pepstatin A, plus 2 mM PMSF) in jede Vertiefung </li><li> Entfernen Sie Zellen mit einem Zellschaber und Transfer Zelllysaten zu Röhren-Zentrifuge </li><li> Pass-Zellen ~ 10 mal durch eine 20-Gauge-Nadel. HINWEIS: Nicht beschallen Proben für Western-Blot-Detektion von Membranproteinen soll. Ultraschallbehandlung führt zur Aggregation von Membranproteinen, die nicht migrieren ordnungsgemäß während der Elektrophorese </li><li> Inkubieren Zelllysaten für 1h bei 4 ° C auf einem Wippschüttler </li><li> Centrifuge Zelllysate bei 4 ° C für 10 min bei 10.000 x rpm und Transfer Überstände auf neue Röhren. HINWEIS: Bitte nicht stören Pellets bei diesem Schritt </li><li> Bestimmen Protein-Konzentration in 10 &amp;mgr; l der Überstände mit dem BCA-Methode (Pierce) </li><li> Verdünnen Lysaten mit Lysepuffer Proteaseinhibitoren 1mg/ml. </li></ul></li></ol> 4. Immunpräzipitation und Western-Blot-Detektion von MycKISS1R <ol><li> Führen Sie die folgenden Schritte Immunpräzipitation auf Eis (oder bei 4 ° C): <ul><li> Waschen Sie die entsprechende Menge an Agarose-konjugierten anti-myc Antikörper (2.5μg / Probe) zweimal mit eiskaltem PBS und stell &#39;das zu 400μg Lysat Protein. </li><li> Immunopräzipitat die MycKISS1R auf Lysate über Nacht bei 4 ° C in einem Schaukelstuhl Plattform unter leichtem Schütteln. </li><li> Spin down Agaroseperlen durch Puls-Zentrifugation bei 4 ° C (bis zu 10.000 x min) </li><li> Absaugen und entsorgen Überständen (ohne Störung des Pellets) </li><li> Wash Perlen einmal mit eiskaltem Lysepuffer und zweimal mit eiskaltem PBS. Invert Röhrchen leicht vor dem Spinnen </li><li> Ressuspend Kügelchen, Antikörper-gebundenen MycKISS1R in 2x Probe Ladepuffer mit 10% β-Mercaptoethanol. </li></ul></li><li> Western-Blot von MycKISS1R Immunkomplexen: <ul><li> Hitze Proben für 30 min bei 37 ° C Hinweis: Nicht kochen Proben für Western-Blot-Detektion von Membranproteinen soll. Wie Beschallung, Kochen führt auch zu Aggregation dieser Proteine </li><li> Bewegen Rohre sofort in Eis für 5 min </li><li> Separate Proteine ​​durch SDS-PAGE in einem 4-15% Gradienten-Gel. </li><li> Transfer zum Immobilon-FL PVDF-Membran (für Infrarot-Detektion) bei 25V für 30 min in Transfer-Puffer (48mm Tris-Base, 39mm Glycin, 1,2 SDS, 20% Methanol, pH 9,2) unter Verwendung des Bio-Rad Semi-Dry Transfer- Apparat </li><li> Wash-Membranen für 5 min bei Raumtemperatur mit Tris-Buffered Saline (TBS) und Block für 1h bei Raumtemperatur mit Licor Odyssey Blocking auf einer schaukelnden Plattform (alternativ 5% Milch in TBS kann verwendet werden, um unspezifische Bindung zu blockieren). </li><li> Inkubieren Membranen über Nacht bei 4 ° C mit Kaninchen-anti-myc-Antikörper (1:500) in Blocking-Lösung mit 0,1% Tween-20 </li><li> Entfernen Primärantikörper und waschen Membranen 3 mal jeweils 5 min mit TBS mit 0,1% Tween-20 (TBST) </li><li> Inkubieren Membranen für 1h bei Raumtemperatur mit Ziegen-Infra-RedDye ® 800CW-markierten Anti-Kaninchen-IgG (1:10000) in Blocking-Puffer mit 0,1% Tween-20 und 0,01% SDS </li><li> Entfernen sekundären Antikörper, sie zu waschen 3 mal jeweils 5 min mit TBST und ein letztes Mal mit TBS nur (zum Löschen verbleibender Tween-20) </li></ul></li><li> Imaging und Quantifizierung von MycKISS1R mit dem LI-COR Odyssey Infra-Red Imager: <ul><li> Die MycKISS1R auf den Membranen wird abgebildet mit dem LI-COR Odyssey Infra-Red Imager werden. Um zu beginnen, statt Membran auf der linken unteren Ecke der Odyssey-Scanner, indem er sie mit dem Netz. Deckel mit der Gummimatte, glätten Blasen mit Walze und schließen Sie den Deckel </li><li> Erstellen Sie eine neue Projekt-Datei auf dem Computer. Benennen Sie die Datei, klicken Sie auf &quot;Fertig&quot;, und geben Sie dann den Scanner Login auf &quot;Scan&quot;. Größe der Scanner-Konsole zu Ihrem Membran passen, und wählen Sie dann 169μm Auflösung und mittlerer Bildqualität </li><li> Wählen Sie die Intensität Einstellungen für 700 (rot) und 800 (grün)-Kanäle entsprechend der erwarteten Stärke der einzelnen Signal. Dies ist für das Signal nur der Visualisierung und wird keinen Einfluss auf die Quantifizierung. Klicken Sie auf &quot;Start scan&quot; </li><li> Benennen und speichern Sie den Scan, klicken Sie dann auf &quot;OK&quot;, um es auf ein neues Fenster für die Quantifizierung zu öffnen. MycKISS1R Monomere sollte bei ca. 43kD sichtbar </li><li> Mit der &quot;Box&quot;-Tool (auf der linken Seitenleiste), zeichnen Sie ein Feld um den ersten Band. Ziehen Sie den Rahmen um sicherzustellen, dass alle Bands passen, dann &quot;Kopieren&quot; und &quot;Einfügen&quot; das Feld über alle Bänder </li><li> Wählen Sie alle Felder mit &quot;Strg + A&quot;, und wählen Sie dann die Option zum Median Hintergrund subtrahieren. Klicken Sie auf &quot;Bericht&quot; in der oberen Menüleiste und eine Tabelle mit der Quantifizierung Werte erscheint. Repräsentative Ergebnisse hier gezeigten represented als über unbehandelten Zellen-facher Anstieg (Zeitpunkt Null) </li></ul></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <ol><li> Die ortsspezifische Mutagenese von hoch GC-reiche KISS1R Gensequenz: Tabelle 1. Zeigt die Kombination von Reagenzien, um die Effizienz der KISS1R Verstärkung zu verbessern. Diese Kombination ist erfolgreich eingesetzt, um mehrere Mutationen gegen verschiedene Regionen der KISS1R cDNA-Sequenz gerichtet ist, sowie für die Verstärkung von diesem hoch GC-rich Gen einzuführen. Abbildung 1 zeigt Radfahren und Verstärkung Bedingungen für die Mutagenese von KISS1R. Diese Bedingungen wurden von der QuikChange ortsspezifische Mutagenese-Kit (Stratagene) geändert worden. Abbildung 2. Zeigt ein repräsentatives Ergebnis mit dieser optimierten Protokoll. Der Zusatz von 4% bzw. 8% DMSO mit dem PCRx Enhancer kombiniert deutlich verbessert Ertrag Verstärkung der GC-reichen KISS1R cDNA-haltigen Plasmid. In dieser repräsentativen Experiment, vorausgesetzt, 4% DMSO etwas besser Amplifikationsbedingungen im Vergleich zu 8% DMSO. Transformation von DpnI behandelten Amplifikationsprodukte mit ultracompetent E. coli typischerweise Erträge von 100 bis über 1.000 Kolonien, und die Rate der erfolgreichen Einführung der gewünschten Mutationen liegt bei 80-90%, wie durch DNA-Sequenzierung bestimmt. </li><li> Verwendung von MycKISS1R Konstrukte Rezeptor Physiologie zu studieren: In dieser repräsentativen Experiment, das Wildtyp-pCS2 + MycKISS1R nach dem optimierten Protokoll hier beschriebene wird verwendet, um in vivo KISS1 Rezeptor Abbau in einem relevanten Zelllinie (HEK-293) transient exprimierenden MycKISS1R Studie verstärkt. Nach der Behandlung der transfizierten HEK-293 Zellen mit Lysosomen (Leupeptin) oder Proteasom (MG132)-Hemmer nach dem Protokoll in Methoden beschrieben, werden die Zellen lysiert und verarbeitet Western-Blot. Die obere Teil der Abbildung 3 zeigt die Untersuchung des MycKISS1R Monomere während der untere Feld zeigt die Quantifizierung der Banden am oberen Bedienfeld angezeigt. Die Quantifizierung der Banden zeigt an, dass weder 6h noch 16h von Leupeptin Behandlung MycKISS1R Protein-Ebene betroffen. Umgekehrt führte die Behandlung mit MG132 in einem zeitabhängigen Anstieg der MycKISS1R Protein in diesen Zellen, die mit einem 45-fachen Anreicherung des Rezeptors nach 16h Inkubation mit MG132 gipfelt. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass anders als die meisten G-Protein gekoppelte Rezeptoren, KISS1R durch das Proteasom degradiert (anstatt das Lysosom) ist. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td> DMSO </td><td></td></tr><tr><td> Reagenzien </td><td> 0 </td><td> 4% </td><td> 8% </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 35 </td><td> 33 </td><td> 31 </td></tr><tr><td> 10x Pfu Ultra-Taq-Puffer </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> dNTP-Mix (10 mM) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer Sinn (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer antisense (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10x PCRx Enhancer Solution </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Pfu Ultra-Taq-Polymerase (2.5U/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plasmid-DNA (20ng/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Kombination von Reagenzien erfolgreich eingesetzt zu mutieren und verstärken die GC-reiche KISS1R <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Radfahren Bedingungen für eine erfolgreiche Mutagenese und Amplifikation von GC-reichen KISS1R: A 2min Warmstart wurde von 18 Zyklen von 30 sec mit einem Schmelzpunkt von 95 ° C, 1 min Annealing bei 55 ° C und 6 min Verlängerung bei 68 ° C. Ein weiterer 10 min Verlängerung bei 68 ° C wurde am Ende des letzten Zyklus aufgenommen. Diese Einstellungen wurden aus dem ursprünglichen Mutagenese Protokoll der QuikChange II XL-Site-Mutagenese-Kit (Stratagene) eingestellt. <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Visualisierung von GC-reichen pCS2 + Myc KISS1R in der Anwesenheit oder Abwesenheit von DMSO verstärkt: Fünf ul Aliquots pCS2 + Myc KISS1R in Gegenwart von 0 verstärkt, 4 oder 8% DMSO wurden in dieser repräsentativen 1% Agarosegel geladen gefärbt mit Ethidiumbromid Bromid und visualisiert mit UV-Licht. Die Plasmid-Bands 6Kb sichtbar auf beiden Fahrspuren mit PCR-Produkten in Gegenwart von 4% verstärkt und 8% DMSO geladen, aber nicht auf der ersten Spur, die mit einer PCR geladenProdukt in der Abwesenheit von DMSO verstärkt. <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Wirkung von Leupeptin oder MG132 über die Höhe der Myc-Protein KISS1R in HEK-293 Zellen: HEK-293 Zellen, die Myc KISS1R wurden mit 100μg/ml Leupeptin oder 10 um MG132 bei 37 ° C für den bestimmten Zeiten. Myc KISS1R auf 400μg Zelllysat wurde mit 2.5μg Agarose-konjugierten anti-myc-Antikörper immunpräzipitiert und mittels Western Blot. (A) LI-COR Odyssey Nachweis von Myc KISS1R nach Inkubation von Immunoblots mit Kaninchen-anti-Myc-tag Antikörper durch Inkubation mit IRDye 800CW-markierten Anti-Kaninchen gefolgt; (B) Quantifizierung von Myc KISS1R Bands in (A) mit dem LI-COR Odyssey Quantifizierung Software. Die Ergebnisse sind dargestellt als über unbehandelten Zellen (Zeitpunkt 0)-facher Anstieg.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die ortsspezifische Mutagenese wurde verwendet, um Protein-Funktion durch die Einführung von Nukleotid-Veränderungen in der kodierenden Sequenz von gezielten Gene für mehr als drei Jahrzehnten zu studieren. Die ursprüngliche Technik wurde 1978 von dem britisch-kanadische Chemiker und Nobelpreisträger Michael Smith 10 beschrieben. Michael Smith gemeinsam die 1993 den Nobelpreis für Chemie mit Kary Mullis, der amerikanische Biochemiker, der die Polymerase Chain Reaction (PCR) 11 erfunden. Die u...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 10x PCRx Enhancer Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase Alternative Reinigungsmittel </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> DPN-I </td><td> New England Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10-Gold Ultracompetent E. coli-Zellen </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10 bis 013-CV </td></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporter Transfektionsreagenz </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor-Cocktail und PMSF </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> Sc-24948 </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td></tr><tr><td> anti-Myc-Tag (Klon 4A6) Agarose-Konjugat </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> 2x Ladepuffer </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Criterion Tris-HCl Fertigteil-Gel, 4-15% Steigung </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon-FL PVDF-Membran </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> Odyssey Blocking Buffer </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> Rabbit anti-myc-Antikörper </td><td> Zelluläre Signale </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> Ziege Anti-Kaninchen-IRDye 800CW </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> Odyssey Imaging Infrared Systems </td><td> LI-COR Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

Die kisspeptin Rezeptor (KISS1R) ist ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor als Auslöser der Pubertät und ein Regulator des reproduktiven Kompetenz im Erwachsenenalter 1,2,3 anerkannt. Inaktivierende Mutationen in KISS1R bei Patienten identifiziert haben mit iodiopathic Hypogonadismus (IHH) 1,2 und vorzeitiger Pubertät 4 wurde verbunden. Funktionelle Untersuchungen dieser Mutanten sind entscheidend für unser Verständnis der Mechanismen der Regulation der Fortpflanzung durch diesen Rezeptor als auch die Gestaltung der Krankheitsverläufe, die sich aus abnormen KISS1R Signalisierung und Funktion. Allerdings macht der hohe GC-reiche Sequenz des Gens KISS1R es ziemlich schwierig zu Mutationen einzuführen oder zu verstärken Gen für diesen Rezeptor durch PCR. Hier beschreiben wir eine Methode, um Mutationen von Interesse in diesem sehr GC-reiche Sequenz, die verwendet wurde erfolgreich zu generieren mehr als ein Dutzend KISS1R Mutanten in unserem Labor einzuführen. Wir haben die PCR-Bedingungen optimiert, um die Verstärkung von einer Reihe von KISS1R Mutanten, die Substitutionen, Deletionen oder Insertionen in der KISS1R Sequenz enthalten erleichtern. Die Zugabe eines PCR-Enhancer-Lösung, sowie ein kleiner Prozentsatz von DMSO wurden besonders hilfreich, um Verstärkung zu verbessern. Dieses optimierte Verfahren kann sinnvoll sein, für andere GC-reiche Templates als auch. Der Expressionsvektor kodiert KISS1R ist benutzt worden, um Signalisierung und Funktion dieses Rezeptors zu charakterisieren, um zu verstehen, wie Mutationen können KISS1R Funktion zu ändern und zu den damit verbundenen reproduktiven Phänotypen. Dementsprechend können mögliche Anwendungen KISS1R Mutanten durch Mutagenese erzeugt durch viele Studien 1,4,5,6,7,8 dargestellt werden. Als Beispiel hat das gain-of-function-Mutation in der KISS1R (Arg386Pro), die mit vorzeitiger Pubertät verbunden ist, gezeigt worden, um die Reaktionsfähigkeit des Rezeptors an Ligand Stimulation 4 sowie zu verlängern, um die Geschwindigkeit des Abbaus von KISS1R 9 verändern . Interessanterweise zeigen unsere Studien, dass KISS1R durch das Proteasom degradiert wird, im Gegensatz zu den klassischen lysosomalen Abbau für die meisten G-Protein gekoppelte Rezeptoren 9 beschrieben entgegen. In dem hier vorgestellten Beispiel wird der Abbau der KISS1R in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK-293) transient exprimierenden Myc-markierten KISS1R (MycKISS1R) untersucht und behandelt mit Proteasom-Inhibitoren oder Lysosom. Zelllysate werden immunpräzipitiert mit einem Agarose-konjugierten anti-myc-Antikörper durch Western-Blot-Analyse. Detektion und Quantifizierung von MycKISS1R auf Blots erfolgt mit dem LI-COR Odyssey Infrarot-System. Dieser Ansatz kann in der Studie der Abbau anderer Proteine ​​von Interesse als auch nützlich.

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Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Mutationen in den kisspeptin Rezeptor (KISS1R) sind mit reproduktiven Störungen bei Patienten assoziiert. Hier beschreiben wir, wie Mutationen der Interesse an der GC-reiche Sequenz von KISS1R sowie die Verwendung von KISS1R Konstrukte einzuführen, um die Abbauweg des Rezeptors durch Immunpräzipitation und Western-Blot charakterisieren

Mutagenese und Analyse von genetischen Mutationen in den GC-reichen KISS1 Rezeptor-Sequenz in Menschen mit Fortpflanzungsstörungen Identified

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Aufrufe.  University of Miami Miller School of Medicine. Mutationen in den kisspeptin Rezeptor (KISS1R) sind mit reproduktiven Störungen bei Patienten assoziiert. Hier beschreiben wir, wie Mutationen der Interesse an der GC-reiche Sequenz von KISS1R sowie die Verwendung von KISS1R Konstrukte einzuführen, um die Abbauweg des Rezeptors durch Immunpräzipitation und Western-Blot charakterisieren

Serie: Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...